專利名稱：促進(jìn)生物反應(yīng)的屏障的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及進(jìn)行生物反應(yīng)的系統(tǒng)、裝置和方法。本發(fā)明特別涉及疏水性、水不混溶性或者親脂性屏障在樣品分離、純化、修飾、和分析過(guò)程中的用途。
背景技術(shù)：
有成本效益的、易于使用的用于分析生物樣品的系統(tǒng)、方法和裝置是非常需要 的。許多可商購(gòu)的系統(tǒng)需要花費(fèi)幾萬(wàn)至幾十萬(wàn)美元，且具有許多活動(dòng)部件，使其趨于失 靈。由于這種系統(tǒng)的成本和復(fù)雜性，其使用通常局限于具有支持其運(yùn)行和維持的人員及 業(yè)務(wù)的臨床實(shí)驗(yàn)室。由 Abbott Architect、Siemens Centaur、Roche Elecsys 等所代表的一類充分集成的 自動(dòng)化分析儀進(jìn)行免疫測(cè)定。由 Abbott m2000、Roche COBAS，bioMerieux NucliSENS
等所代表的另一類模塊分析儀進(jìn)行核酸測(cè)定。這些系統(tǒng)的復(fù)雜性大部分是進(jìn)行測(cè)定中所 涉及的分離步驟的結(jié)果。模塊系統(tǒng)也常用于研究實(shí)驗(yàn)室中。免疫測(cè)定分離可以通過(guò)平板洗滌器如Titertek MAP-C2、BioTek ELx50、Tecan PW 96/384等進(jìn)行。核酸分離通過(guò)如下系統(tǒng)進(jìn)行， 如 Applied Biosystems PRISM 6100> Invitrogen iPrep、 Thermo Scientific KingFisher、 Promega Maxwell 等。特別關(guān)注的是可獲得低成本可靠的分析儀，因?yàn)槠渖婕笆澜绶秶鷥?nèi)疾病的診斷 和管理。這個(gè)問(wèn)題由與HIV感染管理相關(guān)的問(wèn)題生動(dòng)地說(shuō)明。存在許多技術(shù)可以檢測(cè) HIV相關(guān)的核酸或者蛋白質(zhì)水平。這種檢測(cè)對(duì)于感染HIV患者護(hù)理的管理非常重要。然 而，這些系統(tǒng)的成本和復(fù)雜性阻止了其廣泛應(yīng)用。發(fā)明概述本發(fā)明涉及進(jìn)行生物反應(yīng)的系統(tǒng)、裝置和方法。本發(fā)明特別涉及疏水性、水或 醇不混溶性或者親脂性屏障在樣品分離、純化、修飾和分析過(guò)程中的用途。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生物樣品純化和/或分析裝置，包括多個(gè) 樣品處理室，其包含用于生物分子或者細(xì)胞純化、修飾、分析和/或檢測(cè)的試劑；以及 在兩或多個(gè)室之間(例如分隔兩或多個(gè)室)的親脂性物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述親 脂性物質(zhì)是蠟。在一些實(shí)施方案中，所述蠟是相變蠟，其可以取液體或者固體形式的預(yù) 定溫度。例如，在一些實(shí)施方案中，所述蠟在貯存或者運(yùn)輸溫度下取固體形式而在反應(yīng)溫度(例如室溫)取液體形式。在一些實(shí)施方案中，所述親脂性物質(zhì)是油。在一些實(shí)施 方案中，有兩個(gè)反應(yīng)室。在一些實(shí)施方案中，有三個(gè)反應(yīng)室。在一些實(shí)施方案中，有四 個(gè)反應(yīng)室。在一些實(shí)施方案中，有五個(gè)反應(yīng)室。在一些實(shí)施方案中，有六個(gè)或者更多個(gè) 反應(yīng)室(例如7、8、9、10、11、……、20個(gè)、……)。在一些實(shí)施方案中，所述親脂 性材料提供了兩或多個(gè)室之間毗鄰的屏障(即樣品從第一個(gè)室直接進(jìn)入所述親脂性材料 以及直接穿過(guò)所述親脂性材料進(jìn)入第二個(gè)室)。在其它實(shí)施方案中，在所述親脂性材料和 一或多個(gè)室之間存在空氣、液體或者其它材料。在這種實(shí)施方案中，所述親脂性材料以 這樣的位置放置，從而使要處理的樣品或者生物分子在某點(diǎn)間穿過(guò)該親脂性材料從第一 個(gè)室轉(zhuǎn)運(yùn)至第二個(gè)室。 在一些實(shí)施方案中，所有或者部分反應(yīng)室專用于樣品純化。例如，一或多個(gè) 反應(yīng)室含有導(dǎo)致發(fā)生樣品純化現(xiàn)象包括但不限于細(xì)胞分解、生物分子捕獲、生物分子分 離，以及細(xì)胞培養(yǎng)、純化和/或分析的試劑。在一些實(shí)施方案中，所有或者部分反應(yīng)室 專用于樣品修飾。例如，一或多個(gè)反應(yīng)室含有導(dǎo)致發(fā)生生物分子(例如核酸、蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)等)或者細(xì)胞修飾現(xiàn)象包括但不限于擴(kuò)增、連接、分裂、標(biāo)記、延伸、降解、與配 體結(jié)合、低聚反應(yīng)、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因、分裂、分化及類似等的試劑。在一些實(shí)施方 案中，所有或者部分反應(yīng)室專用于樣品分析。例如，一或多個(gè)反應(yīng)室含有使得可以對(duì)感 興趣的生物分子或者細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)或者其它類型的分析的試劑或者其它成分。在一些實(shí) 施方案中，所述反應(yīng)室含有可以產(chǎn)生顏色、熒光信號(hào)、發(fā)光信號(hào)或者其它可檢測(cè)特性的 試劑。在一些實(shí)施方案中，將所述反應(yīng)室配置為通過(guò)信號(hào)讀出器(例如顏色讀出器、熒 光讀出器、發(fā)光讀出器、人眼等)來(lái)優(yōu)化信號(hào)檢測(cè)。一或多個(gè)反應(yīng)室可用于多種不同任 務(wù)，包括純化、修飾、分析和/或檢測(cè)。本發(fā)明不受所述反應(yīng)室的配置和與彼此分離的方式所限。所述反應(yīng)室每個(gè)都可 以與另一個(gè)是相同大小和形狀，或者不同大小或形狀?？梢允褂酶鞣N不同的配置。在 一些實(shí)施方案中，所述處理室是孔且所述親脂性屏障位于所述孔的上面或者下面，從而 由一個(gè)室向另一個(gè)室轉(zhuǎn)移的任何材料必須通過(guò)向上或向下以及越過(guò)移動(dòng)來(lái)穿過(guò)親脂性材 料。在一些實(shí)施方案中，所述室通過(guò)親脂性材料的存在而形成。例如，在一些實(shí)施方案 中，將親脂性材料在一或多個(gè)通道中(例如在玻璃、塑料或者陶瓷管中)沿一或多個(gè)點(diǎn)沉 積以在所述一或多個(gè)通道中區(qū)域之間形成屏障。所述通道可以是任何尺寸，包括小尺寸 的如毛細(xì)管或者微流體槽。在一些實(shí)施方案中，將所述室和屏障進(jìn)行配置，從而使感興 趣的樣品或者生物分子必須穿過(guò)線性系列反應(yīng)室。然而，在其它實(shí)施方案中，第一個(gè)反 應(yīng)室中的樣品或者生物分子可任選地跳過(guò)一個(gè)或多個(gè)其它室。在一些實(shí)施方案中，將所 述室放置在裝置中，該裝置具有配置好的大小或者形狀以適合現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)設(shè)備(例如自 動(dòng)化機(jī)械臂、平板支托物(例如96-孔)、熱循環(huán)儀、熒光檢測(cè)儀等)。在一些實(shí)施方案 中，通道用于分隔反應(yīng)室，其中所有或者部分通道含有親脂性材料。例如，在一些實(shí)施 方案中，將所述裝置配置為與96孔或者384孔平板類似，具有連接兩個(gè)更多孔的通道。 在一些實(shí)施方案中，兩個(gè)室之間的路徑含有空氣、水或者其它流體，其中所述樣品在進(jìn) 入或者離開(kāi)所述親脂性材料之前和/或之后穿過(guò)所述空氣、水或者其它流體。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)室是含有親水性溶液的微孔或者微管，而親脂性物質(zhì) 在部分所述室或者在單獨(dú)的室中被置于溶液的上面或者下面。
在一些實(shí)施方案中，所述裝置包括傳送機(jī)制，可以將所希望的材料從一個(gè)反應(yīng) 室中經(jīng)過(guò)親脂性材料轉(zhuǎn)移至另一個(gè)反應(yīng)室中。例如，在一些實(shí)施方案中，在一個(gè)反應(yīng)室 中感興趣的生物分子與磁性顆粒如磁珠結(jié)合。通過(guò)應(yīng)用磁場(chǎng)(例如來(lái)自磁體)使得磁性 顆粒從第一個(gè)室經(jīng)過(guò)親脂性屏障移動(dòng)至第二個(gè)室，從而使感興趣的生物分子從一個(gè)室移 動(dòng)到另一室。在其它實(shí)施方案中，形成電場(chǎng)以使用電荷將生物分子或者與所述生物分子 結(jié)合的成分(例如配體、珠、電荷標(biāo)記等)從一個(gè)反應(yīng)室移動(dòng)至另一反應(yīng)室。在一些實(shí) 施方案中，使用離心 力將感興趣的生物分子從一個(gè)室經(jīng)過(guò)親脂性屏障移至另一室。在一 些實(shí)施方案中，使用來(lái)自真空或者抽吸的壓力在室之間移動(dòng)材料。本發(fā)明不受傳送機(jī)制 的限制。在一些實(shí)施方案中，所述裝置包括蒸汽屏障(vapor barrier)以防止或者減少在處 理或者使用期間的液體損失。在一些實(shí)施方案中，所述裝置由互相疊放在一起的多個(gè)薄 層材料組成。例如，在一些實(shí)施方案中，所述薄層包含夾在塑料層之間的鋁箔層。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置以系統(tǒng)(例如試劑盒)形式提供，其包含可以 進(jìn)行樣品采集、樣品處理、樣品處置、數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)分析以及數(shù)據(jù)提示的一或多種其 它成分。這些成分可以是單獨(dú)的裝置或者可以集成在單一的多成分裝置中。這些成分 可包括但不限于醫(yī)學(xué)裝置、環(huán)境樣品處理裝置、蛋白質(zhì)純化裝置、核酸純化裝置、計(jì)算 機(jī)、軟件等。所述系統(tǒng)或者裝置的一或多個(gè)成分可以是自動(dòng)化的。在一些實(shí)施方案中， 所述系統(tǒng)的一或多個(gè)成分被配置為無(wú)自動(dòng)化運(yùn)行。例如，在非自動(dòng)化系統(tǒng)中，提供手持 磁體將樣品從一個(gè)室移動(dòng)至另一室，使用加熱模塊(heat block)或者水浴產(chǎn)生所希望的反 應(yīng)溫度，使用手持熒光檢測(cè)儀檢測(cè)信號(hào)，或者通過(guò)肉眼觀測(cè)信號(hào)。本發(fā)明的系統(tǒng)和裝置可用于多種樣品。例如，在一些實(shí)施方案中，樣品是生物 或者環(huán)境樣品。生物樣品可得自動(dòng)物(包括人)，并涵蓋液體、固體、組織以及氣體。 生物樣品包括血液產(chǎn)品如血漿、血清等，以及腦脊液、痰液、支氣管洗滌液(bronchial washing)、支氣管抽吸液(bronchial aspirates)、尿液、淋巴液，以及呼吸道、腸道和泌 尿生殖道的各種外分泌物，眼淚、唾液、乳汁、白細(xì)胞、骨髓瘤、生物液如細(xì)胞培養(yǎng)上 清、組織(固定或者未固定的)、細(xì)胞(固定或者未固定)等。環(huán)境樣品包括但不限于環(huán) 境材料，如表面物質(zhì)、土壤、水以及工業(yè)樣品。附圖描述

