一種皮膚細胞損傷修復試劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，主要應用于貼壁細胞的分離培養(yǎng)，特別是一種皮膚細 胞損傷修復試劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一類特殊的干細胞，來源于發(fā)育 早期的中胚層和外胚層，在分類上屬于多能干細胞，在體內(nèi)或體外特定的誘導條件下，MSC 可分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞、肝細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞等多種組織 細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老 和病變引起的組織器官損傷修復，因其具有多向分化潛能的特性，在臨床中可廣泛用于多 種疾病治療比如肝纖維化、神經(jīng)損傷、腦癱、心肌梗死等諸多疑難病癥，MSC不表達主要組織 相容性復合物(MHC)II類抗原，且不表達或低表達多種移植免疫排斥相關(guān)的共刺激因子，如 ⑶80、⑶40、CD46、⑶40L，是一類免疫缺陷細胞，所以在免疫疾病方面有非常大的治療優(yōu)勢， 可用于移植物抗宿主病(GVHD)，類風濕、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化病等免疫缺陷病，單純hUC-MSC條件培養(yǎng)基具有造血支持功能，并促進CD34+細胞向髓系分化，所以在血液疾病方面MSC 具有很好的治療前景，MSC是目前干細胞研究的熱點之一。
[0003] MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，后來經(jīng)過大量深入的研究，發(fā)現(xiàn)MSC廣泛分布于胎兒和成 體的骨髓、骨膜、松骨質(zhì)、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、臍帶、臍帶血中，其中臍帶來源的 間充質(zhì)干細胞純度高、數(shù)量多，且臍帶的取材方便，不存在倫理問題。
[0004] 臍帶是連于胚胎臍部與胎盤間的索狀結(jié)構(gòu)，外覆羊膜，內(nèi)含靜脈、臍動脈和來自中 胚層的膠樣粘液性結(jié)締組織即沃頓氏膠。大量研究證實臍帶沃頓氏膠中富含豐富的間充質(zhì) 干細胞。
[0005] 當前對臍帶間充質(zhì)干細胞的分離方法很多，目前主要的分離方法是利用膠原酶消 化法和組織塊爬片法分離臍帶間充質(zhì)干細胞，兩種方法都存在一定的弊端，1.消化法因為 臍帶的個體差異以及不可能充分進行消化，原代得到的細胞數(shù)量太少，一根臍帶消化后只 能得到3-5 X IO5個細胞。消化法分離臍帶間充質(zhì)干細胞，存在分離時間長，成本高的問題。 2.爬片法雖然不使用膠原酶可以降低成本，但是細胞爬出時間過長，一般13-15天才可有少 量細胞爬出，影響實驗的研究進度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種皮膚細胞損傷修復試劑的制備方法，本發(fā)明中透明質(zhì) 酸作為細胞損傷修復試劑中的成分之一，是通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)獲得，具有純度高，產(chǎn)量 高等優(yōu)點，可以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，能夠滿足商品化的需求。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0008] 1、一種皮膚細胞損傷修復試劑的制備方法，其特征在于：由下列步驟組成：
[0009] ①取足月健康胎兒臍帶，用膠體金、熒光定量PCR相結(jié)合的方法檢測臍帶血清 HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA，抗-HDV，抗 HEV，抗-HIV-1/2，HI V-I-RNA，CMV-DNA，檢測結(jié)果均為陰 性的臍帶方可使用；
[0010] ②將臍帶從采集瓶中取出，置于無菌平皿中，用無菌手術(shù)剪剪成5cm左右的小段；
[0011] ③將臍帶段浸沒于無菌燒杯中，用PBS反復清洗殘留在血管內(nèi)的血液，直至清洗后 的PBS基本無色為止；
[0012] ④將清洗后的臍帶轉(zhuǎn)移到彎盤中，使用手術(shù)剪或手術(shù)刀將其剪切成l-5mm的小塊， 均勻平鋪到T75培養(yǎng)瓶底部；
