專利名稱：：通過trem-1的炎癥治療、檢測和監(jiān)控的制作方法通過TREM-1的炎癥治療、檢測和監(jiān)控相關(guān)申請的交叉引用本申請主張2007年11月2日遞交的美國臨時(shí)專利申請No.61/001，687、2007年4月11日遞交的美國臨時(shí)專利申請No.60/923，131、2007年2月28日遞交的美國臨時(shí)專利申請No.60/904，264和2007年1月16日遞交的美國臨時(shí)專利申請No.60/880，804的優(yōu)先權(quán)，其完整公開通過引用作為參考。
背景技術(shù)：
：雖然RA的確切病因不明，已有人提出RA的形成涉及傳染病或環(huán)境暴露(Firestein(2005)JClin，Rheumatology11(3Supp.):S39-44)。先天免疫的局部誘導(dǎo)可以激活滑膜內(nèi)層中的細(xì)胞并準(zhǔn)備好遺傳性易感個(gè)體中后續(xù)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的區(qū)域(Firestein(2005)JClin.Rheumatology11(3supp.):S39-44)。已確診的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜的特征在于顯著的滑膜內(nèi)膜內(nèi)層增生、血管分布增加和內(nèi)層之下炎性細(xì)胞的積聚。對RA滑膜的活檢也揭示了許多促炎細(xì)胞因子，如TNF-a，IL-l(J，IL-6，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的自發(fā)產(chǎn)生(Feldman等。(1996)Ann.Rev.Immunol.14:397-440)。發(fā)現(xiàn)中和TNF-a活性的抗體取消了多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這導(dǎo)致了新型抗TNF-a療法治療RA的發(fā)現(xiàn)。最近的臨床結(jié)果顯示了RA的不一致性，并提示了其他因素髓樣細(xì)胞表達(dá)的觸發(fā)受體-1(TREM-1)是最近發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白樣細(xì)胞表面受體，主要表達(dá)在中性粒細(xì)胞和CD14*單核細(xì)胞的亞群上(Colo腿等。(2000年)SeminarsinImmunol.12(2):121-27)。TREM-1有短的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，且TREM-1信號(hào)傳導(dǎo)是通過銜接蛋白DAP12/TyproBP介導(dǎo)的。DAP12/TyroBP是一種具有免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)的跨膜蛋白，并作為銜接蛋白行使功能，與TREM-1和其他跨膜受體結(jié)合。在急性炎癥過程中，TREM-1表達(dá)凈皮各種Toll樣受體(TLR)配體上調(diào)(Bouchon等人(2001)Nature410(6832):1103-07;Bleharski等人(2003)丄Immunol.170(7):3812-18;Murakami等人(2006)54(2):455-62)。例如，已經(jīng)暗示TREM-1涉及與膿毒癥相關(guān)的急性炎癥(Colonna(2003)Nat.Rev.Immun.3(6):445-53)。在膿毒癥中，細(xì)胞表面TREM-1和可溶性TREM-1的表達(dá)以一種與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)的方式升高(Gibot等人(2005)NewEnglandJ.Med.350(5):451-58;Gibot等人(2005)CriticalCareMed.33(4):792-96)。在尿酸一鈉(MSU)誘導(dǎo)的痛風(fēng)炎癥才莫型中，在浸潤的腹膜巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中快速誘導(dǎo)TREM-1的表達(dá)。此外，TREM-1的活化刺激多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。此外，TREM-1與TLR和Nod樣受體在這些細(xì)胞因子產(chǎn)生中的協(xié)同效應(yīng)放大了炎癥反應(yīng)(Bouchon等人(2001)Nature410(6832):1103-07;Bleharski等人(20(B)J.Immunol.170(7):3812畫18;Netea等人(2006)J.LeukocyteBiol.80(6):1454-61)。這些數(shù)據(jù)表明了增加的TREM-1表達(dá)和TREM-1表達(dá)細(xì)胞向炎癥位點(diǎn)的遷移可能通過炎癥反應(yīng)的放大而促成急性炎癥。TREM-1在急性炎癥反應(yīng)中的作用，還通過使用TREM-1胞外域-Fc融合蛋白或TREM-1胞外域合成肽保護(hù)小鼠免于致死性LPS或細(xì)菌誘導(dǎo)的膿毒性休克而證實(shí)(Bouchon等人(2001)Nature410(6832):1103-07;Gibot等人(2004)J.Exp.Med.200(11):1419-26)。TREM畫l曙FC的也可防止酵母多糖-A誘導(dǎo)的肉芽腫形成，這表明TREM-1可以在慢性炎癥以及急性炎癥中發(fā)揮作用(Nochi等人(2003)Am.J.Path.162(4):1191-201)。此外，越來越多的證據(jù)表明，可溶形式TREM-1的循環(huán)水平是針對多種炎癥性疾病的生物標(biāo)志物，包括膿毒癥、肺炎、急性胰腺炎、消化性潰瘍(Gibot等人(2005)IntensiveCareMed.31(4):594-97;Gibot等人(2004)NewEnglandJ.Med.350(5):451-58;Wang等人(2004)WorldJ.ofGastroenterology10(18):2744-46;Koussoulas等人(2006)Eur.J.Gastroenterology&Hepatology18(4):375-79),發(fā)明概述本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)TREM-1和/或DAP12/TyroBP的過表達(dá)與自身免疫性疾病和/或炎癥性疾病的出現(xiàn)有關(guān)。