圖1示出本發(fā)明的一些實(shí)施方案的用于樣品純化和PCR的藥筒(cartridge)。圖 Ia示出原型藥筒。圖Ib示出液體蠟通道的圖樣。圖2示出本發(fā)明一些實(shí)施方案的用于樣品純化的藥筒。圖3示出用于構(gòu)建本發(fā)明一些實(shí)施方案藥筒的箔層壓板(foil laminate)的層。圖4示出用于本發(fā)明一些實(shí)施方案中的箔層壓板藥筒的圖樣。圖5示出(a)永磁體相對(duì)于兩個(gè)不混溶流體的位置，以及(b)在χ和y方向作用 于顆粒上的磁力的表面圖。圖6示出使用落重法(weight drop method)評(píng)估表面張力的實(shí)驗(yàn)安排。圖7示出在基于管的微流體系統(tǒng)中夾層測(cè)定各個(gè)階段的圖示。圖8示出FLl高度對(duì)應(yīng)Log(生物素濃度)的圖示。圖9示出由流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x記錄的事件對(duì)應(yīng)于前向散射、側(cè)向散射和FLl高度的圖示。圖10示出鏈霉抗生物素蛋白包被的磁性顆粒從一個(gè)毛細(xì)管向另一毛細(xì)管的移動(dòng) 及隨后與生物素反應(yīng)的圖示。圖Ila示出在移動(dòng)穿過(guò)含有熒光染料的油之后鏈霉抗生物素蛋白包被顆粒的信 號(hào)。圖lib示出在移動(dòng)穿過(guò)含有熒光染料的油以及隨后在PBS緩沖液中攪動(dòng)該顆粒之后 鏈霉抗生 物素蛋白包被顆粒的信號(hào)。圖12示出在本發(fā)明一些實(shí)施方案中使用的兩室小透明容器(cuvette)的示意圖。圖13示出在本發(fā)明一些實(shí)施方案中使用的兩室小透明容器的示意圖。圖14示出使用不混溶相過(guò)濾(IPF)方法對(duì)來(lái)自血漿的HIV-I進(jìn)行的qRT_PCR 相對(duì)IogltlHIV-I病毒拷貝數(shù)繪制的一式兩份運(yùn)行的4種不同RNA濃度的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖15示出對(duì)比IPF和人工純化方法的Bland-Altman圖實(shí)心黑色方塊示出兩種
方法之間的差異，實(shí)線(y =-0.00772)示出兩種方法之間的平均差異，虛線示出平均值 +2和-2標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。圖16示出通過(guò)來(lái)自尿液樣品衣原體qPCR的IPF量化。圖17示出通過(guò)來(lái)自尿液樣品淋病qPCR的IPF量化。圖18示出對(duì)比衣原體的IPF和人工純化方法的Bhnd-Altrmn圖。圖19示出對(duì)比淋病的IPF和人工純化方法的Bhnd-Altrmn圖。圖20示出對(duì)來(lái)自25 μ L WB的前病毒DNA的IPF PCR。圖21示出對(duì)比IPF和人工純化方法的Bland-Altman圖。定義為了便于理解本發(fā)明的揭示，術(shù)語(yǔ)定義如下。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“親脂性材料”是指在水、醇或者其它親水性或者水成液體 中基本上不混溶的任何物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的親脂性材料對(duì)于干擾特定生 物過(guò)程如核擴(kuò)增或者生物分子檢測(cè)的物質(zhì)具有低溶解性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的 親脂性材料具有低蒸汽壓。親脂性物質(zhì)趨于通過(guò)范德華力與其自身以及與其它物質(zhì)相互 作用。它們具有很小能力乃至沒(méi)有能力形成氫鍵。親脂性物質(zhì)典型具有大o/w(油/水) 分配系數(shù)。術(shù)語(yǔ)“不溶于水”以及“疏水性”材料在本說(shuō)明書(shū)中可同義使用。該術(shù)語(yǔ)包括 在水中幾乎不溶并在揮發(fā)性親脂性溶劑如二氯甲烷以及非揮發(fā)性親水性溶劑特別是N-甲 基吡咯烷酮(NMP)中可自由溶解的聚合物?！八烊苄浴被蛘摺坝H水性”材料是指可以用至少等量部分的水稀釋而不分離 的有機(jī)液體?！八换烊苄浴被蛘摺坝H脂性”材料的性質(zhì)是其不能用至少等量部分的水稀釋 而不分離?！凹兓亩嚯摹被蛘摺凹兓牡鞍踪|(zhì)”或者“純化的核酸”是指感興趣的多 肽或核酸或者其片段，其基本上沒(méi)有與所述感興趣的多肽或者多核苷酸天然結(jié)合的細(xì)胞 成分，例如含有低于大約50%、優(yōu)選低于大約70%、以及更優(yōu)選低于大約90%的所述成 分。
術(shù)語(yǔ)“分離的”是指將所述材料從其原始環(huán)境(例如如果其是天然發(fā)生的，則 為天然環(huán)境)中取出。例如，存在于活動(dòng)物體內(nèi)的天然發(fā)生的多核苷酸或者多肽不是分 離的，但是與一些或者所有天然系統(tǒng)中共存的材料分開(kāi)的相同多核苷酸或者DNA或者多 肽則是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或者多肽可以是 組合物的一部分，且在所述載體或者組合物不是其天然環(huán)境的一部分的情況下仍是分離 的?！岸嚯摹焙汀暗鞍踪|(zhì)”在本文可互換使用，并包括下文描述的所有多肽。多肽的基本結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域熟知且已經(jīng)在本領(lǐng)域的眾多教科書(shū)及其它出版物中有描述。在此背 景下，該術(shù)語(yǔ)在本文是指包含兩個(gè)或更多個(gè)在線性鏈中通過(guò)肽鍵彼此連接的氨基酸的任 何肽或者蛋白質(zhì)。如本文所用，該術(shù)語(yǔ)既是指短鏈通常在本領(lǐng)域也稱作肽、寡肽和寡聚 體，也是指長(zhǎng)鏈通常在本領(lǐng)域稱作蛋白質(zhì)，其有許多類型。應(yīng)意識(shí)到多肽常含有除了通常稱作20個(gè)天然發(fā)生氨基酸的20個(gè)氨基酸之外的 氨基酸，且許多氨基酸、包括末端氨基酸在給定的多肽中可以是修飾的，所述修飾或者 通過(guò)天然過(guò)程如加工及其它翻譯后修飾進(jìn)行，也可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn) 行。盡管在多肽中天然發(fā)生的一般修飾太多以至于不能在此詳盡地列出，但是其在基 礎(chǔ)教科書(shū)中和在更詳細(xì)的專著中以及在眾多研究文獻(xiàn)中有很好的描述，并且為本領(lǐng)域 技術(shù)人員所熟知。在可以出現(xiàn)于本發(fā)明多肽中的已知修飾中，用于舉例提及的有乙酰 化、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)附著、血紅素部分的共價(jià)附著、核苷 酸或者核苷酸衍生物的共價(jià)附著、脂質(zhì)或者脂質(zhì)衍生物的共價(jià)附著、磷脂酰肌醇的共 價(jià)附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價(jià)交聯(lián)形成、胱氨酸形成、焦谷氨 酸形成、甲?；?、Y-羧化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化 (myrisoylation),氧化、蛋白酶解處理、磷酸化、異戊二烯化、外消旋作用、硒化、硫酸 化、轉(zhuǎn)移-RNA介導(dǎo)向蛋白質(zhì)添加氨基酸，如精氨?；?，以及泛素化。這些修飾為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，且已經(jīng)在科學(xué)文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。一些 特別常見(jiàn)的修飾例如糖基化、脂質(zhì)附著、硫酸化、谷氨酸殘基的Y-羧化、羥基化以 及ADP-核糖基化在大部分基礎(chǔ)教科書(shū)中描述，例如Proteins—Structure and Molecular Properties, 2.sup.nd Ed., T.E.Creighton, W.H.Freeman and Company, New York (1993)。 在此問(wèn)題上也有許多詳細(xì)的綜述可用，如例如Wold，F(xiàn).，Posttranslational Protein Modifications Perspectives and Prospects, pg.1—12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C.Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983)、Seifter et al.，Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth.Enzymol.182 : 626-646 (1990)以及 Rattan et al.， Protein synthesis Posttranslational Modifications and Aging, Ann N.Y.Acad. Sci.663 48-62(1992)所述。應(yīng)意識(shí)到且為本領(lǐng)域熟知及如上所述，多肽不總是完全線性的。例如，作為泛 素化的結(jié)果，多肽可以是分支的，且其可以是有或者沒(méi)有分支的環(huán)狀，通常是作為翻譯 后修飾的結(jié)果，包括天然處理結(jié)果以及非天然發(fā)生的人工操控帶來(lái)的結(jié)果。環(huán)狀的、分 支的以及分支環(huán)狀的多肽也可以通過(guò)非翻譯天然過(guò)程合成以及通過(guò)完全合成方法合成。修飾可以在多肽的任何部位發(fā)生，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈以及氨基或者羧基 末端。事實(shí)上，通過(guò)共價(jià)修飾封閉多肽中氨基或者羧基基團(tuán)或者二者在天然發(fā)生的和合成的多肽中是常見(jiàn)的。例如，在大腸桿菌中產(chǎn)生的多肽的氨基末端殘基在蛋白酶解處理 之前幾乎總是N-甲酰甲硫氨酸。在多肽中發(fā)生的修飾通常與其如何產(chǎn)生相關(guān)。例如對(duì)于通過(guò)在宿主中表達(dá)克隆 的基因而產(chǎn)生的多肽而言，修飾的性質(zhì)和程度大部分取決于宿主細(xì)胞翻譯后修飾能力以 及在多肽氨基酸序列中存在的修飾信號(hào)。例如，眾所周知，通常在細(xì)菌宿主如大腸桿菌 中不發(fā)生糖基化。因此，當(dāng)需要糖基化時(shí)，多肽應(yīng)在糖基化宿主、一般為真核細(xì)胞中表 達(dá)。昆蟲(chóng)細(xì)胞通常進(jìn)行與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相同的翻譯后糖基化，且因此昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 已經(jīng)被開(kāi)發(fā)以有效表達(dá)具有糖基化天然模式的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)。相似的考慮適用于其它 修飾。 應(yīng)意識(shí)到相同類型的修飾可以以相同或者不同程度存在于給定多肽的幾個(gè)部 位。給定多肽也可以含有許多類型的修飾。通常，如本文所用，術(shù)語(yǔ)多肽涵蓋了所有這些修飾，特別是通過(guò)在宿主細(xì)胞中 表達(dá)多核苷酸而合成的多肽中存在的那些修飾。術(shù)語(yǔ)“成熟”多肽是指已經(jīng)經(jīng)歷適于所述多肽和起源細(xì)胞的完全的翻譯后修飾 的多肽。特定多肽的“片段”是指這樣的氨基酸序列，其包含衍生自該特定多肽的至少 大約3-5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少大約8-10個(gè)氨基酸以及更優(yōu)選至少大約15-20個(gè)氨基酸。術(shù)語(yǔ)“免疫學(xué)可鑒別”是指也存在于且為指定多肽所特有的表位和多肽的存 在。免疫學(xué)相同性可以通過(guò)抗體結(jié)合和/或結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)確定。表位的獨(dú)特性也可以通過(guò)計(jì) 算機(jī)在已知數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank檢索編碼表位的多核苷酸序列以及通過(guò)與其它已知蛋白質(zhì) 進(jìn)行氨基酸序列對(duì)比而確定。如本文所用，“表位”是指多肽或者蛋白質(zhì)的抗原決定簇?？梢韵胂?，表位在 對(duì)該表位是獨(dú)特的空間構(gòu)象中可包含三個(gè)氨基酸。通常，表位由至少5個(gè)這種氨基酸組 成，而更通常是由至少8-10個(gè)氨基酸組成。檢驗(yàn)空間構(gòu)象的方法為本領(lǐng)域已知，包括例 如X射線結(jié)晶學(xué)和二維核磁共振?！皹?gòu)象表位”是這樣的表位，其包含在免疫學(xué)可識(shí)別結(jié)構(gòu)中氨基酸的特定并列 (juxtaposition)，這種氨基酸以毗鄰或者非毗鄰順序存在于同一多肽上或者存在于不同多 肽上。當(dāng)多肽由于所述多肽中含有的特定表位的抗體識(shí)別能力而與抗體結(jié)合時(shí)，則所 述多肽與抗體是“免疫學(xué)反應(yīng)性的”。免疫學(xué)反應(yīng)性可以通過(guò)抗體結(jié)合確定，更特別是 可通過(guò)抗體結(jié)合動(dòng)力學(xué)和/或通過(guò)使用已知多肽作為競(jìng)爭(zhēng)劑的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)而確定，所述已 知多肽含有抗體所針對(duì)的表位。確定多肽是否與抗體是免疫學(xué)反應(yīng)性的方法為本領(lǐng)域已 知。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“含有感興趣表位的免疫原性多肽”是指天然發(fā)生的感興趣 多肽或者其片段，以及通過(guò)其它方式制備的多肽，例如通過(guò)化學(xué)合成或者在重組生物體 中多肽的表達(dá)。“純化的產(chǎn)物”是指這樣的產(chǎn)物制備物，其已經(jīng)與所述產(chǎn)物正常相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞 組成部分及與可以存在于感興趣的樣品中的其它類型細(xì)胞分離。
