專利名稱：：一種用化學(xué)發(fā)光法體外檢測(cè)血液乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種醫(yī)用試劑檢測(cè)方法。特別是一種用化學(xué)發(fā)光法體外檢測(cè)血液乳酸的方法。
背景技術(shù)：
：利用現(xiàn)代生物技術(shù)所開(kāi)發(fā)的超微量測(cè)定方法，極大的推動(dòng)了生物和醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的各項(xiàng)臨床和科研工作的快速發(fā)展，為人類的科學(xué)事業(yè)和社會(huì)進(jìn)步作出了非凡的貢獻(xiàn)。上世紀(jì)七十年代由Arakawa首先發(fā)表了應(yīng)用魯米諾——過(guò)氧化物酶的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行酶免分析的技術(shù)，這一技術(shù)由于靈敏度高(可達(dá)10-ismol)，快速(可在20分鐘內(nèi)出測(cè)定結(jié)果)、簡(jiǎn)便(可實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化)，有效期長(zhǎng)(可達(dá)一年以上)，利于環(huán)保(無(wú)放射性和致畸物質(zhì))而受到普遍歡迎，是目前發(fā)展最迅速的檢測(cè)技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)在免疫分析中已得到相當(dāng)普及的程度，已發(fā)展為能檢測(cè)多種生物活性物質(zhì)的常規(guī)監(jiān)床檢測(cè)方法，從免疫反應(yīng)方式分，該方法有兩種基本類型，即化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)和免疫化學(xué)發(fā)光分析(ICMA);從發(fā)光方式上看，一是將發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記到抗體或抗原上，免疫反應(yīng)后，在起動(dòng)劑的作用下而發(fā)光，另一種是用酶標(biāo)記抗體或抗原，免疫反應(yīng)后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在酶催作用下而發(fā)光。該方法雖有突出的優(yōu)點(diǎn)，但目前僅限于免疫分析，而在生化分析中還是空白，本發(fā)明就是要把化學(xué)發(fā)光這一高級(jí)技術(shù)推廣到生化分析等領(lǐng)域。乳酸在下列情況活性可增高組織嚴(yán)重缺氧、肺功能不全、休克、心失代償、血液病等；在肝臟灌流量降低的病例，亦會(huì)出現(xiàn)乳酸酸中毒?，F(xiàn)在普遍使用的測(cè)定血液中乳酸的方法為比色法，該法是利用LD催化L-乳酸和NAD+生成丙酮酸和NADH，加入硫酸肼捕獲丙酮酸使反應(yīng)完成，生成的NADH與乳酸等摩爾。測(cè)定NADH來(lái)計(jì)算乳酸的含量。該法的不足之處主要有31.線性范圍窄。由于檢測(cè)光吸收，其分辨率不像化學(xué)發(fā)光那么敏感，線性范圍不能完全滿足臨床檢測(cè)的需要，對(duì)高濃度的樣品需要經(jīng)稀釋后測(cè)定，帶來(lái)一定不便。2.靈敏度不如化學(xué)發(fā)光。化學(xué)發(fā)光是測(cè)定光信號(hào)，靈敏度要比測(cè)光吸收高出許多
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏、寬范圍、成本低便于普及而又安全的體外檢測(cè)血液乳酸的方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種用化學(xué)發(fā)光法體外檢測(cè)血液乳酸的方法，其特征在于用乳酸氧化酶使乳酸變成丙酮酸，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，后者在服P催化下使魯米諾發(fā)光，光信號(hào)的大小與乳酸含量成正比，記錄這種光信號(hào)推測(cè)出乳酸的濃度。本發(fā)明的目的還可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)利用LD催化L-乳酸和NAD+生成丙酮酸和NADH，丙酮酸與ADP在丙酮酸激酶(PK)催化下產(chǎn)生ATP，ATP與甘油，在GK催化下生成甘油-3-磷酸及ADP，而甘油-3-磷酸被GP0作用得到H202，HA經(jīng)HPR催化使魯米諾發(fā)光。光信號(hào)的大小與乳酸的濃度呈正相關(guān)，即乳酸濃度越大發(fā)出的光信號(hào)越強(qiáng)。記錄這種光信號(hào)即可推測(cè)乳酸的濃度。用已知濃度的乳酸測(cè)出的光信號(hào)，作出劑量-反應(yīng)曲線，未知樣品的乳酸含量可從該曲線推算出來(lái)。本發(fā)明用化學(xué)發(fā)光物代替顯色物，達(dá)到更靈敏、更穩(wěn)定、范圍寬、更安全的目的。用本發(fā)明方法可以制備相應(yīng)的定量測(cè)定全血、血漿、腦脊液、尿液、胃液等體液中乳酸的商品試劑盒。具體來(lái)講，本發(fā)明與傳統(tǒng)的方法相比有如下優(yōu)點(diǎn)l靈敏度更高。