因此，TREM-1和/或Dapl2/TyroBP是用于自身免疫性疾病和炎癥性疾病的預(yù)防和治療的新型治療耙標(biāo)。一方面，本發(fā)明涉及4吏用TREM-1和/或DAP12/TyroBP拮抗劑治療或預(yù)防炎癥性疾病。能夠用于本發(fā)明的拮抗劑包括，例如，抗體(包括例如抗體片段、單鏈抗體Fv、產(chǎn)生自任何物種的單結(jié)構(gòu)域抗體，所述物種包括例如人、小鼠、駱駝、駱馬、鯊魚、山羊、兔和牛，更詳細(xì)的說明見下文)；可溶性受體(包括截短的受體、天然可溶性受體、或包含與笫二蛋白質(zhì)(例如免疫球蛋白的Fc部分)融合的受體(或其片段)的融合蛋白)；肽抑制劑；小分子；配體融合物和結(jié)合蛋白。TREM-1和DAP12/TyroBP是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效生物標(biāo)志物，因?yàn)檫@些基因在患有類風(fēng)濕性性關(guān)節(jié)炎的個(gè)體中#達(dá)。TREM-1是表達(dá)在特定細(xì)胞類型上的細(xì)胞受體，如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞亞群，而且TREM-1也以可溶性形式存在。TREM-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由銜接蛋白DAP12/TyroBP介導(dǎo)。TREM-1的活化誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。因此，TREM-1提高的表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致或促使在RA、哮喘和其它炎癥疾病中觀察到的炎癥，如慢性炎癥性疾病和呼吸系統(tǒng)炎癥/疾病。所以，TREM-1和/或DAP12/TyroBP是用于治療、調(diào)節(jié)和/或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它炎癥疾病相關(guān)的癥狀有前途的治療靶標(biāo)。—方面，本發(fā)明提供了一種通過減少TREM-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來治療炎癥性疾病的方法，這種炎癥性疾病諸如，例如，慢性炎癥性疾病(如RA)或呼吸系統(tǒng)紊亂/疾病(如哮喘)。減少TREM-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可包括調(diào)節(jié)、抑制和/或拮抗TREM-1受體和/或涉及TREM-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的其他分子(如DAP12/TyroBP)，從而減輕、治療、預(yù)防、緩和和/或改善與TREM-1介導(dǎo)的炎癥相關(guān)的癥狀。在一些實(shí)施方案中，通過抑制TREM-1轉(zhuǎn)錄、選擇性切割內(nèi)源性TREM-lmRNA或抑制內(nèi)源性TREM-1mRNA翻譯來降低TREM-1蛋白表達(dá)。例如，TREM-1蛋白的表達(dá)可以通過給予干擾RNA來降低，例如shRNA(如，SEQIDNO:9-22中任意一個(gè)編碼的shRNA)或siRNA(例如SEQIDNO:23-26中的任意一個(gè))。在其他的實(shí)施方案中，TREM-1的活化通過給予小分子、擬肽、肽抑制劑、配體融合蛋白、結(jié)合TREM-1的抗體或抗體片段、結(jié)合TREM-1配體的抗體或抗體片段、可溶性TREM-1受體或其配體結(jié)合部分、或可溶性TREM-1受體融合蛋白來抑制。本發(fā)明其它實(shí)施方案提供通過直接抑制TREM-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的非TREM-1成員(例如，TREM-1輔助蛋白DAP12/TyroBP)治療炎癥性疾病的方法，該炎癥性疾病i者如，例如，性炎癥性疾病(如RA)或呼吸系統(tǒng)紊亂/疾病(如哞喘)。在一些實(shí)施方案中，通過在受試者中對內(nèi)源性TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白誘導(dǎo)免疫應(yīng)答而在受試人中降低TREM-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，可對受試者施用包含佐劑和TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白或其免疫原性片段的免疫原性組合物，以引發(fā)對該內(nèi)源性蛋白的免疫應(yīng)答。另一方面，本發(fā)明提供了SEQIDNO:9-22中任意一個(gè)編碼的shRNA。0012本發(fā)明指出，TREM-1的活化導(dǎo)致許多基因的差異表達(dá)，如分泌型磷蛋白1(SPP1)，它可以作為TREM-1活性的標(biāo)志物。因此，在另一方面，本發(fā)明提供特異性針對TREM-1活性和對TREM-1活性有指示性的標(biāo)志物。一個(gè)或多個(gè)這些標(biāo)志物水平的變化與TREM-1的活性變化相關(guān)。因此，本發(fā)明還提供通過檢測這些標(biāo)志物中的一個(gè)或多個(gè)的水平來評價(jià)TREM-1的活性，和/或評價(jià)給予需要這種治療的患者(例如病人)TREM-1調(diào)節(jié)劑的療效的方法。例如，可在患者或來自患者的樣本中檢測分泌型磷蛋白1(SPP1,也稱為骨橋蛋白(OPN)、骨涎蛋白I(BSPI)、早期T-淋巴細(xì)胞活化蛋白1(ETA-1)或MGC110940)的水平，而且SPP1水平的變化與TREM-1的信號(hào)變化相關(guān)。SPP1水平可以在患者或來自患者的任何臨^目關(guān)樣本中檢測，如體液樣本(如血清、滑液、氣管液，唾液)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將SPP1水平與參考水平比較的步驟，其中與參考水平相比SPPI水平的增加可以是TREM-1活性增加的指征，其中相對于參考水平SPP1水平的下降可以是TREM-1活性降低的指征。