如本文所用，“分析物”是測(cè)試樣品中可能存在的待檢測(cè)的物質(zhì)，包括感興趣 的生物分子、小分子、病原體等。分析物可包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷酸靶等。 分析物可在如血液、血漿或者血清、尿液等體液中是可溶的。分析物可以在組織中，在 細(xì)胞表面或者在細(xì)胞內(nèi)。分析物可以在分散于體液如血液、尿液、乳房抽吸液中的細(xì)胞 上或其內(nèi)，或者作為活組織檢查的樣品而獲得。如本文所用，“特異性結(jié)合成員”是指特異性結(jié)合對(duì)的成員。即兩個(gè)不同的分 子，其中一個(gè)分子通過(guò)化學(xué)或者物理方式特異性結(jié)合另一分子。因此，在通常的免疫測(cè) 定的抗原與抗體特異性結(jié)合對(duì)之外，其它特異性結(jié)合對(duì)可包括生物素和抗生物素蛋白、 碳水化合物和凝集素、互補(bǔ)核苷酸序列、效應(yīng)物和受體分子、輔因子和酶、酶抑制劑、 以及酶等。此外，特異性結(jié)合對(duì)可包括是原始特異性結(jié)合成員的類似物的成員，例如分 析物-類似物。免疫反應(yīng)性特異性結(jié)合成員包括抗原、抗原片段、抗體以及抗體片段、 其單克隆和多克隆及復(fù)合物，包括通過(guò)重組DNA分子所形成的那些。特異性結(jié)合成員包括“特異性結(jié)合分子”。“特異性結(jié)合分子”意指任何特異 性結(jié)合成員，特別是免疫反應(yīng)性特異性結(jié)合成員。如此，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合分子”涵 蓋抗體分子(得自多克隆和單克隆制備物)以及如下雜種 (嵌合)抗體分子(見(jiàn)例如 Winter, etal，Nature 349 293-299 (1991)和美國(guó)專利 No.4,816,567) ； F(ab' )jPF(ab) 片段；Fv 分子(非共價(jià)異源二聚體，見(jiàn)例如 Inbar，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69 2659-2662(1972)和 Ehrlich，et al., Biochem.19 4091-4096(1980))；單鏈Fv分子(sFv) (見(jiàn)例如 Huston，et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 5879-5883(1988))；人源化抗體分 子(見(jiàn)例如 Riechmann，etal., Nature 332 323-327 (1988)，Verhoeyan, et al., Science 239 1534-1536(1988)以及1994年9月21日公開(kāi)的英國(guó)專利出版物No.GB2,276,169)； 以及得自這種分子的任何功能片段，其中這種片段保留親代抗體分子的免疫學(xué)結(jié)合性 質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“半抗原”是指部分抗原或者非蛋白質(zhì)結(jié)合成員，其能結(jié)合 抗體，但是除非其與載體蛋白(carrierprotein)結(jié)合否則不能激發(fā)抗體形成。如本文所用，“捕獲試劑”是指未標(biāo)記的特異性結(jié)合成員，其特異于夾層測(cè)定 中的分析物、特異于競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中的指示試劑或者分析物，或者特異于輔助特異性結(jié)合成 員，其自身如在間接測(cè)定中一樣特異于分析物。所述捕獲試劑在進(jìn)行所述測(cè)定之前或 者期間可以直接或者間接結(jié)合于固相材料，從而使得可以從檢測(cè)樣品中分離固定的復(fù)合 物。“指示試劑”包含“產(chǎn)生信號(hào)的化合物”(“標(biāo)記”)，其能夠生成以及產(chǎn)生可 通過(guò)外部方式檢測(cè)的可測(cè)量信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述指示試劑與特異性結(jié)合成員 綴合(附著)。除了是特異性結(jié)合對(duì)的抗體成員之外，所述指示試劑也可以是任何特異性 結(jié)合對(duì)的成員，包括半抗原-抗-半抗原系統(tǒng)如生物素或者抗生物素、抗生物素蛋白或者 生物素、碳水化合物或者凝集素、互補(bǔ)核苷酸序列、效應(yīng)物或者受體分子、酶輔因子和 酶、酶抑制劑或者酶等。免疫反應(yīng)性特異性結(jié)合成員可以是抗體、抗原、或者抗體/抗 原復(fù)合物，其在夾層測(cè)定中能結(jié)合感興趣的多肽、在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中能結(jié)合捕獲試劑或者在 間接測(cè)定中能結(jié)合輔助特異性結(jié)合成員。當(dāng)描述探針和探針測(cè)定時(shí)，可以使用術(shù)語(yǔ)“報(bào) 道分子”。報(bào)道分子包含如上文所述的產(chǎn)生信號(hào)的化合物，其與特異性結(jié)合對(duì)的特異性結(jié)合成員綴合，如咔唑或者金剛烷。預(yù)期的各種“產(chǎn)生信號(hào)的化合物”(標(biāo)記)包括產(chǎn)色原(chromagen)，催化劑如 酶，發(fā)光化合物如熒光素和羅丹明，化學(xué)發(fā)光化合物如二氧環(huán)乙烷(dioxetane)、吖啶鐺 (acridinium)、菲啶鐺(phenanthridinium)以及魯米諾，放射性元素和直接觀測(cè)標(biāo)記。酶
的例子包括堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、半乳糖苷酶及類似等。特定標(biāo)記的選擇 不是關(guān)鍵的，但是其應(yīng)能夠由其自身或者與一或多種其它物質(zhì)一起產(chǎn)生信號(hào)?！肮滔唷?“固體支持物”)為本領(lǐng)域已知的那些，包括反應(yīng)盤的孔壁、試管、 聚苯乙烯珠、磁性或者非磁性珠、硝化纖維條、膜、微粒如乳膠顆粒等。所述“固相” 不是關(guān)鍵的，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。因此，乳膠顆粒、微粒、磁性或者非磁性 珠、膜、塑料管、微滴定孔壁、玻璃或者硅芯片均是合適的例子。預(yù)期到并且在本發(fā)明 范圍內(nèi)的是，所述固相也可包含任何合適的多孔材料。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”可以描述對(duì)可檢測(cè)地標(biāo)記的組合物進(jìn)行的一般性的 揭示或者識(shí)別的行為作用或者特異性的觀測(cè)。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、修飾的RNA 或者DNA、或者RNA或DNA模擬物的聚合物。因此，這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括由天然發(fā)生的核堿 基、糖和共價(jià)核苷酸間(主鏈)鍵組成的多核苷酸，以及具有起相似作用的非天然發(fā)生部 分的多核苷酸。這種修飾的或者取代的多核苷酸為本領(lǐng)域所熟知，且對(duì)于本發(fā)明的目的 而言被稱作“類似物”。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”是指任何含有核酸的分子，包括但不限于DNA 或者RNA。該術(shù)語(yǔ)涵蓋了包括DNA和RNA的任何已知堿基類似物的序列，包括但不 限于4-乙酰-胞嘧啶、8-羥基-Ν6-甲基腺苷、氮雜環(huán)丙基-胞嘧啶、假異胞嘧啶、 5_(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧 啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、Ν6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺 嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基 腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、Ν6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo) 嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮 苷(β-D-mannosylqueosine)、5，-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基 硫-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧基丁氧苷 (oxybutoxosine)、假尿嘧啶、辮苷(queosine)、2-硫胞嘧、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿 嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、 假尿嘧啶、辮苷、2-硫胞嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。術(shù)語(yǔ)“基因”是指核酸(例如DNA)序列，其包含產(chǎn) 生多肽、前體或者RNA(例 如rRNA、tRNA)所必需的編碼序列。多肽可以由全長(zhǎng)編碼序列或者由所述編碼序列的任 何部分編碼，只要保留所希望的其全長(zhǎng)或者片段的活性或者功能性質(zhì)(例如酶活性、配 體結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫原性等)即可。該術(shù)語(yǔ)也涵蓋結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)和在5’和3’ 末端分別與該端距離大約Ikb或更多鄰近編碼區(qū)的序列，由此所述基因相應(yīng)于全長(zhǎng)mRNA 的長(zhǎng)度。位于編碼區(qū)5’端并在mRNA上出現(xiàn)的序列被稱作5’非翻譯序列。位于編 碼區(qū)3’端或者下游并在mRNA上出現(xiàn)的序列被稱作3’非翻譯序列。術(shù)語(yǔ)“基因”涵 蓋了基因的cDNA和基因組形式?；虻幕蚪M形式或者克隆含有由稱作“內(nèi)含子”或者“間插區(qū)”或者“間插序列”的非編碼序列中斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子是基因被轉(zhuǎn)錄到核 RNAChnRNA)內(nèi)的節(jié)段；內(nèi)含子可含有調(diào)節(jié)元件如增強(qiáng)子。內(nèi)含子從核或原始轉(zhuǎn)錄物中 被除去或者“剪除”，因此內(nèi)含子在信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物中缺失。mRNA在翻譯期 間給定新生多肽中氨基酸的序列或者順序。