專(zhuān)利名稱(chēng)：具有生物屏障的基于藥代動(dòng)力學(xué)的培養(yǎng)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，更具體地，涉及為了藥代動(dòng)力學(xué)研究而在微型(microscale)水平上促進(jìn)流體系統(tǒng)之間的相互作用的系統(tǒng)和方法。
相關(guān)技術(shù)描述 藥代動(dòng)力學(xué)是藥物和其他生物活性化合物從被導(dǎo)入體內(nèi)時(shí)開(kāi)始到消除時(shí)止的命運(yùn)的研究。例如，口服藥物的事件的順序可以包括通過(guò)各種粘膜表面的吸收、通過(guò)血流向各種組織的分布、在肝臟和其他組織中的生物轉(zhuǎn)化、在靶部位的作用、以及藥物或代謝物在尿或膽汁中的消除。藥代動(dòng)力學(xué)提供了研究生物系統(tǒng)中化合物代謝的合理手段。關(guān)于藥代動(dòng)力學(xué)方程和模型的綜述，參見(jiàn)，例如，Poulin和Theil(2000)J Pharm Sci.89(1)16-35；Slob等人.(1997)Crit RevToxicol.27(3)261-72；Haddad等人.(1996)Toxicol Lett.85(2)113-26；Hoang(1995)Toxicol Lett.79(1-3)99-106；Knaak等人.(1995)Toxicol Lett.79(1-3)87-98；Ball和Schwartz(1994)Comput Biol Med.24(4)269-76。
研究人員在藥物、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)、消費(fèi)品安全性和毒理學(xué)研究中所面臨的一個(gè)基本挑戰(zhàn)是代謝數(shù)據(jù)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估從體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)向動(dòng)物的外推。盡管利用適當(dāng)?shù)乃幋鷦?dòng)力學(xué)原理可以得出一些結(jié)論，但是仍然有相當(dāng)?shù)南拗?。所?dān)心的一個(gè)問(wèn)題是目前的篩選試驗(yàn)是在不復(fù)制其在天然環(huán)境中的功能的條件下使用細(xì)胞。循環(huán)流動(dòng)、與其他組織的相互作用、和與生理應(yīng)答相關(guān)的其他參數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)形式中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。例如，在大型細(xì)胞培養(yǎng)模擬(CCA)系統(tǒng)中，細(xì)胞在腔室底部生長(zhǎng)。這些系統(tǒng)具有非生理學(xué)的高液體∶細(xì)胞比，并且具有不現(xiàn)實(shí)的細(xì)胞型之比(例如肝細(xì)胞與肺細(xì)胞之比)。在大型CCA系統(tǒng)的一種變形中，細(xì)胞在微載體珠上生長(zhǎng)。這些系統(tǒng)更加類(lèi)似于生理?xiàng)l件，但是仍然具有缺陷，因?yàn)閷?duì)于預(yù)測(cè)性研究而言，它們沒(méi)有足夠準(zhǔn)確地模擬生理?xiàng)l件。因此，得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)不是基于將在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的藥物或毒素暴露的模式。
在活生物體內(nèi)，濃度、時(shí)間和代謝相互作用，影響藥理學(xué)或毒性反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。例如，體內(nèi)肝功能的存在強(qiáng)烈影響藥物代謝和生物利用度。肝臟清除活性藥物是通過(guò)生物轉(zhuǎn)化和排泄發(fā)生的。生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)包括由細(xì)胞色素P450酶催化的反應(yīng)，該酶轉(zhuǎn)化許多在化學(xué)上不同的藥物。第二生物轉(zhuǎn)化階段可以增加親水基團(tuán)，例如谷胱甘肽、葡糖醛酸或硫酸鹽，以提高水溶性和加速通過(guò)腎臟排除出。
盡管生物轉(zhuǎn)化可能是有益的，但是它也可能具有不希望的后果?；衔锖蜕矬w之間的復(fù)雜相互作用產(chǎn)生毒性。在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，產(chǎn)生的代謝物可能比親代化合物毒性更強(qiáng)。許多用于毒性篩選的單細(xì)胞試驗(yàn)避開(kāi)了這些復(fù)雜的細(xì)胞間和組織間效應(yīng)。