該參考水平可以是，例如，在給予TREM-1調(diào)節(jié)劑之前患者或來自患者的樣本中檢測的SPP1水平。下面較詳細(xì)的說明了根據(jù)本發(fā)明可用于評估TREM-1活性的其他標(biāo)志物，如圖8A所示。本發(fā)明還提供了通過如下步驟在受試者(如人)中檢測諸如慢性炎癥性疾病(諸如RA或哮喘等)等炎癥性疾病存在的方法檢測TREM-1或DAP12/TyroBP在受試者或來自受試者的樣本中的表達(dá)和將受試者或樣本中的TREM-1或DAP12/TyroBP表達(dá)與參考水平比較。比較的結(jié)果(例如表達(dá)的增加)是炎癥性疾病存在的指征。參考水平可以是炎癥性疾病存在的指征，或是區(qū)分正常表達(dá)和表達(dá)升高的閾值等。另一方面，本發(fā)明提供了在受試者(例如人)中監(jiān)測諸如慢性炎癥性疾病(如RA)或呼吸系統(tǒng)紊亂/疾病(如哞喘)等炎癥性疾病的方法。該方法受益于如下了解TREM-1或DAP12/TyroBP的表達(dá)或活性在受試者中隨時(shí)間的變化(對受試者或來自受試者的樣本在不同時(shí)間測定)可以用作疾病狀態(tài)改變的指征。該方法包括在兩個(gè)或更多個(gè)不同的時(shí)間(此處有時(shí)稱為第一時(shí)間和后來的第二時(shí)間)檢測受試者或來自受試者的樣本的TREM-1或DAP12/TyroBP的表達(dá)或活性，并比較觀察到的表達(dá)或活性。TREM-1或DAP12/TyroBP的表達(dá)或活性隨時(shí)間的降低可以作為炎癥性疾病減輕的指征，而TREM-1或DAP12/TyroBP的表達(dá)或活性隨著時(shí)間的增加則可以是炎癥性疾病嚴(yán)重的指征。本發(fā)明這些和其他方面，以及實(shí)施方案也在本申請的下列部分中詳細(xì)說明，這些說明只是為了突出說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書限定。附圖簡要說明圖6顯示了成簇分析調(diào)節(jié)大于2倍，p小于0.01的基因的示例性ANOVA熱圖(ANOVAheatmap)。個(gè)體供體示于左側(cè)，平均平均值強(qiáng)度示于右側(cè)。圖7顯示了所有存在的基因的示例性散點(diǎn)圖("回應(yīng)(calls)")。針對TREM-1(x-軸)和LPS(y-軸)標(biāo)繪Ln倍數(shù)改變(Lnfoldchanges)，下調(diào)轉(zhuǎn)換為負(fù)值。選擇的基因突出顯示。其45。軸分開兩種治療可比調(diào)節(jié)的基因。圖9a為列出了共同上調(diào)大于4倍的示例性基因的表格，也就是說，這些基因是在TREM-1活化和在用LPS處理時(shí)都上調(diào)的基因。圖15為顯示在mTREM-l-hFC轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠中應(yīng)答K/BxN血清轉(zhuǎn)移的踝增厚的圖表。圖16為顯示mTREM-l-hFC轉(zhuǎn)基因小鼠在第14天應(yīng)答K/BxN血清轉(zhuǎn)移的踝增厚的圖表。圖18是表示在用mTREM-l-mFc蛋白預(yù)處理的小鼠中以抗IgE抗體攻擊后耳肺脹的圖表。圖19是表示在用mTREM-l-mFc蛋白預(yù)處理的小鼠中以抗IgE抗體攻擊后耳朵腫脹的劑量反應(yīng)的圖表。本文中所使用的術(shù)語"反義"是指與特定DNA或RNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列。術(shù)語"反義鏈"是用來指與"正義，，鏈互補(bǔ)的核酸鏈。反義分子可通過任何方法制備，包括通過以顛倒的方向?qū)⒛康幕蚺c病毒啟動(dòng)子連接，這允許互補(bǔ)鏈的合成。一旦引入細(xì)胞中，這種經(jīng)轉(zhuǎn)錄的鏈結(jié)合細(xì)胞產(chǎn)生的天然序列形成二倍體。然后這些二倍體進(jìn)一步阻斷轉(zhuǎn)錄或翻譯。"-"負(fù)標(biāo)識(shí)有時(shí)用于指代反義鏈，和"+"正標(biāo)識(shí)有時(shí)用于指代正義鏈。本文提到的術(shù)語"受試者，，和"患者，，是指任何人類或非人類的哺乳動(dòng)物。本文提到的術(shù)語"慢性炎癥性疾病"是指炎癥反應(yīng)長期持續(xù)(例如，幾周，幾月，甚至無限期)的任何疾病，且其延長的時(shí)間段是由組織中炎癥的成因刺激物持續(xù)刺激引起的。術(shù)語"慢性炎癥性疾病"包括，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。本文提到的術(shù)語"PCR"指聚合雜式反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法用于證明TREM-1蛋白水平在人RA樣本中不但可檢測到而且是升高的。RA患者血漿來自于第二階段、雙盲、安慰劑對照、平行、隨機(jī)，多中心、門診病人、比較研究中，該研究在患有活性RA并且對于恒定劑量的(每周一次7.5-20毫克)氨甲蝶呤(MTX)應(yīng)答不足的受試者中進(jìn)行。受試者招募自世界范圍的81個(gè)地點(diǎn)。在選定的地點(diǎn)，32名同意自愿參與收集樣本的受試者，為生物標(biāo)志物的探索性研究提供血液樣本。在此報(bào)告的數(shù)據(jù)是從第1天(給藥前)采取的血漿樣本。對照組血漿采集自健康志愿者多中心、具前瞻性、非介入觀察研究所招募的受試者。每個(gè)臨床站點(diǎn)的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)或倫理委員會(huì)均允許了的這些研究，并且在獲得每個(gè)病人的知情同意前沒有執(zhí)行任何程序。用于檢測人體臨床血漿樣本可溶性TREM-1的ELISA方法改編自DuoSetELISA開發(fā)系統(tǒng)，購自R&DSystems(Minneapolis,MN;目錄號(hào)DY1278)。改編的ELISA方法減少了假陽性，并提高了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性動(dòng)態(tài)范圍。簡單地說，ELISA以夾心形式進(jìn)行，捕獲抗體為4.0ng/ml和檢測抗體為200ng/ml。