術(shù)語(yǔ)“核酸擴(kuò)增試劑”包括用于擴(kuò)增反應(yīng)的常規(guī)試劑，包括但不限于具有聚合 酶活性的一或多種酶、酶輔因子(如鎂或者煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD))、鹽、緩沖 液、脫氧核苷三磷酸(dNTP ；例如脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸 以及脫氧胸苷三磷酸)以及調(diào)節(jié)聚合酶活性或者引物特異性的其它試劑。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”或者“互補(bǔ)性”用于描述根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)則相關(guān)聯(lián) 的多核苷酸(即核苷酸如寡核苷酸或者靶核酸的序列)?；パa(bǔ)性可以是“部分的”，其中 根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)則僅一些核酸堿基匹配?；蛘?，核酸之間可以是“完全”或者“全部” 互補(bǔ)性。核酸鏈之間的互補(bǔ)性程度對(duì)于核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度具有顯著作用。這 在擴(kuò)增反應(yīng)以及依賴于核酸之間結(jié)合的檢測(cè)方法中是特別重要的。術(shù)語(yǔ)“同源性”是指相同性的程度?？梢杂胁糠滞葱曰蛘咄耆葱浴２?分相同的序列是與另一序列低于100%相同。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜交”用于描述互補(bǔ)核酸的配對(duì)。雜交和雜交強(qiáng)度(即核 酸之間結(jié)合的強(qiáng)度)受這樣的因素影響，即核酸之間互補(bǔ)性的程度、所涉及條件的嚴(yán)格 性、形成雜交體的Tm，以及核酸中G C比率。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“Tm”用于描述“解鏈溫度”。解鏈溫度是在此溫度下雙 鏈核酸分子群變成一半解離為單鏈的溫度。計(jì)算核酸Tm的公式為本領(lǐng)域熟知。如標(biāo)準(zhǔn) 參考所示，當(dāng)核酸在IM NaCl水溶液中時(shí)，對(duì)Tm值的簡(jiǎn)便估計(jì)可以通過(guò)如下公式計(jì)算 Tm = 81.5+0.41 (% G+C)(見(jiàn)例如 Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)。其它參考包括更精密的計(jì)算，其在對(duì)Tm的計(jì)算中 考慮到結(jié)構(gòu)以及序列特性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格性”用于描述溫度、離子強(qiáng)度和其它化合物的存在的 條件，在此條件下進(jìn)行核酸雜交。在“高嚴(yán)格性”條件下，核酸堿基配對(duì)將僅在具有高 頻率互補(bǔ)堿基序列的核酸片段之間發(fā)生。因此，當(dāng)希望雜交或者退火到一起的核酸彼此 不完全互補(bǔ)時(shí)，通常需要“弱”或者“低”嚴(yán)格性條件。術(shù)語(yǔ)“野生型”是指具有分離自天然發(fā)生來(lái)源的基因或者基因產(chǎn)物的特性的基 因或者基因產(chǎn)物。野生型基因是在群體中最常觀測(cè)到的，并因此被專稱作基因的“正 ?！被蛘摺耙吧汀毙问?。相反，術(shù)語(yǔ)“修飾的”或者“突變體”是指當(dāng)與野生型基 因或者基因產(chǎn)物對(duì)比時(shí)在序列和/或功能性質(zhì)(即改變的特性)中呈現(xiàn)修飾的基因或者基 因產(chǎn)物。注意的是天然發(fā)生的突變體可以是分離的；這些通過(guò)這樣的事實(shí)鑒別即當(dāng)與 野生型基因或者基因產(chǎn)物相比時(shí)其具有改變的特性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”定義為包含兩或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖 核苷酸的分子，優(yōu)選至少5個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少大約10-15個(gè)核苷酸以及更優(yōu)選至少大 約15-30個(gè)核苷酸或者更長(zhǎng)。精確大小取決于許多因素，這些因素又繼而取決于寡核苷 酸的最終功能或者用途。寡核苷酸可以以任何方式產(chǎn)生，包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、逆 轉(zhuǎn)錄或其組合。
由于單核苷酸以如下方式反應(yīng)產(chǎn)生寡核苷酸，即一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5’磷酸 通過(guò)磷酸二酯鍵在一個(gè)方向與其相鄰的3’氧原子附著，如果其5’磷酸未與單核苷酸戊 糖環(huán)的3’氧原子連接，則將寡核苷酸的末端稱作“5’末端”，如果其3’氧原子未與 隨后的單核苷酸戊糖環(huán)的5’磷酸連接，則將寡核苷酸的末端稱作“3’末端”。如本文 所用，即使核酸序列位于較大的寡核苷酸的內(nèi)部，也可以稱其具有5’和3’末端。當(dāng) 以5’至3’方向沿著核酸鏈行進(jìn)時(shí)，如果沿核酸鏈的第一個(gè)區(qū)域的3’末端在第二個(gè)區(qū) 域的5’末端之前，則稱第一個(gè)區(qū)域在另一區(qū)域的上游。當(dāng)兩個(gè)不同的非重疊的寡核苷酸退火至相同線性互補(bǔ)核酸序列的不同區(qū)域并且 一個(gè)寡核苷酸的3’末端朝向另一個(gè)的5’末端時(shí)，前者可以稱作“上游”寡核苷酸， 后者稱作“下游”寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)“引物”是指這樣的寡核苷酸，當(dāng)將其置于引物延伸起始的條件下時(shí)能發(fā) 揮作為合成的起始點(diǎn)的作用。寡核苷酸“引物”可在如純化的限制性消化中天然發(fā)生， 或者可以合成產(chǎn)生。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及進(jìn)行生物反應(yīng)的系統(tǒng)、裝置和方法。本發(fā)明特別涉及親脂性屏障在 樣品分離、純化、修飾和分析過(guò)程中的用途。如果需要，本發(fā)明的系統(tǒng)、裝置和方法可以配置為便宜且易于使用的樣品純化 和/或修飾和/或分析和/或檢測(cè)系統(tǒng)。例如，本文描述的本發(fā)明的實(shí)施方案提供了 經(jīng)濟(jì)的方法用于廣泛的生物分子檢測(cè)、分析和鑒定。這些系統(tǒng)、裝置和方法具有許多用 途。為了舉例說(shuō)明本發(fā)明的方面和益處，下文提供了其在核酸和蛋白質(zhì)分析、特別是監(jiān) 測(cè)HIV感染和狀態(tài)中的應(yīng)用。本發(fā)明不限于這些舉例說(shuō)明性的實(shí)施方案。在一些實(shí)施方 案中，本發(fā)明的系統(tǒng)、裝置和方法與現(xiàn)有復(fù)雜昂貴的樣品分離、純化、修飾和分析設(shè)備 一起應(yīng)用。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于在使用傳統(tǒng)設(shè)備(例如熱循環(huán) 儀、質(zhì)譜分析儀、NMR裝置等)修飾和/或分析之前進(jìn)行樣品分離(例如核酸或者多肽 純化)。有三千五百萬(wàn)成年人和兒童忍受HIV/AIDS，其中兩千兩百萬(wàn)在撒哈拉沙漠以南 非洲。在非洲一般的診所治療大約400名患者，而運(yùn)輸?shù)膯?wèn)題導(dǎo)致診所數(shù)目增加而不是 大型中心機(jī)構(gòu)的增長(zhǎng)。因此，需要超過(guò)100,000臺(tái)病毒負(fù)荷測(cè)量?jī)x器。目前可利用的病 毒負(fù)荷測(cè)定的主要局限包括所需儀器的成本、復(fù)雜耗時(shí)的程序，導(dǎo)致需要高度培訓(xùn)的人 員及需要試劑的低溫運(yùn)輸?？韶?fù)擔(dān)的簡(jiǎn)便HIV病毒負(fù)荷測(cè)定的開(kāi)發(fā)是在發(fā)展中國(guó)家改善AIDS患者護(hù)理質(zhì) 量的關(guān)鍵步驟。這需要將通常在中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的自復(fù)雜診斷程序自動(dòng)化成小的床旁 (POC)裝置；這個(gè)能力可以準(zhǔn)許衛(wèi)生保健工作人員和患者即使在最遠(yuǎn)程情況下也獲得重 要健康相關(guān)信息。所需的HIV病毒負(fù)荷測(cè)定應(yīng)優(yōu)選在床旁給予答復(fù)，但是將其從遠(yuǎn)程中 心實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移至距患者較近的社區(qū)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室將改善結(jié)果。這種裝置將以短的周轉(zhuǎn)時(shí)間 和可負(fù)擔(dān)的成本進(jìn)行HIV的分離、擴(kuò)增和檢測(cè)。短時(shí)是關(guān)鍵，因?yàn)檫@樣將減少門診需要 的機(jī)器數(shù)量以及縮短患者在門診花費(fèi)的時(shí)間，從而降低實(shí)際成本。當(dāng)在中心實(shí)驗(yàn)室及外出到現(xiàn)場(chǎng)(out in the field)進(jìn)行HIV病毒負(fù)荷測(cè)定時(shí)必須克
服許多挑戰(zhàn)。大的實(shí)驗(yàn)室使用自動(dòng)化或者半自動(dòng)化機(jī)器人系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行大體積HIV病毒負(fù)荷測(cè)定。然而，樣品處理是這些檢測(cè)的典型地最麻煩部分。目前，樣品處理程序包括許 多步驟，通常需要離心和提取步驟。這些方法通常也不足以純化靶核酸。其通常在反應(yīng) 混合物中遺留抑制性或者干擾物質(zhì)，引起擴(kuò)增反應(yīng)的抑制以及導(dǎo)致假陰性結(jié)果。目前樣 品處理技術(shù)的人工操作性質(zhì)也可導(dǎo)致標(biāo)本交叉污染，其可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。已經(jīng)進(jìn)行可觀的嘗試試圖使樣品制備過(guò)程自動(dòng)化，因?yàn)檫@樣可以更廣泛使用 PCR或者其它核分析技術(shù)。然而，現(xiàn)有的自動(dòng)化高通量系統(tǒng)進(jìn)行多個(gè)提取和純化步驟， 且仍需要某些人工制備，包括樣品和試劑裝載以及廢棄物去除。因此，需要高度培訓(xùn)的 技術(shù)人員來(lái)進(jìn)行測(cè)定和維護(hù)儀器。自動(dòng)化系統(tǒng)非常昂貴，因?yàn)槠涫褂脧?fù)雜的機(jī)械臂來(lái)轉(zhuǎn) 移溶液或者磁性顆粒以及使用精確儀器來(lái)對(duì)液體進(jìn)行移液。自動(dòng)化系統(tǒng)的成本通常難以 適合較小的實(shí)驗(yàn)室，尤其是在資源有限的那些實(shí)驗(yàn)室。交叉污染也是一個(gè)問(wèn)題，因?yàn)槠?應(yīng)用擴(kuò)增技術(shù)。臨床實(shí)驗(yàn)室通常使用單獨(dú)的室進(jìn)行試劑制備、樣品制備、擴(kuò)增和擴(kuò)增后 分析。由于這些原因，盡管已自動(dòng)化，病毒負(fù)荷檢測(cè)在臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案(CLIA)中 仍被認(rèn)為是高復(fù)雜性測(cè)試。迄今為止，對(duì)于免除CLIA的狀況(CLIA-waived status)還沒(méi) 有合格的核酸測(cè)試(NAT)系統(tǒng)，大部分是由于使樣品制備和試劑處理自動(dòng)化中的困難所 致。進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)使用或者接近患者的NAT涉及甚至更多挑戰(zhàn)，尤其是因?yàn)槠洳豢杀苊?地由經(jīng)驗(yàn)較少的使用者在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了如下系統(tǒng)用于在現(xiàn)場(chǎng)部 署 NAT。Cepheid(Sunnyvale, CA)的GeneXpert系統(tǒng)是最早的基于PCR的儀器之一，其