傳統(tǒng)方法是檢測(cè)顏色深淺，而化學(xué)發(fā)光是測(cè)光信號(hào)，可一個(gè)一個(gè)光子計(jì)數(shù)，所測(cè)的最低限更小，因而靈敏度更高。2.線性范圍寬。測(cè)顏色的深淺的分辨率比光子計(jì)數(shù)的精度要低得多，化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)范圍高達(dá)105。3.安全適用?；瘜W(xué)發(fā)光物如魯米諾等很安全，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程無(wú)有害物出現(xiàn)，無(wú)論是檢測(cè)或處理廢物都很安全，有利于環(huán)境保護(hù)。4.便于普及。本發(fā)明所制備的試劑盒，可用于全自動(dòng)測(cè)量，也可用于手工或半自動(dòng)測(cè)量，適宜大、中、小各層次的醫(yī)療和研究機(jī)構(gòu)使用。5.巨大的社會(huì)效益。用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定生化指標(biāo)或免疫物質(zhì)，可同用一臺(tái)化學(xué)發(fā)光儀，不再需要進(jìn)口昂貴的生化儀，節(jié)省大量資金，不只降低了成本，對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)、患者及社會(huì)均大有益處。具體實(shí)施例方式下面舉例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施。方案一反應(yīng)原理乳酸+02+仏0(L0)—丙酮酸+HAHA+魯米諾(HRP)—發(fā)光1.試劑-1.l.乳酸標(biāo)準(zhǔn)單一或系列濃度；1.2.底物液含HRP和L0。2.測(cè)定程序，按下表進(jìn)行，加樣單位為W。標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)20樣品20底物液150150混勻，室溫或3037。C溫育后測(cè)量RLU方案二反應(yīng)原理L-乳酸+NAD+(LD)—NADH+丙酮酸+!T丙酮酸+ADP(PK)—ATP+。。。。甘油+ATP(GK)—甘油-3-磷酸+ADP甘油-3-磷酸+02(GPO)—磷酸二羥丙酮+11202HA+魯米諾(HRP)—發(fā)光1.試劑1.1.乳酸標(biāo)準(zhǔn)單一或系列濃度；1.2.混合酶液，含ADP和甘油；1.3.發(fā)光底物液。2.測(cè)定程序，按下表進(jìn)行，加樣單位為W。標(biāo)準(zhǔn)樣品5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>混勻，室溫或3037t:溫育后測(cè)量RLU3.用適當(dāng)方法處理作出劑量-反應(yīng)曲線，根據(jù)樣品的RLU值從該曲線求出其乳酸的濃度?；蛑苯佑晒角蟪?乳酸濃度=(樣品RLU/標(biāo)準(zhǔn)RLU)X標(biāo)準(zhǔn)濃度4.也可用雙試劑兩步法測(cè)定。權(quán)利要求1、一種用化學(xué)發(fā)光法體外檢測(cè)血液乳酸的方法，其特征在于用乳酸氧化酶使乳酸變成丙酮酸，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，后者在HRP催化下使魯米諾發(fā)光，光信號(hào)的大小與乳酸含量成正比，記錄這種光信號(hào)推測(cè)出乳酸的濃度。2、一種用化學(xué)發(fā)光法體外檢測(cè)血液乳酸的方法，其特征在于利用U)催化L-乳酸和NAD+生成丙酮酸和NADH，丙酮酸與ADP在丙酮酸激酶催化下產(chǎn)生ATP，ATP與甘油，在GK催化下生成甘油-3-磷酸及ADP，而甘油-3-磷酸被GP0作用得到H202，HA經(jīng)HPR催化使魯米諾發(fā)光；光信號(hào)的大小與乳酸的濃度呈正相關(guān)，即乳酸濃度越大發(fā)出的光信號(hào)越強(qiáng)；記錄這種光信號(hào)即可推測(cè)乳酸的濃度；用已知濃度的乳酸測(cè)出的光信號(hào)，作出劑量-反應(yīng)曲線，未知樣品的乳酸含量從該曲線推算出來(lái)。全文摘要一種用化學(xué)發(fā)光法體外檢測(cè)血液乳酸的方法，其特征在于利用LD催化L-乳酸和NAD⁺生成丙酮酸和NADH，丙酮酸與ADP在丙酮酸激酶(PK)催化下產(chǎn)生ATP，ATP與甘油，在GK催化下生成甘油-3-磷酸及ADP，而甘油-3-磷酸被GPO作用得到H₂O₂，H₂O₂經(jīng)HPR催化使魯米諾發(fā)光。光信號(hào)的大小與乳酸的濃度呈正相關(guān)，即乳酸濃度越大發(fā)出的光信號(hào)越強(qiáng)。記錄這種光信號(hào)即可推測(cè)乳酸的濃度。用已知濃度的乳酸測(cè)出的光信號(hào)，作出劑量-反應(yīng)曲線，未知樣品的乳酸含量可從該曲線推算出來(lái)。本發(fā)明用化學(xué)發(fā)光物代替顯色物，達(dá)到更靈敏、更穩(wěn)定、范圍寬、更安全的目的；可制備相應(yīng)的定量測(cè)定全血、血漿、腦脊液、尿液、胃液等體液中乳酸的商品試劑盒。文檔編號(hào)G01N21/76GK101639446SQ20091016985公開(kāi)日2010年2月3日申請(qǐng)日期2009年9月7日優(yōu)先權(quán)日2009年9月7日發(fā)明者京王申請(qǐng)人:福建省洪誠(chéng)生物藥業(yè)有限公司