血漿樣本按l:2倍稀釋于購自MesoScaleDiscovery(Gaithersburg，Maryland;目錄號(hào)R54BB國3)的GF1緩沖液中。標(biāo)準(zhǔn)品也按1:2用GF1緩沖液稀釋純凈血漿。以范圍為1.37至1000pg/ml的R2為0.999的四參數(shù)曲線擬合(XL-FitIDBS,Burlington,MA)，檢測限為1.37pg/ml。此外，檢測到升高的血漿TREM-1水平與類風(fēng)濕因子升高水平之間的顯著關(guān)聯(lián)性。實(shí)施例5:交聯(lián)TREM-1后促分裂原激活的蛋白激酶的活化純化的人單核細(xì)胞接種入同種型匹配對照抗體或a-TREM-l交聯(lián)抗體預(yù)包被的孔中，以確定是否TREM-1受體激活觸發(fā)促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的活化。簡單地說，健康志愿者的人leukopacks(血沉棕黃層蟾蜍色素(Buffycoats))，獲自馬薩諸塞州總醫(yī)院臨^jk液學(xué)實(shí)驗(yàn)室(MassachusettsGeneralHospitalClinicalHematologyLaboratory,Boston,MA)。血沉棕黃層蟾繚色素存放于4。C過夜以便第二天細(xì)胞分離。單核細(xì)胞以RosetteSep(StemCellTechnologies,Vancouver,BC;15068)依產(chǎn)品方法經(jīng)Histopaque(SIGMA，H8889)密度離心通過負(fù)選擇分離。所有培養(yǎng)都在37*€組織培養(yǎng)箱，維持5。/。C02條件下進(jìn)行。純化的單核細(xì)胞置于含有10%的熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。組織培養(yǎng)處理的平板用5ng/ml的a-TREM-l交聯(lián)抗體(R&DSystems,Minneapolis,MN;MAB1278)PBS溶液處理，組織培養(yǎng)箱中過夜。對照孔以柔嫩艾美耳球蟲(五.^1^//fl)的同種型匹配抗體(Wyeth，Madison，NJ)進(jìn)行相似處理。臨加入細(xì)胞前用PBS洗兩次培養(yǎng)孔。經(jīng)5至180分鐘的時(shí)間以標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(見圖5)。a-磷-ERK、a-磷-p38和a-磷-JNK抗體購自CellSignalingTechnologies(Danvers，MA;分別為9101、9211和9251)，a-肌動(dòng)蛋白抗體購自Sigma(St.Louis,MO;A2103)。如圖5所示，交聯(lián)抗體對TREM-1的激活使MAPK廣泛激活。以前未知p38和JNK對TREM-1激活有響應(yīng)。在純化的人單核細(xì)胞中，這些廣泛促炎癥反應(yīng)由TREM-1激活引起的整體基因表達(dá)的變化所確認(rèn)(見實(shí)施例10)。實(shí)施例6:a-TREM-l和LPS處理后的轉(zhuǎn)錄i普分析00115用轉(zhuǎn)錄鐠分析來鑒別在TREM-1受體激活的情況下差異表達(dá)的基因。利用轉(zhuǎn)錄鐠，分泌型磷蛋白1(SPP1，也稱為骨橋蛋白(OPN)，骨涎蛋白(BSPI)，早期T-淋巴細(xì)胞活化蛋白1(ETA-l)，或MGC110940)被鑒定為TREM-1激活的特異性標(biāo)記，而不是作為一個(gè)必要的促炎癥結(jié)果(readout)。組織培養(yǎng)物的制備和RNA分離圖6顯示了轉(zhuǎn)錄語數(shù)據(jù)的熱圖聚類分析。在圖6中，個(gè)體供體顯示在左邊(每列代表一個(gè)個(gè)體供體)和平均均值強(qiáng)度在右邊顯示，每行代表個(gè)體限定基因。顯示熒光強(qiáng)度。a-TREM-l處理的樣本與對照抗體處理的樣本進(jìn)行比較，和LPS處理的樣本與未經(jīng)處理的進(jìn)行比較。分層聚類算法用于進(jìn)行具有相似表達(dá)模式的限定基因的分組。在圖6中，括號(hào)內(nèi)的區(qū)域表明對應(yīng)于由TREM-1激活上調(diào)的，LPS上調(diào)的，共同下調(diào)的，TREM-1激活下調(diào)的或LPS下調(diào)的限定基因的熱圖區(qū)域。TREM-1偏向基因的總結(jié)如圖8A所示，這些基因響應(yīng)TREM-1激活而上調(diào)大于4倍。圖中提供的是在TREM-1激活(TREM)，LPS(LPS)，和TREM-1激活加LPS組合(雙重)下的倍數(shù)變化，按照TREM-1/LPS的比例排列。TREM-1激活上調(diào)大于4倍的基因的p值在7.7xl0"到2.6xl0"的范圍內(nèi)。被確定為優(yōu)先由TREM-1激活誘導(dǎo)的基因包括SPRY2，細(xì)胞因子及相關(guān)分子(TNFSF14、CSF1、SPP1、CCL7、IL1F5、LIF)，金屬硫蛋白(MT1K、MT1E、MT1F)，磷酸酶(DUSP14、DUSP4)，轉(zhuǎn)錄因子(EGR2、ATF3)，參與脂質(zhì)代謝和/或信號(hào)傳遞的因子(EDG3、LPL、PPAP2B、PLCXD1、NPC1、FABP3、ACSL3)，MMP19和PPARG。這些基因中，響應(yīng)于TREM-1的激活，SPP1上調(diào)了28.0倍(p=1.2x10_°7)(見圖8A及11E)，但LPS處理后沒有明顯上調(diào)。因此，SPP1不是必要的促炎癥結(jié)果，而可以在患者(或患者樣本)中作為TREM-1活性的標(biāo)志和在篩選檢測中用于鑒定TREM-1調(diào)節(jié)劑。此外，對于患者的炎癥或慢性炎癥(如RA)治療，SPP1也可作為TREM-1治療的療效或潛在療效的指征。對于可被用作TREM-1活性標(biāo)記的其它基因列在圖8A,23和24。對于符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但沒有在圖8A中列出的那些基因包括C6orf114，C6orgl28，C9orf47，KIAA1199，KIAA1393,LOC440995和MGC33212。一般情況下，由TREM-1激活優(yōu)先誘導(dǎo)的基因很大程度上不受LPS處理影響?？偨Y(jié)的LPS偏向性基因如圖8B所示，這些基因響應(yīng)LPS處理耳^皮上調(diào)大于4倍。