集成了樣品制備、擴(kuò)增和檢測(cè)?？蓲仐壭缘膯未螠y(cè)試GeneXpert樣品制備藥筒(cartridge) 由四個(gè)功能部件組成蓋子、筒體、閥門體組件以及小體積PCR反應(yīng)管。筒體內(nèi)部分為 許多各種大小和功能的室，一些室含有凍干的試劑珠，并且每個(gè)在底部均具有一個(gè)開(kāi)口 (port)用于流體流入和流出。所述室圍繞中心的注射桶成放射狀排列。閥門體組件位于 筒體下面，是細(xì)胞分解和DNA純化部位，在軟件控制下，儀器上的旋轉(zhuǎn)閥使得閥門體組 件移動(dòng)，從而使流體可以從合適的室內(nèi)吸出或者分配至其中，用于根據(jù)程序化測(cè)定方案 來(lái)進(jìn)行混合、稀釋和洗滌。反應(yīng)管突出于筒體外，接受制備的樣品并連接PCR反應(yīng)器以 進(jìn)行靶分析物的擴(kuò)增和檢測(cè)。為了在GeneXpert系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)試，操作者打開(kāi)筒蓋，將 液體樣品裝載入樣品室內(nèi)。當(dāng)操作者關(guān)閉蓋時(shí)，所述藥筒在整個(gè)檢測(cè)程序和生物毒害清 除中被持久密封，消除樣品交叉污染的任何風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)在藥筒下直接產(chǎn)生的超聲攪動(dòng)閥 門體組件中的微小玻璃珠而使細(xì)胞分解。提取的DNA流入含有固定化DNA探針的微流 體通道中，DNA作為細(xì)胞碎片流經(jīng)所述探針。之后結(jié)合的DNA被從其附著部位釋放并 洗脫以進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由 IQuum Inc (Allston，MA)開(kāi)發(fā)的另一系統(tǒng)是 Liat Molecular Analyzer，基于其 專有的lab-in-a-tube(Liat)技術(shù)平臺(tái)。所述Liat試管使用柔性試管作為樣品容器，并在 試管節(jié)段中含有預(yù)先包裝的所有測(cè)定試劑。單位劑量試劑和內(nèi)部對(duì)照物可以通過(guò)使用可 剝離的封條以用于測(cè)定的順序分別地置于一系列試管節(jié)段中。所述可剝離的封條通過(guò)塑 料試管的熱焊接形成。通過(guò)對(duì)鄰近每個(gè)封條的試管節(jié)段施加壓力，所述封條可爆開(kāi)而釋 放試劑。在Liat分析儀中，多個(gè)樣品處理器模塊與Liar試管排列在一起。每個(gè)模塊由 執(zhí)行器(actuator)和夾具組成，其位置可被控制以操縱試管內(nèi)的測(cè)試樣品。可收回的磁體附著于一個(gè)模塊以操縱磁珠。當(dāng)將試管裝載入分析儀中時(shí)，所述執(zhí)行器和夾具相繼擠壓 試管以使試劑和對(duì)照物從一個(gè)節(jié)段移動(dòng)到另一個(gè)。相似地，通過(guò)同步執(zhí)行器與夾具的動(dòng) 作，可以在試管內(nèi)進(jìn)行各種樣品處理過(guò)程。這些過(guò)程包括調(diào)節(jié)節(jié)段中的液體體積；釋放 試劑至相鄰節(jié)段；混合試劑與樣品；在給定溫度攪動(dòng)并溫育反應(yīng)混合物；以及洗滌及從 節(jié)段中除去廢棄物。廢棄物移向蓋子中的廢棄物室，而純化的樣品移向該管的更下層。 在最下面的室內(nèi)，釋放的DNA被擴(kuò)增。用于現(xiàn)場(chǎng)使用的其它商業(yè)化實(shí)時(shí)PCR裝置包括Idaho Technology Inc. (Salt Lake City)提供的 Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device、 Lawrence Livermore National Laboratory (Livermore, CA)提供的 Hand-HeldAdvanced Nucleic Acid Analyzer, 以及Smiths Detection (Pine Brook，NJ)提供的Bio-Seeq檢測(cè)儀。然而，這些裝置不具有
自動(dòng)化樣品制備和試劑處理功能。上述系統(tǒng)是在正確方向上的步驟。然而，GeneXpert在操作上仍具有一定復(fù)雜性，并需要經(jīng)培訓(xùn)的技術(shù)人員操作。由于其需要使用者現(xiàn)場(chǎng)移液，因此需要精確測(cè)量?jī)x 器，這進(jìn)一步增加了該系統(tǒng)成本。盡管Liar MolecularAnalyzer不包括在現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量精確液 體體積，但是由于需要復(fù)雜機(jī)械系統(tǒng)以精確移動(dòng)流體而成本較高。Liat試管難以生產(chǎn)， 使得質(zhì)量控制較難。所述試管難以貯存且具有滲漏問(wèn)題。小量的分子如蛋白質(zhì)和化學(xué)試劑的受控移動(dòng)和輸送代表了微流體技術(shù)中的一個(gè) 現(xiàn)有的挑戰(zhàn)，且對(duì)于開(kāi)發(fā)POC裝置如HIV病毒負(fù)荷裝置有關(guān)鍵重要性。大多數(shù)微流體系 統(tǒng)依賴于流體運(yùn)動(dòng)以使分子溶液從一個(gè)部位移向另一部位，結(jié)果這些系統(tǒng)非必須地消耗 溶劑和材料且涉及控制流體流動(dòng)的復(fù)雜機(jī)械系統(tǒng)。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了另外的方法 解決此問(wèn)題，該方法使用磁性微粒作為載體使分子從一個(gè)反應(yīng)介質(zhì)移至下一介質(zhì)并從該 系統(tǒng)中去除了所有的流體流。其中磁性顆粒由磁力操縱的這種方法使得可以進(jìn)行復(fù)雜的 化學(xué)反應(yīng)，如以低成本在密封藥筒中進(jìn)行的病毒負(fù)荷測(cè)試。由于該反應(yīng)中的驅(qū)動(dòng)力是磁 場(chǎng)，因此該系統(tǒng)可以是自動(dòng)化的，使得可以構(gòu)建便攜可靠系統(tǒng)進(jìn)行病毒負(fù)荷測(cè)試而無(wú)污 染問(wèn)題。雖然當(dāng)前系統(tǒng)舉例用于HIV病毒RNA的樣品純化，但是該平臺(tái)可輕易地?cái)U(kuò)展 至其它核酸測(cè)試和免疫測(cè)定，以及其它感興趣的生物分子或者非生物分子的檢測(cè)。本發(fā)明的實(shí)施方案提供了用于在單一儀器中進(jìn)行樣品純化和分析測(cè)定的裝置。 在一個(gè)舉例的實(shí)施方案中(見(jiàn)例如實(shí)施例1)，其包括使用磁性顆粒作為固相以捕獲 RNA,隨后純化及釋放RNA以進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。常規(guī)裝置通過(guò)交換與固相接觸的溶液而進(jìn)行測(cè)定。所述固相可以是微滴定孔、 微粒或者包裝的柱。即使當(dāng)固相是順磁性顆粒(PMP)時(shí)，也典型在單一容器中通過(guò)磁性 捕獲微粒并交換溶液來(lái)進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明的實(shí)施方案使用多個(gè)室容納測(cè)試樣品和基于水 或者水_醇混合物洗滌緩沖液以及進(jìn)行分析的緩沖液。室內(nèi)的基于水的溶液由與該溶液 不混溶的親脂性材料(例如蠟或者油)分隔。在一些實(shí)施方案中，使用蠟材料和孔進(jìn)行 舉例說(shuō)明。不同孔中的蠟彼此連接形成蠟通道(圖1)。所述蠟可以是固化的以便于貯存 和運(yùn)輸。在測(cè)定期間，使蠟熔化并將PMP拖入蠟中，并通過(guò)將其從一個(gè)室穿過(guò)蠟移至另 一室。磁場(chǎng)用于產(chǎn)生移動(dòng)PMP及使其穿過(guò)基于水的溶液與蠟之間界面所需要的力。最 大的力用于移動(dòng)顆粒經(jīng)過(guò)該界面并使用柔性頂部平板以使磁體接近該界面并降低產(chǎn)生所 述力所需的磁體的強(qiáng)度。
移動(dòng)PMP而非液體消除了在自動(dòng)化處理器中對(duì)泵和抽吸器的需要以及對(duì)培訓(xùn)技 術(shù)人員等分液體的需要。蠟的使用消除了對(duì)在床旁分析儀中使用的單次使用測(cè)試藥筒中 室之間閥門的需求。通過(guò)減少?gòu)囊粋€(gè)孔轉(zhuǎn)至(carryover)下一孔的液體量也減少了從一個(gè) 室轉(zhuǎn)至下一室的抑制劑的量。由于用于移動(dòng)顆粒的力是磁力，因此該系統(tǒng)可以是完全密 閉的，顯著降低了污染風(fēng)險(xiǎn)，污染是靈敏性測(cè)定如PCR的主要問(wèn)題。I.裝置 如上所述，本發(fā)明提供了產(chǎn)生和使用低成本裝置進(jìn)行樣品制備和分析的能力。 在一些實(shí)施方案中，所述裝置是單次使用或者多次使用和可拋棄性的。在一些實(shí)施方案 中，所述裝置使用塑料(或者其它材料)藥筒，其包含多個(gè)樣品處理(例如樣品制備和/ 或分析)孔。每個(gè)孔包含用于樣品制備或者分析的試劑。試劑的性質(zhì)依賴于所使用的特 定樣品及分析方法。在一些實(shí)施方案中，所述藥筒由化學(xué)惰性且提供適當(dāng)機(jī)械強(qiáng)度的任 何材料組成。在一些實(shí)施方案中，所述藥筒使用箔層壓板構(gòu)造，其包含用作蒸汽屏障目 的的鋁層以及與試劑接觸的惰性聚合物層。在涉及RNA純化和分析的實(shí)施方案中(例如 病毒檢測(cè)或者荷載測(cè)定)，優(yōu)選所述藥筒是無(wú)RNA和RNAse的。本領(lǐng)域已知的滅菌方法 可用于在使用之前對(duì)所述藥筒進(jìn)行滅菌。本發(fā)明實(shí)施方案的藥筒用分隔樣品處理室的材料覆蓋。在一些實(shí)施方案中，所 述材料是親脂性材料，其具有相變特性且與樣品制備和分析的試劑以及樣品中可干擾擴(kuò) 增和檢測(cè)的物質(zhì)不混溶。在一些實(shí)施方案中，所述材料是蠟。在一些實(shí)施方案中，所 述蠟在室溫是液體。在其它實(shí)施方案中，所述蠟在室溫是固體而在適于反應(yīng)的溫度是液 體。在其它實(shí)施方案中，所述親脂性材料是油。所述親脂性材料可以在使用溫度、大小 排阻、穩(wěn)定性等方面加以選擇以最適用于感興趣的特定分子。在一些實(shí)施方案中，所述親脂性材料分隔樣品處理室。在其它實(shí)施方案中，所 述親脂性材料位于室之間，但是在室之間不形成物理屏障。在這種實(shí)施方案中，樣品在 穿過(guò)所述親脂性材料之前或者之后可以穿過(guò)空氣或者其它試劑。本發(fā)明不限于特定的親脂性材料。在一些實(shí)施方案中，親脂性材料在水和醇中 不混溶，在水中呈現(xiàn)出低溶解性(例如ppm)，是化學(xué)惰性的，具有與測(cè)定處理相適合的 熔點(diǎn)和沸點(diǎn)(例如全氟化己烷(perfluorohexame)具有56 °C的bp)，具有與水不同的比重 (例如在水中漂浮或者下沉)，具有低膨脹系數(shù)，以及在50°C長(zhǎng)期穩(wěn)定(例如幾周、幾個(gè) 月或者幾年)?？捎糜诒景l(fā)明實(shí)施方案中的可商購(gòu)親脂性材料包括但不限于Chill-OutH蠟(MJ Research)，石蠟蠟如IGI 1070A,微晶蠟如IGI Micosere 5788A，大豆和棕櫚蠟如IGI R2322A，蠟燭蠟如IGI 6036A，熱固性蠟如IGI Astorstat75，熱熔性膠粘劑，無(wú)規(guī)聚丙烯