[0013] ⑤將平鋪好臍帶組織塊的培養(yǎng)瓶放入二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，干燥30分鐘；
[0014] ⑥往培養(yǎng)瓶中緩慢加入含10%胎牛血清添加物的DMEM/F-12培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的用 量以剛剛浸沒組織塊為宜；
[0015] ⑦每6天換液1次，期間觀察組織貼塊邊緣細胞生長情況，待大多數(shù)組織塊細胞爬 出且每個塊組織塊周圍的細胞生長至80%左右融合時，進行臍帶間充質(zhì)干細胞的原代傳 代；
[0016] ⑧將間充質(zhì)干細胞細胞傳至P4代時，按8000Cells/Cm2的密度接種于T75培養(yǎng)瓶 中，加入IOml DF12完全培養(yǎng)基；
[0017] ⑨待細胞長至80%左右融合時，用5mL PBS緩沖液沖洗細胞表面3次；
[0018] ⑩吸盡PBS緩沖液，加入IOmL DF12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時；
[0019] (Q)收集培養(yǎng)72小時后的臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清，將上清收集到50mL離心管 內(nèi)；
[0020] ?300g，室溫離心5分鐘；
[0021 ] 棄沉淀，收集干細胞培養(yǎng)上清液，用3KD的超濾管對干細胞上清進行濃縮，濃縮 10倍，獲取含有3KD以上分子量的有效干細胞分泌混合因子；
[0022] ?將濃縮后的干細胞分泌混合因子用0.22μπι的濾膜進行過濾，置于無菌瓶中，_ 20°C保存；
[0023] @在干細胞分泌混合因子添加5g海藻糖；
[0024] @在干細胞分泌混合因子添加 Img透明質(zhì)酸，獲得皮膚細胞損傷修復試劑。
[0025]而且，所述海藻糖加入濃度為:5%。
[0026] 而且，所述透明質(zhì)酸加入濃度為：lmg/mL。
[0027] 本發(fā)明的有益效果是：
[0028] 1、本發(fā)明中P4代臍帶間充質(zhì)干細胞具有細胞數(shù)量多，表型穩(wěn)定，且能分泌大量的 混合細胞因子，能夠滿足大規(guī)模生產(chǎn)細胞損傷修復試劑的要求，從而實現(xiàn)將細胞損傷修復 試劑應用于臨床治療皮膚損傷修復的目的。
[0029] 2、本發(fā)明用超濾管對收集的干細胞分泌因子進行超濾濃縮，不僅截留了有效的混 合細胞因子，同時可以增加混合細胞因子的濃度，可以大大縮短皮膚損傷修復的時間，提高 皮膚損傷修復的效果。
[0030] 3、本發(fā)明中干細胞混合分泌細胞因子從干細胞培養(yǎng)過程中獲得，由具有生物活性 的細胞分泌獲得，與化學合成獲得的細胞因子相比，生物活性更強，且應用于臨床，具有更 低的免疫源性。
[0031] 4、本發(fā)明中皮膚相關(guān)細胞的增殖和迀移是損傷皮膚修復過程中的重要環(huán)節(jié)，通過 該發(fā)明配制的細胞損傷修復試劑，可以促進皮膚相關(guān)細胞HSF細胞的增殖和迀移，可以解決 損傷皮膚修復過程中的核心環(huán)節(jié)，為嚴重皮膚損傷患者減輕病痛。
【附圖說明】
[0032] 圖1為不同濃度的干細胞分泌混合因子能夠促進Hacat(圖1-1)、HSF(圖1-2)細胞 的增殖；
[0033]圖2為不同濃度的透明質(zhì)酸在一定程度上能夠促進Hacat(圖2-1)、HSF(圖2-2)細 胞的增殖；
[0034]圖3為皮膚細胞損傷修復試劑能夠促進Hacat(圖3-1)、HSF(圖3-2)細胞的增殖； [0035]圖4為皮膚細胞損傷修復試劑能夠逆轉(zhuǎn)部分因雙氧水誘導的損傷Hacat (圖4-1)、 HSF(圖4-2)細胞的增殖；
[0036]圖5為皮膚細胞損傷修復試劑能夠顯著縮短劃痕的修復時間Hacat(圖5-1)、HSF (圖 5-2)。
【具體實施方式】
[0037] 下面結(jié)合附圖并通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性 的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
[0038] 本發(fā)明提供一種皮膚細胞損傷修復試劑的制備方法，該方法由下列步驟組成：
[0039] ①取足月健康胎兒臍帶，用膠體金、熒光定量PCR相結(jié)合的方法檢測臍帶血清 HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA，抗-HDV，抗 HEV，抗-HIV-1/