圖中提供了用TREM-1激活(TREM)、LPS(LPS)、TREM-1活化和LPS的組合(雙重)得到的倍數(shù)變化，根據(jù)LPS/TREM-1比例排列。該表中用LPS處理后上調(diào)大于4倍的基因的p值在1.2xi(T3-3.6x10-14范圍內(nèi)。被鑒定為優(yōu)先由LPS誘導(dǎo)的基因包括白介素(IL23A、IL12B、EBI3、IL1F9、IL10、ILIA、IL18)、白介素受體(IL15RA、IL2RA、IL7R)、細(xì)胞因子和相關(guān)分子(CSF3、CCL23、CXCL1、TSLP、CCL5、CLC、EREG、TNFSF9)、參與脂質(zhì)代謝和/或信號(hào)傳遞的因子(SGPP2、PLA1A、MGLL)、激酶(MAP3K8、RIPK2、MAP3K4、TBK1、PIM3)、NF-kB信號(hào)調(diào)節(jié)子(TNIP3、NFKBIZ)、CCR7和CIAS1。對于符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但沒有在圖8B中列出的那些基因包括C10orf78、C21orf71、FLJ14490、FLJ23231、FLJ25590、FLJ32499、KIAA0286、KIAA0376、LOC90167、LOC123872、LOC285628、LOC338758、LOC341720、LOCLOC374443、LOC387763、LOC400581、LOC441366、MGC10744和MGC11082。圖9A顯示共同上調(diào)基因的總結(jié)(即通過TREM-1激活和LPS處理而上調(diào)的基因)。圖中提供了用TREM-1激活(TREM)、LPS(LPS)、TREM-1激活和LPS的組合(雙重)得到的倍數(shù)變化，根據(jù)TREM-1激活而誘導(dǎo)的倍數(shù)排列。TREM-1激活處理后而上調(diào)大于4倍的基因的p值在1.7x10-3-1.5x10-1()范圍內(nèi)，用LPS處理后上調(diào)大于4倍的基因的p值在4.1x1(T3~2.0x10-14范圍內(nèi)。被鑒定為共同上調(diào)的基因包括TNF超家族成員和調(diào)節(jié)因子(TNFSF15,BRE、TNF)、趨化因子(CXCL3、CXCL2、CCL20、CXCL5、CCL3)、其他細(xì)胞因子和促有絲分裂因子(CSF2、IL-6、AREG)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、MMP10)和PTGS2/COX2。這些結(jié)果既符合TREM-1激活也符合LPS引發(fā)的促炎癥反應(yīng)。還有INHBA，凝血和血管生成因子(F3、EDN1、TFPI2、SERPINB2)，轉(zhuǎn)錄和DNA結(jié)合因子(HES4、EGR1、FOSLl、E2F7、EGR3、MAFF、ETS2、HES1),脂質(zhì)代謝和/或信號(hào)傳遞涉及的因子(PLD1、ELOVL7、SYNJ2、GLA、STARD4)。對于符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但沒有在圖9A中列出的那些基因包括C20orfB9，KIAA1718，LOC348938，LOC401151，LOC401588，LOC92162和MGC4504。在組合(雙重)處理方法中，在圖9A中的大多氣基因的表達(dá)變化在單獨(dú)處理中的那些的總和的2倍以內(nèi)。一個(gè)例外是CSF2(即GM-CSF)，在組合處理方法中，其mRNA誘導(dǎo)就單獨(dú)處理而言顯著增高(以TREM-1激活，LPS和組合處理的增高分別為9.6，18.9和192.4倍)。或者TREM-1激活或者LPS處理導(dǎo)致的倍數(shù)變化小于-4(即下調(diào)大于4倍)的基因總結(jié)如圖9B所示。圖中提供了用TREM-1激活(TREM)、LPS(LPS)、TREM-1激活和LPS的組合(雙重)得到的倍數(shù)變化，根據(jù)TREM-1激活誘導(dǎo)的倍數(shù)排列。該表中用TREM-1激活處理后下調(diào)大于4倍的基因的p值在5.6xl(T3-5.7x10"2范圍內(nèi)，用LPS處理后下調(diào)超過4倍的基因的p值在2.4x10-3-1.1xl(T"范圍內(nèi)。如圖6所示，在我們的分析中，雖然在這些基因中處理特異性更少，但是與上調(diào)基因一樣，有相當(dāng)數(shù)量的基因出現(xiàn)下調(diào)。被鑒定為下調(diào)的基因包括趨化因子受體(CCR2，CX3CR1)，轉(zhuǎn)錄因子(OLIGl，ZNF555，OLIG2)，免疫相關(guān)蛋白的GTP酶(GIMAP6,GIMAP7,GIMAP8,GIMAP1)和CCL8。CCR2在a-TREM-l和LPS處理中都是下調(diào)的(參見圖9B),它的下調(diào)是單核細(xì)胞對巨噬細(xì)胞分化的一個(gè)標(biāo)記。此外，TLRl和NOD樣受體(CARD12,NALP12)也下調(diào)。對于符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但沒有在圖9B中列出的那些基因包括C9orf59,FLJ12442，F(xiàn)LJ33641，LOC卯120，MGC2941和MGC17791?？紤]到mRNA半衰期對于分析有限的動(dòng)力作用，正如預(yù)期的那樣，下調(diào)的動(dòng)態(tài)范圍低于上調(diào)的。此外，TREM-1和LPS差異地調(diào)節(jié)CSF生成，M-CSF是TREM-1偏向的，G-CSF是LPS特異性的(見圖7，8A-B)。實(shí)施例7:細(xì)胞吞嗟試驗(yàn)將人THP-1細(xì)胞用a-TREM-l和LPS處理以比較a-TREM-l處理和LPS處理對THP-1細(xì)胞形態(tài)和行為的影響。按照建i義的增殖方法培養(yǎng)人THP-1細(xì)胞(ATCC，TIB-202)。為加強(qiáng)可視化，在進(jìn)行所述處理之前，對THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)GFP慢病毒，組織培養(yǎng)處理孔內(nèi)培養(yǎng)5天。