和聚烯烴化合物，石油蠟以及牙科用蠟。在其它實(shí)施方案中，使用天然蠟如動(dòng)物蠟(例如蜂蠟、羊毛脂或者)牛脂，植物 蠟(例如巴西棕櫚蠟、大戟蠟和大豆蠟)或者礦物質(zhì)蠟如化石或者泥土(例如地蠟或者褐 煤蠟)或者石油蠟(例如石蠟或者微晶蠟)。在其它實(shí)施方案中，使用合成的(人造)蠟 如乙烯(ethylenic)聚合物(例如聚乙烯或者多元醇醚-酯)、氯化萘或者碳?xì)浠衔镱愋?蠟(例如 Fischer-Tropsch)。在一些實(shí)施方案中，使用油如礦物質(zhì)油、石蠟油、硅油、氟硅氧烷、氟代烴油(例如來(lái)自3M的Fluorinert FC-40)、全氟化碳液(例如來(lái)自F2Chemicals的Flutec Fluids)、全氟萘烷(例如來(lái)自 Aldrich 的 P9900，F(xiàn)lutecPP6, FluoroMed APF-140HP)、全 氟全氫化菲(perfluoroperhydrophenanthrene)(例如 FluoroMed APF-2I5M)或者全氟化辛基 溴(perfluorooctylbromide)(例如 FluoroMed APF-PF0B)。其它的屏障材料包括但不限于1，4-二惡烷、乙腈、乙酸乙酯、叔丁醇、環(huán)己 酮、二氯甲烷、叔戊醇、叔丁基甲基醚、丁基乙酸酯、己醇、硝基苯、甲苯、辛醇、辛 烷、碳酸丙烯酯以及環(huán)丁砜(見(jiàn)例如 Chin et al.，Biotechnology and Bioengineering 44 140(1994)，以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文)。
在進(jìn)一步實(shí)施方案中，使用離子性液體(例如BMIM[PF6]、BMIM[Tf2N]和
0MA[TGN]，其中BMIM-雙(三氟甲烷磺?；?亞胺，PF6 = 1-η_ 丁基-3-甲基咪唑 六氟磷酸酯/鹽，TfN2 =雙(三氟甲基磺酰基)亞胺，以及OMA =甲基三辛基銨)作 為屏障材料。在其它實(shí)施方案中，使用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽/酯EC0ENG 21M、 1-乙基-3-羥基甲基批啶鐺硫酸乙酉旨(l-Ethy:i-3-hydroxymethylpyridinium ethylsulfate)、丁基甲基吡咯烷鐺雙(三氟甲基磺酰基)亞胺(Butylmethylpyrrolidinium bis (trifluoromethylsulfonyl) imide)、EC0ENG 212 或者 ECOENG 111IP (均可從 Solvent Innovations獲得)作為屏障材料。所述裝置的不同隔間中提供的試劑可以是進(jìn)行樣品制備和分析的任何試劑。例 子包括但不限于細(xì)胞裂解緩沖液、洗滌緩沖液、親和性試劑、洗脫緩沖液以及用于生 物測(cè)定的反應(yīng)成分。本發(fā)明的裝置適于純化各種生物分子，包括但不限于核酸(例如 RNA,基因組DNA、寡核苷酸等)、蛋白質(zhì)(例如肽、肽片段、寡聚蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合 物、膜蛋白等)以及抗體。本發(fā)明的裝置適于進(jìn)行任何數(shù)目的生物測(cè)定，包括但不限于 RNA或者DNA擴(kuò)增(例如PCR、TMA、NASBA)、核酸檢測(cè)(例如雜交測(cè)定)以及免 疫測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，所述裝置包括將樣品從該裝置的一個(gè)隔間轉(zhuǎn)運(yùn)至下一隔間 的部件。在一些實(shí)施方案中，樣品與磁珠結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)部件是磁體。在其它實(shí)施方案中， 轉(zhuǎn)運(yùn)部件產(chǎn)生電流以轉(zhuǎn)運(yùn)樣品。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，使用離心力轉(zhuǎn)運(yùn)樣品，轉(zhuǎn)運(yùn)部件 產(chǎn)生這種力(例如通過(guò)移動(dòng)該裝置產(chǎn)生)。在其它實(shí)施方案中，使用比重大于水的流體， 從而該流體不用機(jī)械干預(yù)而流動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，所述裝置包括檢測(cè)部件以檢測(cè)標(biāo)記的或者另外存在的生物 樣品或者測(cè)定產(chǎn)物。例子包括但不限于分光光度計(jì)、質(zhì)譜分析儀、NMR、顯微鏡等。在 一些實(shí)施方案中，從該裝置的最后隔間直接對(duì)產(chǎn)物讀數(shù)(例如使用用于分光術(shù)的窗)。在 其它實(shí)施方案中，從所述裝置取出產(chǎn)物(例如使用該裝置的自動(dòng)化部件)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)一步提供了這樣的裝置，其包含由親脂性材料“壁”分隔 的反應(yīng)物的流動(dòng)室(例如垂直柱)，所述“壁”防止反應(yīng)物混合但是允許微粒通過(guò)(例如 由磁體轉(zhuǎn)運(yùn)的磁性顆粒)。在一些實(shí)施方案中，所述裝置及其應(yīng)用是自動(dòng)化的。自動(dòng)化系統(tǒng)包括樣品純化 和分析裝置、移動(dòng)樣品通過(guò)該裝置的轉(zhuǎn)運(yùn)部件，以及足夠或者用于過(guò)程自動(dòng)化的任何其 它必需部件(例如預(yù)處理試劑和樣品轉(zhuǎn)運(yùn)或者分析后檢測(cè)或者進(jìn)一步分析部件)。在使用磁性轉(zhuǎn)運(yùn)的一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)部件包含在該裝置的室之間移動(dòng)的磁體。在其它實(shí)施 方案中，所述裝置相對(duì)于靜止磁體或者其它轉(zhuǎn)運(yùn)裝置而移動(dòng)。II.方法如上所述，本發(fā)明提供了樣品制備和分析裝置及使用所述裝置的方法。A.樣品根據(jù)本發(fā)明揭示的方法，可以檢測(cè)懷疑含有待純化和/或分析的預(yù)期材 料的任 何樣品。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是生物樣品。這種樣品可以是細(xì)胞(例如懷疑 感染了病毒的細(xì)胞)、組織(例如活組織檢查樣品)、血液、尿液、精液，或者其一部分 (例如血漿、血清、尿液上清、尿液細(xì)胞沉淀或者前列腺細(xì)胞)，其可以得自患者或者其 它生物材料來(lái)源，例如尸檢組織樣品或者法醫(yī)學(xué)材料。在將樣品與裝置接觸之前或者作為裝置或者自動(dòng)化系統(tǒng)的一個(gè)部件，樣品可以 被處理以分離或者富集樣品的所希望分子。使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐的各種技術(shù)可用于此目 的，如例如離心、免疫捕獲、細(xì)胞裂解以及核酸靶捕獲。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明實(shí)施方案的方法用于純化和/或分析完整細(xì)胞(例如 原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞)。B.純化方法在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置用于樣品制備和純化。可以利用任何合適的 純化方法，包括但不限于靶捕獲、洗滌、沉淀等等。在一些實(shí)施方案中，樣品純化完全 在所述裝置中進(jìn)行，且不需要任何額外的純化步驟。純化可以在一或多個(gè)反應(yīng)室中進(jìn) 行。這樣將降低純化的復(fù)雜性以及減少成本。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到具體的純化方法取 決于靶生物樣品的性質(zhì)。C.修飾/分析/檢測(cè)純化的樣品可以通過(guò)使用任何合適方法檢測(cè)，包括但不限于本文揭示的那些方 法。下文舉例描述了針對(duì)生物分子如核酸和蛋白質(zhì)的示例技術(shù)。根據(jù)希望或者需要，其 它技術(shù)可用于生物分子或者非生物分子。i.核酸檢測(cè)核酸修飾/分析/檢測(cè)方法的例子包括但不限于核酸測(cè)序、核酸雜交以及核酸擴(kuò) 增。用于舉例說(shuō)明的非限制性核酸測(cè)序技術(shù)的例子包括但不限于鏈終止子(Sanger)測(cè)序 和染料終止子測(cè)序。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到由于RNA在細(xì)胞中較不穩(wěn)定且更易于受核 酸酶攻擊，因此實(shí)驗(yàn)上RNA在測(cè)序之前通常被逆轉(zhuǎn)錄為DNA。用于舉例說(shuō)明的非限制 性核酸雜交技術(shù)的例子包括但不限于原位雜交(ISH)、微陣列以及Southern或者Northern 印跡。核酸可以在檢測(cè)之前或者在檢測(cè)同時(shí)被擴(kuò)增。用于舉例說(shuō)明的非限制性核酸擴(kuò)增技術(shù)的例子包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) >逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、連接酶鏈反應(yīng) (LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)以及基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意 識(shí)到某些擴(kuò)增技術(shù)(例如PCR)需要在擴(kuò)增前將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA (例如RT-PCR)，而 其它擴(kuò)增技術(shù)直接擴(kuò)增RNA (例如TMA和NASBA)。聚合酶鏈反應(yīng)(美國(guó)專利Νο.4,683,195、4,683,202、4,800,159 和 4,965,188， 每個(gè)專利均以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文)，通常稱作PCR，其使用多次循環(huán)的變性、引物對(duì)與相反鏈退火以及引物延伸，使得靶核酸序列的拷貝數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)。在稱作 RT-PCR的變化中，逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)用于從mRNA中產(chǎn)生互補(bǔ)DNA(cDNA)，然后通過(guò) PCR擴(kuò)增該cDNA產(chǎn)生DNA的多個(gè)拷貝。關(guān)于其它各種PCR的變化，見(jiàn)例如美國(guó)專 利 No.4,683,195、4,683,202 和 4,800,159 ； Mullisetal, Meth.Enzymol.155 335(1987)以 及Murakawa etal.，DNA 7 287 (1988)所述，所述每個(gè)文獻(xiàn)均以其全部?jī)?nèi)容援引加入本 文。
轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(美國(guó)專利No.5,480,784和5,399,491，所述文獻(xiàn)均以其全部?jī)?nèi)容 援引加入本文)，通常稱作TMA，其在基本恒定的溫度、離子濃度以及pH條件下自催化 地合成靶核酸序列的多個(gè)拷貝，其中靶序列的多個(gè)RNA拷貝自催化地產(chǎn)生另外的拷貝。 見(jiàn)例如美國(guó)專利No.5,399,491和5,824,518，所述文獻(xiàn)均以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文。在 U.S.公開(kāi)號(hào)20060046^5 (在此以其全部?jī)?nèi)容援引加入)中所描述的變化中，TMA任選結(jié) 合使用封閉部分、終止部分及其它修飾部分以改善TMA過(guò)程的靈敏性和精確性。
連接酶鏈反應(yīng)(Weiss，R.，Science 254 1四2 (1991)，在此以其全部?jī)?nèi)容援引 加入)，通常稱作LCR，其使用與靶核酸的相鄰區(qū)域雜交的兩組互補(bǔ)DNA寡核苷酸。在 熱變性、雜交和連接的重復(fù)循環(huán)中，DNA寡核苷酸通過(guò)DNA連接酶共價(jià)連接，產(chǎn)生可檢 測(cè)的雙鏈連接的寡核苷酸產(chǎn)物。