吞嗟試驗(yàn)通過力口入FluoresbriteTMpolychromaticred1.0微米微球(Polysciences，Inc.,Warrington,PA;18660)，組織培養(yǎng)箱中孵育30分鐘、成像前以培養(yǎng)基洗滌以去除未吞噬的微珠來進(jìn)行。a-TREM-l處理引起THP-1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(圖10a)。此外，a-TREM-l和LPS處理都誘導(dǎo)了標(biāo)記的微^J^噬(ljiM珠顯示紅色)，與TREM-1活化在刺激免疫應(yīng)答中的作用一致(圖10B)。實(shí)施例8:基因表達(dá)的ELISA分析傳在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)可溶性mTREM-l-hFc融合蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠用K/BxN血清攻擊，以評估是否可溶性TREM-1減少關(guān)節(jié)炎的炎癥。簡言之，C57BL/6的背景下制備TREM-1轉(zhuǎn)基因("Tg")小鼠以表達(dá)受控于CAGGS啟動(dòng)子的可溶性mTREM-l-hFc融合蛋白，這是一個(gè)廣泛性的強(qiáng)大融合啟動(dòng)子，由CMV增強(qiáng)子和p-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子組成。整體構(gòu)造是CAGGS/mTREM-l-hFc/兔p-球蛋白polyA。轉(zhuǎn)基因小鼠血漿中可溶性mTREM-l-hFc蛋白水平約為l-2mg/ml。TREM-1轉(zhuǎn)基因雄性小鼠(n=7)和野生型雄性小鼠(n=7)在第0天和第2天自內(nèi)注射(ip)150^1的K/BxN血清。踝直徑定期測量直到第14天。用于產(chǎn)生本發(fā)明融合蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，可包括，但不僅限于，啟動(dòng)子序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄啟始和終止序列，翻譯啟動(dòng)和終止序列，和增強(qiáng)子或激活子序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄啟始和終止序列。啟動(dòng)子序列可編碼組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是天然產(chǎn)生的啟動(dòng)子或雜合啟動(dòng)子。雜合啟動(dòng)子，其中集成了一個(gè)以上的啟動(dòng)子元件，也是本領(lǐng)域所熟知的，并可在本發(fā)明使用。其它的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以通過mTREM-l-hFc雜合子小鼠與野生型小鼠回交而產(chǎn)生，野生型后代可以作為同窩對照。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可在多種本領(lǐng)域所知的炎癥性疾病的動(dòng)物模型中進(jìn)行測試，例如，LPS和CIA，以確定是否各種mTREM-l-hFc構(gòu)建體對炎癥性疾病有保護(hù)。mTREM-l-hFc構(gòu)建體可以是組成型表達(dá)的，或mTREM-l-hFc構(gòu)建體的表達(dá)可以在用LPS和CIA攻擊之前、同時(shí)、和/或之后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)得到誘導(dǎo)。也可制備表達(dá)TREM-1受體的可溶性形式的轉(zhuǎn)基因小鼠以篩選炎癥性疾病推定的抑制劑。在內(nèi)毒素休克的脂多糖(LPS)模型中，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射LPS以確定mTREM-l-hFc構(gòu)建體在減少對LPS豫導(dǎo)的震擾響應(yīng)的炎癥的有效性。此外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以在CIA模型中進(jìn)行測試，例如在實(shí)施例2中，以確定mTREM-l-hFc構(gòu)建體在減少對CIA響應(yīng)的炎癥的有效性。在人類RA滑膜培養(yǎng)物檢測中，篩選抗-hTREM-l抗體抑制促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力。RA和哮喘模型，如實(shí)施例9和實(shí)施例12中所示，已被成功地用作炎性疾病模型，來開發(fā)中和炎癥反應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)方面的治療性抗體。部分基于TREM-1與炎癥疾病如RA和哮喘的相關(guān)性，預(yù)期抗-hTREM-l抗體在RA滑膜培養(yǎng)物檢測和哮喘模型中抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。同樣，施用適當(dāng)抗體給患有炎癥性疾病(如RA或譯喘)的人類受試者，應(yīng)減少炎癥疾病的嚴(yán)重程度和/或減輕疾病的癥狀。實(shí)施例12:TREM-1和用抗IgE抗體的攻擊如圖18所示，與對照相比，以可溶性mTREM-l-mFc蛋白預(yù)處理的小鼠減少了耳的腫脹。此外，如圖19所示，耳腫脹減少是劑量依賴性的。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，可溶性TREM-l減少了與抗IgE攻擊相關(guān)的炎癥，而TREM-1和/或TREM-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑，例如，可溶性TREM-1融合蛋白和/或抗-TREM-l抗體，可施用給病人以治療與抗IgE的攻擊相關(guān)的炎癥。例如，可溶性TREM-1和/或抗-TREM-l抗體，預(yù)計(jì)將有效調(diào)節(jié)哮喘、過敏反應(yīng)、急性和慢性蕁麻疹(風(fēng)疹)、血管性水腫、變應(yīng)性鼻炎有效、昆蟲叮咬變應(yīng)性和特應(yīng)性。在TREM-1敲除小鼠中的抗IgE攻擊為了說明RNA干擾為基礎(chǔ)的治療在炎癥性疾病中的用途，在shRNA及siRNA敲除后測量THP-1單核細(xì)胞中TREM-l的表達(dá)。簡單地說，產(chǎn)生多種人TREM-l和鼠TREM-lshRNA序列，并各個(gè)檢測其降低TREM-l表達(dá)的能力。典型的shRNA序列如表5所示。通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，在THP-1單核細(xì)胞中表達(dá)shRNA。人TREM-lsiRNA可以從Dharmacon(Lafayette,CO)商購，并通過核轉(zhuǎn)染(nucleofection)引入THP-1單核細(xì)胞。代表性siRNA序列見表6。敲除后，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時(shí)(在shRNA的情況下)或在核轉(zhuǎn)染后48小時(shí)(在siRNA的情況下)用TaqManRT-PCR測量TREM-l的表達(dá)。圖21是顯示shRNA或siRNA敲除后用RT-PCR測得的TREM-l表達(dá)的圖。如圖21，與vGFP和混雜的(scramble)siRNA對照相比，sh247,sh533，sh382,和匯集的TREM-lsiRNA有效地敲除了在THP-1單核細(xì)胞中內(nèi)源性TREM-l的表達(dá)。因此，shRNA及siRNA敲除是降低TREM-l表達(dá)的有效手段，因此可以用于治療炎癥性疾病。圖22A-B顯示了說明在TREM-l過表達(dá)細(xì)胞系中用慢病毒shRNA敲除TREM-l之后TREM-l表達(dá)的代表性蛋白質(zhì)印跡。如圖22A所示，與對照相比，shll4、sh247、sh247、sh280、sh315、sh360、sh450和sh533有效敲除人TREM-l-FLAG過表達(dá)，而sh382和sh600在敲除人TREM-l-FLAGit^達(dá)中無效。如圖22B所示，與對照相比，sh75、sh284和sh414有效敲除小鼠TREM-l-FLAG過表達(dá)，而sh591在敲除小鼠TREM-1-FLAGit^達(dá)中無效。因此，shRNA敲除是減少TREM-1it^達(dá)進(jìn)而治療TREM-1相關(guān)的炎性疾病的有效手段。<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表6:Dharmacon⑧人TREM-lsiRNA序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>參考文獻(xiàn)的合并[00157本申請中引用的所有出版物和專利文件如各自單獨(dú)合并一樣，均整體合并于此作為參考。權(quán)利要求1、一種治療受試者炎癥性疾病的方法，所述方法包括降低TREM-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述炎癥性疾病由IgE介導(dǎo)。3、如權(quán)利要求l所迷的方法，其中所述炎癥性疾病為呼吸系統(tǒng)疾病。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述疾病為哞喘。5、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述炎癥性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。6、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述降低步驟包括降低TREM-1的表達(dá)。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述降低步驟包括向受試者施用千擾RNA。8、如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述干擾RNA為shRNA。9、如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述shRNA包括SEQIDNO:9-18中任一個(gè)所編碼的RNA。10、如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述干擾RNA為siRNA。11、如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述siRNA包括SEQIDNO:23-26中的任一個(gè)。12、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述降低步驟包括抑制TREM-1活性。13、如權(quán)利要求12所述的方法，其中通過施用選自小分子、擬肽、肽抑制劑、配體融合蛋白、特異性結(jié)合TREM-1的抗體或其片段、特異性結(jié)合TREM-1配體的抗體或其片段、可溶性TREM-1受體、可溶性TREM-1受體融合蛋白及其組合的化合物來抑制TREM-1活性。14、如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述降低步驟包括直接抑制TREM-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的非TREM-1蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性。15、如4又利要求14所述的方法，其中所述非TREM-1蛋白質(zhì)為DAP12/TyroBP。16、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述降低步驟包括在受試者中誘導(dǎo)對內(nèi)源性TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白的免疫應(yīng)答。17、如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述降低步驟包括向受試者施用包含佐劑和TREM-1或DAP12/TyroBP蛋白或其免疫原性片段的免疫原性組合物。18、特異性結(jié)合TREM-1的抗體或其片段。19、如權(quán)利要求18所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是單克隆抗體或單克隆抗體片段。20、如權(quán)利要求18所述的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段是單結(jié)構(gòu)域抗體。