鏈置換擴(kuò)增(Walker,G.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 392-396 (1992)； 美國(guó)專利No.5,270,184和5,455,166，所述文獻(xiàn)在此以其全部?jī)?nèi)容援引加入)，通常稱作 SDA,其使用引物對(duì)序列與靶序列的相反鏈退火、在存在dNTP α S的條件下引物延伸循 環(huán)以產(chǎn)生雙鏈半硫代磷酸化(hemiphosphorothioated)引物延伸產(chǎn)物，內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)半修 飾的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)的切口，以及聚合酶介導(dǎo)的從切口的3’末端的引物延伸 以置換現(xiàn)有鏈及產(chǎn)生用于下一循環(huán)引物退火、切口和鏈置換的鏈，導(dǎo)致產(chǎn)物呈幾何級(jí)數(shù) 擴(kuò)增。嗜熱SDA(tSDA)在基本相同的方法中在較高溫度使用嗜熱內(nèi)切核酸酶和聚合酶 (EP Pat.No.O 684 315)。
其它擴(kuò)增方法包括例如基于核酸序列的擴(kuò)增(美國(guó)專利No.5,130,238，在此 以其全部?jī)?nèi)容援引加入)，通常稱作NASBA;其使用RNA復(fù)制酶擴(kuò)增探針?lè)肿幼陨?(Lizardi etal.，BioTechnol.6 1197(1988)，在此以其全部?jī)?nèi)容援引加入)，通常稱作復(fù)制酶；基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法(Kwoh etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 1173(1989))； 以及自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(Guatelli et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 1874 (1990)，所 述文獻(xiàn)在此均以其全部?jī)?nèi)容援引加入)。對(duì)于已知擴(kuò)增方法的進(jìn)一步論述見(jiàn)Persing， David H., “ In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques " in Diagnostic Medical Microbiology Principles and Applications (Persing et al., Eds.), pp.51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC (1993))。
未擴(kuò)增的或者擴(kuò)增的靶核酸可以通過(guò)任何常規(guī)方式檢測(cè)。例如，靶mRNA可以 通過(guò)與可檢測(cè)地標(biāo)記的探針雜交及測(cè)量所得雜交體而進(jìn)行檢測(cè)。用于舉例說(shuō)明的非限制 性檢測(cè)方法的例子如下文描述。
一種用于舉例說(shuō)明的檢測(cè)方法是雜交保護(hù)測(cè)定(HPA)，其涉及將化學(xué)發(fā)光寡核 苷酸探針(例如吖啶鐺酯(acridinium ester，AE)標(biāo)記的探針)與靶序列雜交，選擇性水 解在未雜交探針上呈現(xiàn)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，以及在光度計(jì)中測(cè)量從剩余探針中產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光。見(jiàn)例如美國(guó)專利 No.5,283,174 和 Norman C.Nelson et al.，Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, ch. 17 (Larry J.Kricka ed., 2d ed.1995,所述文獻(xiàn)在此均以其全部?jī)?nèi)容援引加入本文)。
另一用于舉例說(shuō)明的檢測(cè)方法提供了對(duì)擴(kuò)增過(guò)程的實(shí)時(shí)定量評(píng)估。對(duì)擴(kuò)增過(guò)程 的“實(shí)時(shí)”評(píng)估涉及在擴(kuò)增反應(yīng)期間持續(xù)或者定期確定反應(yīng)混合物中擴(kuò)增子的量，以及 使用所確定的值計(jì)算樣品中最初存在的靶序列的量?；趯?shí)時(shí)擴(kuò)增的確定樣品中最初存 在的靶序列的量的許多方法是本領(lǐng)域熟知的。這些方法包括在美國(guó)專利No.6,303,305和 6,Ml,205中揭示的方法，所述文獻(xiàn)在此以其全部?jī)?nèi)容援引加入。不基于實(shí)時(shí)擴(kuò)增的確定 樣品中最初存在的靶序列的數(shù)量的另一方法在美國(guó)專利No.5,710,0 中揭示，所述文獻(xiàn)在 此以其全部?jī)?nèi)容援引加入。
擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)使用各種自身雜交(self-hybridizing)探針實(shí)時(shí)檢測(cè)，大多數(shù) 所述探針具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。這種自身雜交探針被標(biāo)記，從而其發(fā)射出可不同地檢測(cè)的信 號(hào)，這取決于探針是自身雜交狀態(tài)還是經(jīng)與靶序列雜交改變的狀態(tài)。通 過(guò)非限制性例 子，“分子火炬(moleculartorch)”是一類自身雜交探針，其包含自身互補(bǔ)性的獨(dú)特區(qū)域 (稱作“靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域”和“靶閉合結(jié)構(gòu)域(closing domain) ”)，其通過(guò)結(jié)合區(qū)(例如非 核苷酸接頭)連接起來(lái)且其在預(yù)定的雜交測(cè)定條件下彼此雜交。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 分子火炬在靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域中含有單鏈堿基區(qū)，其長(zhǎng)度為1至大約20個(gè)堿基且易于在鏈置 換條件下與存在于擴(kuò)增反應(yīng)中的靶序列接近而雜交。在鏈置換條件下，分子火炬的可以 完全或者部分互補(bǔ)的兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)域的雜交是有優(yōu)勢(shì)的，除非存在靶序列，其將結(jié)合靶結(jié) 合結(jié)構(gòu)域中存在的單鏈區(qū)域并置換所有或者部分靶閉合結(jié)構(gòu)域。分子火炬的靶結(jié)合結(jié)構(gòu) 域和靶閉合結(jié)構(gòu)域包含可檢測(cè)的標(biāo)記或者一對(duì)相互作用標(biāo)記(例如發(fā)光劑/猝滅劑)，所 述標(biāo)記經(jīng)定位使得當(dāng)該分子火炬自身雜交時(shí)與該分子火炬與靶序列雜交時(shí)產(chǎn)生不同的信 號(hào)，從而可以在存在未雜交的分子火炬的條件下檢測(cè)出檢測(cè)樣品中的探針靶雙鏈體。 分子火炬和許多類型的相互作用標(biāo)記對(duì)是已知的(例如美國(guó)專利No.6,534,274，所述文獻(xiàn) 在此以其全部?jī)?nèi)容援引加入)。
另一具有自身互補(bǔ)性的檢測(cè)探針的例子是“分子信標(biāo)”(見(jiàn)美國(guó)專利 No.5,925,517和6,150,097，所述文獻(xiàn)在此以其全部?jī)?nèi)容援引加入)。分子信標(biāo)包括這樣的 核酸分子，其具有靶互補(bǔ)序列、在擴(kuò)增反應(yīng)中不存在靶序列時(shí)使探針保持在密閉構(gòu)象的 親和性對(duì)(或者核酸臂)、以及當(dāng)探針處于密閉構(gòu)象中時(shí)相互作用的標(biāo)記對(duì)。靶序列與靶 互補(bǔ)序列的雜交分開(kāi)親和性對(duì)的成員，從而使探針轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)放構(gòu)象。向開(kāi)放構(gòu)象的轉(zhuǎn)變 可以檢測(cè)，這是因?yàn)闃?biāo)記對(duì)的相互作用降低，所述標(biāo)記對(duì)可以是如熒光團(tuán)與猝滅劑(例 如 DABCYL 與 EDANS)。
其它自身雜交探針也為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。非限制性例子，具有相互作用標(biāo) 記的探針結(jié)合對(duì)(例如見(jiàn)美國(guó)專利No.5,928,862，在此以其全部?jī)?nèi)容援引加入)可適用于 本文所揭示的組合物和方法中。也可以使用用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性6NP)的探針系 統(tǒng)。其它檢測(cè)系統(tǒng)包括“分子開(kāi)關(guān)”(例如見(jiàn)U.S.Publ.No.200500似638，在此以其全部?jī)?nèi) 容援引加入)。其它探針如那些包含插入染料和/或熒光染料的探針也可用于在本文揭示 的方法中檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物(例如見(jiàn)美國(guó)專利No.5,814,447，在此以其全部?jī)?nèi)容援引加入)。
在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)方法是定性的(例如特定核酸的存在與否)。在其它實(shí)施方案中，其是定量的(例如病毒負(fù)荷)。
ii.蛋白質(zhì)檢測(cè)
蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的例子包括但不限于酶測(cè)定、直接觀測(cè)以及免疫測(cè)定。在一些 實(shí)施方案中，免疫測(cè)定使用針對(duì)純化蛋白質(zhì)的抗體。這種抗體可以是多克隆或者單克隆 的、嵌合的、人源化的、單鏈或者Fab片段，其可以被標(biāo)記或者未標(biāo)記，所有這些均通過(guò) 使用熟知方法和標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)產(chǎn)生。見(jiàn)例如Burns，ed.，Immunochemical Protocols, 3rd ed.， Humana Press (2005) ； Harlow and Lane, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ； Kozbor et al，Immunology Today 4 72(1983) ； Kohler andMilstein, Nature 256 : 495 (1975)。在一些實(shí)施方案中，使用可商購(gòu)的抗體。
D.數(shù)據(jù)分析
在一些實(shí)施方案中，在純化和檢測(cè)之后，使用基于計(jì)算機(jī)的分析程序?qū)⒂蓹z測(cè) 測(cè)定所產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)(例如指定靶分子的存在、不存在或者量)翻譯成提供給臨床醫(yī)生 或者研究人員的預(yù)測(cè)值的數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，將軟件程序集成進(jìn)自動(dòng)化裝置中。 在其它實(shí)施方案中，其位于遠(yuǎn)程。臨床醫(yī)生可以使用任何合適方式存取數(shù)據(jù)。因此，在 一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了進(jìn)一步的益處，即不太可能經(jīng)過(guò)遺傳學(xué)或者分子 生物學(xué)培訓(xùn)的臨床醫(yī)生不需要理解原始數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以其最有用的形式直接呈現(xiàn)給臨床醫(yī) 生。然后臨床醫(yī)生可以立即使用該信息優(yōu)化對(duì)對(duì)象的護(hù)理。