21、一種治療受試者的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如權(quán)利要求19所述的抗體或其片段的步驟。22、包含SEQIDNO:9-22中任一個(gè)所編碼的RNA的shRNA。23、一種治療有需要的受試者的炎癥性疾病的方法，所述方法包括通過施用選自小分子、擬肽、肽抑制劑、配體融合蛋白、特異性結(jié)合TREM-1的抗體或其片段、特異性結(jié)合TREM-1配體的抗體或其片段、可溶性TREM-1受體、可溶性TREM-1受體融合蛋白及其組合的化合物來降低TREM-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的步驟。24、評價(jià)向有需要的患者所施用TREM-1調(diào)節(jié)劑的功效的方法，所述方法包括在患者中或來自患者的樣本中檢測分泌型磷蛋白1(SPP1)的水平。25、如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述SPP1水平在來自患者的體液樣本中檢測。26、如權(quán)利要求24所述的方法，進(jìn)一步包括將SPP1水平與參照比較的步驟，其中與參照相比SPP1水平的升高是TREM-1活性升高的指征，其中與參照相比SPP1水平的降低是TREM-1活性降低的指征。27、如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述參照對應(yīng)于在施用所述TREM-1調(diào)節(jié)劑之前的時(shí)間點(diǎn)在患者或者來自患者的樣本中測得的SPP1水平。28、篩逸能夠調(diào)節(jié)TREM-1信號(hào)的候選試劑的方法，所述方法包括步驟將表達(dá)TREM-1的細(xì)胞與候選試劑接觸；和評價(jià)所述表達(dá)TREM-1的細(xì)胞的分泌型磷蛋白1(SPP1)水平，以確定所述候選試劑是否調(diào)節(jié)TREM-1活性。29、監(jiān)測治療'隻性炎癥的患者的方法，所述方法包括步驟向有需要的患者施用TREM-1調(diào)節(jié)劑；在患者或來自患者的樣本中檢測分泌型磷蛋白(SPP1)水平；和將所檢測到的SPP1水平與參照比較，從而監(jiān)測所述患者。30、如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述SPPl水平在來自患者的體液樣本中檢測。31、如權(quán)利要求29所述的方法，其中與參照相比SPP1水平的降低是TREM-1介導(dǎo)的炎癥減輕的指征。32、如權(quán)利要求29所述的方法，其中與參照相比SPP1水平?jīng)]有變化是TREM-1介導(dǎo)的炎癥沒有變化的指征。33、如權(quán)利要求29所述的方法，其中與參照相比SPP1水平的升高是TREM-1介導(dǎo)的炎癥加重的指征。34、如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述參照對應(yīng)于在施用所述TREM-1調(diào)節(jié)劑之前的時(shí)間點(diǎn)或同時(shí)在患者或來自患者的樣本中檢測的SPP1水平。35、如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述參照對應(yīng)于已知未患慢性炎癥的對照受試者的SPP1氷平。36、檢測受試者中存在炎癥性疾病的方法，所述方法包括步驟在受試者或來自受試者的樣本中檢測TREM-1或DAP12/TyroBP的表達(dá)或活性，其中升高的表達(dá)或活性是所述炎癥性疾病的指征。37、在受試者中監(jiān)測炎癥性疾病的方法，所述方法包括步驟(a)在第一時(shí)間對患者或來自患者的第一樣本檢測TREM-1或DAP12/TyroBP的表達(dá)或活性；(b)在后來的笫二時(shí)間對患者或來自患者的后來的第二樣本檢測TREM-1或DAP12/TyroBP的表達(dá)或活性；和(c)比較(a)和(b)的所i^達(dá)或活性，其中表達(dá)或活性的改變是疾病狀態(tài)改變的指征。38、如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述炎癥性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。39、評價(jià)受試者中炎癥性疾病的治療的方法，所述方法包括步驟(a)在第一時(shí)間對患者或來自患者的第一樣本檢測TREM-1或DAP12/TyroBP的表達(dá)或活性；(b)在后來的笫二時(shí)間對患者或來自患者的后來的第二樣本檢測TREM-1或DAP12/TyroBP的表達(dá)或活性；(c)在所述后來的第二時(shí)間或后來的第二樣本之前進(jìn)行治療；和(d)比較(a)和(b)的所it^達(dá)或活性，其中表達(dá)或活性的改變是疾病狀態(tài)改變的指征。40、如權(quán)利要求39所述的方法，其中在第一時(shí)間或第一樣本之后給予所述治療。41、如權(quán)利要求39所述的方法，進(jìn)一步包括基于所述比較的結(jié)果修改對受試者治療的療程。全文摘要本發(fā)明提供了通過抑制/拮抗TREM-1表達(dá)/活性/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或DAP12/TyroBP表達(dá)/活性而治療受試者炎癥性疾病/紊亂的方法。本發(fā)明還包括通過檢測受試者或來自受試者的樣本中TREM-1和/或DAPl2/TyroBP表達(dá)或活性來檢測受試者中炎癥性疾病存在的方法，其中升高的表達(dá)或活性是所述炎癥性疾病的指征。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過檢測患者或來自患者的樣本中分泌型磷蛋白1(SPP1)和/或一種或多種其他生物標(biāo)志物的水平來評價(jià)給予患者的TREM-1調(diào)節(jié)劑的功效的方法。文檔編號(hào)C07K16/00GK101687916SQ200880008378公開日2010年3月31日申請日期2008年1月16日優(yōu)先權(quán)日2007年1月16日發(fā)明者C·威廉姆斯,D·D·皮特曼,D·溫克勒,J·L·費(fèi)爾德曼,K·道爾,M·查特吉-肖基爾,S·A·葉林斯基,林俐伶,軍蒯申請人:惠氏公司