能向和從進(jìn)行測(cè)定的實(shí)驗(yàn)室、信息提供、醫(yī)務(wù)人員和對(duì)象接受、處理和傳送信 息的任何方法均可以使用。例如，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，樣品(例如活組織檢查 或者血清或者尿液樣品)得自對(duì)象并呈遞給服務(wù)機(jī)構(gòu)(例如醫(yī)療機(jī)構(gòu)的臨床實(shí)驗(yàn)室，基因 組譜分析公司(genomic profiling business)等)，其位于世界上任何地方(例如在與所述對(duì) 象居住地或者信息的最終使用地不同的地區(qū))以產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)。當(dāng)樣品包含組織或者其 它生物樣品時(shí)，對(duì)象可以去醫(yī)療中心以獲得樣品并送至譜分析中心，或者對(duì)象可以自己 收集樣品(如尿樣)并直接送至譜分析中心。當(dāng)樣品包括先前確定的生物學(xué)信息時(shí)，所 述信息可以通過(guò)對(duì)象直接送至譜分析服務(wù)機(jī)構(gòu)(例如含有所述信息的信息卡可以由計(jì)算 機(jī)掃描并用電子通訊系統(tǒng)將數(shù)據(jù)傳輸至譜分析中心的計(jì)算機(jī))。一旦譜分析服務(wù)機(jī)構(gòu)接收 后，樣品被處理并產(chǎn)生對(duì)象所需的特異于診斷或預(yù)后信息的譜(即表達(dá)數(shù)據(jù))。
然后將譜數(shù)據(jù)制備成適合治療性臨床醫(yī)生解讀的格式。例如，不是提供原始數(shù) 據(jù)，而是制備格式可以代表對(duì)對(duì)象的診斷或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(例如病毒載荷水平)，連同特定治 療選項(xiàng)的建議一起。數(shù)據(jù)可以通過(guò)任何合適方法展示給臨床醫(yī)生。例如，在一些實(shí)施方 案中，譜分析服務(wù)機(jī)構(gòu)生成一份報(bào)告，報(bào)告可以打印給臨床醫(yī)生(例如在床旁)或者在計(jì) 算機(jī)監(jiān)視器上展示給臨床醫(yī)生。
在一些實(shí)施方案中，首先在床旁或者在地區(qū)性機(jī)構(gòu)分析信息。然后將原始數(shù)據(jù) 輸送至中心處理機(jī)構(gòu)做進(jìn)一步分析和/或?qū)⒃撛紨?shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成可為臨床醫(yī)生或者患者所 用的信息。中心處理機(jī)構(gòu)提供數(shù)據(jù)分析的隱私性(所有數(shù)據(jù)均在統(tǒng)一安全方案下貯存在 中心機(jī)構(gòu)中)、速度和一致性的優(yōu)勢(shì)。然后中心處理機(jī)構(gòu)可在治療對(duì)象后控制數(shù)據(jù)結(jié)局 (fate) 0例如，使用電子通訊系統(tǒng)，中心處理機(jī)構(gòu)可以為臨床醫(yī)生、對(duì)象或者研究人員提 供數(shù)據(jù)。
在一些實(shí)施方案中，對(duì)象能夠使用電子通訊系統(tǒng)直接存取數(shù)據(jù)。所述對(duì)象基于結(jié)果可以選擇進(jìn)一步介入或者咨詢。在一些實(shí)施方案中，所述數(shù)據(jù)用于研究用途。 例如，數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步優(yōu)化作為疾病特定狀況或階段的有用指示的標(biāo)記的包含或者清 除。
E.組合物與試劑盒
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的系統(tǒng)和/或裝置以含有進(jìn)行純化和分析必需的所 有成分(例如預(yù)加載在裝置中)來(lái)交付。在其它實(shí)施方案中，另外的反應(yīng)成分可以在分 隔的容器中提供，所述容器包裝在一起形成試劑盒。
任何這些組合物，單獨(dú)或者與本文揭示的或者本領(lǐng)域熟知的其它組合物組合， 可以以試劑盒形式提供。試劑盒可進(jìn)一步包含合適的對(duì)照物和/或檢測(cè)試劑?？捎糜诒?發(fā)明所述任何方法中的任一種或多種試劑均可提供在所述試劑盒中。
實(shí)驗(yàn)
如下實(shí)施例是提供用來(lái)證明和舉例說(shuō)明本文所揭示的組合物和方法的某些優(yōu)選 的實(shí)施方案和方面，但是不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
這個(gè)實(shí)施例描述了使用磁力移動(dòng)順磁性微粒以捕獲RNA，隨后純化以及釋放 RNA用來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)。其還顯示了液體蠟的使用，作為例證的親脂性材料，以及作為各 個(gè)室之間的閥門，其允許順磁性微粒移動(dòng)同時(shí)在各個(gè)洗滌緩沖液之間形成屏障。
(a)藥筒的制作
通過(guò)加工無(wú)菌清潔的圓底聚苯乙烯96孔平板制備進(jìn)行測(cè)定用的單個(gè)藥筒(圖 la)。使用符合FDA的光面(plain back) 1/16〃聚丙烯薄板來(lái)制成蠟通道。為了制作蠟 通道，將準(zhǔn)備用于低表面能基材的9495LE丙烯粘性傳送帶(adhesive transfer tape) (3M， St.Paul, MN)粘在切割成適當(dāng)規(guī)格的長(zhǎng)方形塑料片兩側(cè)。從塑料片碾壓(mill out)出長(zhǎng)方 形通道。碾壓過(guò)程也切削膠帶。鑒于聚丙烯的不良熱傳導(dǎo)性和低熔點(diǎn)，在加工時(shí)要特別 小心。在通道的加工期間形成的毛邊使用刀片除去。頂板也是用聚丙烯薄板制成。在 頂板上穿幾個(gè)小孔以用于導(dǎo)入流體。
聚丙烯用于制成頂板和通道是由于其極佳的化學(xué)抗性。飽和的烯鏈對(duì)大多數(shù)油 和溶劑以及基于水的化合物、肥皂和中等酸和堿產(chǎn)生抗性。很少數(shù)具有聚丙烯強(qiáng)度性質(zhì) 的其它材料達(dá)到匹配聚丙烯的化學(xué)抗性。聚丙烯堅(jiān)硬的、高度光滑的表面使其對(duì)于擔(dān)心 會(huì)干擾藥筒的流動(dòng)滅菌的環(huán)境是理想的優(yōu)選在檢測(cè)期間維持無(wú)RNA環(huán)境。雖然商購(gòu) 的塑料平板是用Y射線照射來(lái)滅菌，開(kāi)發(fā)了可以在實(shí)驗(yàn)室容易進(jìn)行的對(duì)塑料部分進(jìn)行滅 菌的方案。在對(duì)所述平板進(jìn)行加工之前，將待用于測(cè)試的孔用粘性帶密封。在加工完成 后，使用如下方案洗滌所述藥筒
a.用水洗滌兩次
b.用100 %乙醇洗滌兩次
c.用 RNaseZap RNase 凈化溶液(Ambion，Austin, TX)洗滌
d.用水洗滌兩次。
在完成洗滌之后，將藥筒在50°C干燥過(guò)夜。
RNA純化測(cè)定
使用400 μ L 含有 IO6 個(gè)拷貝 /mL Armored RNA (Abbott Molecular, DesPlaines,IL)的血漿樣品進(jìn)行測(cè)定。使用Armored RNA而不是裸RNA作為檢測(cè)樣品是因?yàn)槠鋵?duì)核 糖核酸酶具抗性且易于通過(guò)RNA拷貝數(shù)量化。其也是非感染性的，這使其易于操作。
為了從血漿樣品純化RNA，使用MagMAXViral RNA Isolation試劑盒(Ambion， Austin, TX)。在這種方法中，使用基于硫氰酸胍溶液的傳統(tǒng)方法破壞細(xì)胞。這同時(shí)釋 放病毒RNA及使樣品基質(zhì)中的核酸酶失活。然后所述RNA在存在離液劑和醇的條件下 結(jié)合二氧化硅包被的磁珠。然后將該珠在水性低鹽緩沖液中洗滌和洗脫。
裂解/結(jié)合溶液和珠混合物的制備在表1所示裂解/結(jié)合溶液濃縮物中加入載 體RNA并簡(jiǎn)單混合。隨后加入100%異丙醇。為了制備珠混合物，對(duì)每個(gè)反應(yīng)將10 μ L RNA結(jié)合珠與10 μ L裂解增強(qiáng)劑混合。該珠經(jīng)渦旋之后分成等份。
表1 :為制備裂解緩沖液加入的試劑體積
權(quán)利要求
1.生物樣品處理裝置，其包括a)兩或更多個(gè)包含樣品處理試劑的樣品處理室；以及b)在至少兩個(gè)所述兩或更多個(gè)樣品處理室之間的水和醇不混溶性、疏水性或者親脂 性材料，由此當(dāng)樣品在第一和第二處理室之間移動(dòng)時(shí)移動(dòng)穿過(guò)所述材料。
2.權(quán)利要求1的裝置，其具有由所述材料分隔的三或更多個(gè)樣品處理室。
3.權(quán)利要求1的裝置，其具有由所述材料分隔的四或更多個(gè)樣品處理室。
4.權(quán)利要求1的裝置，其具有由所述材料分隔的五或更多個(gè)樣品處理室。
5.權(quán)利要求1的裝置，其中每個(gè)所述樣品處理室均包含樣品純化試劑。
6.權(quán)利要求1的裝置，其中所述樣品處理室選自由以下組成的組包含樣品純化試 劑的樣品純化室，包含樣品分析試劑的樣品分析室以及樣品純化室和樣品分析室的混合 物。
7.權(quán)利要求1的裝置，其中所述親脂性物質(zhì)是蠟。
8.權(quán)利要求1的裝置，其中所述親脂性物質(zhì)是油。
9.權(quán)利要求1的裝置，其進(jìn)一步包含安置的磁體以使磁性顆粒從所述樣品純化室移動(dòng) 到所述樣品分析室。
10.權(quán)利要求1的裝置，其中所述裝置包括蒸汽屏障。
11.權(quán)利要求1的裝置，其中所述裝置包括夾在塑料層之間的鋁箔層。
12.—種系統(tǒng)，其包含a)生物樣品處理裝置，其包括兩或更多個(gè)包含樣品處理試劑的樣品處理室，以及 在所述至少兩個(gè)所述樣品處理室之間的水和醇不混溶性、疏水性或者親脂性材料；以及b)配置為在所述樣品處理室之間轉(zhuǎn)運(yùn)至少部分樣品的樣品轉(zhuǎn)運(yùn)部件。
13.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述樣品轉(zhuǎn)運(yùn)部件包括磁體。
14.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括樣品檢測(cè)部件。
15.—種處理生物樣品的方法，包括a)將樣品置于第一室內(nèi)，所述第一室包含第一處理試劑以產(chǎn)生經(jīng)處理的樣品；b)使所述經(jīng)處理的樣品移動(dòng)穿過(guò)水和醇不混溶性、疏水性或者親脂性屏障至第二室；c)在所述第二室內(nèi)用第二處理試劑處理所述經(jīng)處理的樣品，產(chǎn)生經(jīng)進(jìn)一步處理的樣品 O
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一和/或第二處理試劑是純化試劑。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述第一試劑是捕獲試劑，所述第二試劑是洗滌試劑。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述第一試劑是純化試劑，所述第二試劑是分析試劑。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述純化的樣品包含與磁性顆粒結(jié)合的所述生物分子。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述移動(dòng)包括使用磁體從所述第一室拖動(dòng)所述磁性顆粒 進(jìn)入所述屏障，然后進(jìn)入所述第二室。
21.權(quán)利要求15的方法，其中所述生物分子是完整細(xì)胞、RNA、DNA或者蛋白質(zhì)。
22.權(quán)利要求15的方法，其中將所述純化的樣品在移至所述第二室之前移動(dòng)至一或多 個(gè)其它室。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述一或多個(gè)其它室包含洗滌試劑。
24.權(quán)利要求15的方法，其中所述第二處理試劑包含核酸擴(kuò)增試劑。
25.權(quán)利要求15的方法，其中所述第二處理試劑包含核酸檢測(cè)試劑。
26.權(quán)利要求15的方法，其中所述第二處理試劑包含多肽檢測(cè)試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及進(jìn)行生物反應(yīng)的系統(tǒng)、裝置和方法。本發(fā)明特別涉及親脂性、水不混溶性、或者疏水性屏障在樣品分離、純化、修飾和分析過(guò)程中的用途。
文檔編號(hào)B01L7/00GK102027367SQ200980115366
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日
發(fā)明者D·M·凱爾索, S·庫(kù)納爾, Z·帕爾皮亞 申請(qǐng)人:西北大學(xué)