結(jié)果，人類(lèi)對(duì)于潛在藥物的應(yīng)答難以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)，通常是不可靠的，并且常常是昂貴的。傳統(tǒng)的預(yù)測(cè)人類(lèi)應(yīng)答的方法使用替代物—一般是靜態(tài)的、同質(zhì)的體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)或體內(nèi)動(dòng)物研究。體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)的價(jià)值有限，因?yàn)樗鼈儾荒軠?zhǔn)確地模擬候選藥物在人體內(nèi)經(jīng)歷的復(fù)雜環(huán)境，因此不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)人類(lèi)的危險(xiǎn)。類(lèi)似地，盡管體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)可以說(shuō)明從基于細(xì)胞的體外試驗(yàn)中觀(guān)察不到的這些復(fù)雜的細(xì)胞間和組織間效應(yīng)，但是體內(nèi)動(dòng)物研究非常昂貴、勞動(dòng)密集、耗時(shí)、并且當(dāng)與人類(lèi)危險(xiǎn)相關(guān)時(shí)結(jié)果通常具有值得懷疑的相關(guān)性。
授予Shuler等人的美國(guó)專(zhuān)利No.5,612,188描述了一種多區(qū)室細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。該培養(yǎng)系統(tǒng)使用諸如培養(yǎng)腔室、傳感器和泵的大型部件，需要使用大量的培養(yǎng)基、細(xì)胞和受試化合物。該系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)非常昂貴，并且需要大量的操作空間。由于該系統(tǒng)是這樣大規(guī)模的，因此生理學(xué)參數(shù)與在體內(nèi)情況下所發(fā)現(xiàn)的參數(shù)相比有相當(dāng)大的不同。在這種大規(guī)模下不可能準(zhǔn)確地產(chǎn)生生理學(xué)現(xiàn)實(shí)的條件。
開(kāi)發(fā)可以更好、更快、更有效地預(yù)測(cè)體內(nèi)毒性和臨床藥物表現(xiàn)的微型篩選試驗(yàn)和裝置在許多領(lǐng)域具有重要意義，也是本發(fā)明中所要解決的。這種微型裝置可以準(zhǔn)確地產(chǎn)生生理學(xué)現(xiàn)實(shí)的參數(shù)，并且更接近地模擬所測(cè)試的期望的體內(nèi)系統(tǒng)。
發(fā)明概述 提供了用于微型細(xì)胞培養(yǎng)模擬(CCA)裝置的裝置、體外細(xì)胞培養(yǎng)和方法。本發(fā)明的裝置允許將細(xì)胞在體外保持在其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值類(lèi)似于在體內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的值的條件下。目標(biāo)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括細(xì)胞之間的相互作用、液體停留時(shí)間、液體∶細(xì)胞比、器官的相對(duì)大小、細(xì)胞的代謝、剪應(yīng)力等。通過(guò)提供模擬細(xì)胞天然狀態(tài)的基于藥代動(dòng)力學(xué)的培養(yǎng)系統(tǒng)，篩選和毒性試驗(yàn)的預(yù)測(cè)值和體內(nèi)相關(guān)性得到提高。
微型培養(yǎng)裝置包括通道的流體網(wǎng)絡(luò)，這些通道隔離為不連續(xù)的但是相互連接的腔室。特定腔室的幾何形狀設(shè)計(jì)為提供與體內(nèi)相應(yīng)細(xì)胞、組織或器官所發(fā)現(xiàn)的參數(shù)相關(guān)的細(xì)胞相互作用、液體流動(dòng)和液體停留參數(shù)。該流體學(xué)設(shè)計(jì)為準(zhǔn)確地代表循環(huán)或淋巴系統(tǒng)的主要成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些部件集成為芯片形式。這些幾何形狀的設(shè)計(jì)和確認(rèn)以基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(PBPK)模型為基礎(chǔ)；這是一種將身體表示為相互連接的代表不同組織的區(qū)室的數(shù)學(xué)模型。
該裝置的每個(gè)培養(yǎng)腔室中可以接種合適的細(xì)胞。例如，設(shè)計(jì)為提供肝臟藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的腔室接種肝細(xì)胞，并且可以與接種在設(shè)計(jì)為提供脂肪組織藥代動(dòng)力學(xué)的腔室中的脂肪細(xì)胞流體連通。這產(chǎn)生了一種基于藥代動(dòng)力學(xué)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)準(zhǔn)確地代表，例如，它所模擬的動(dòng)物的組織大小比、組織∶血液體積比、藥物停留時(shí)間。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括第一微型培養(yǎng)裝置和控制設(shè)備。第一微型培養(yǎng)裝置具有許多微型腔室，該腔室的幾何形狀模擬多種與培養(yǎng)基的體內(nèi)相互作用，其中每個(gè)腔室包括用于培養(yǎng)基流動(dòng)的入口和出口，微流通道將這些腔室互相連接。控制設(shè)備連接到第一微型培養(yǎng)裝置上，包括用于從第一微型培養(yǎng)裝置獲得數(shù)據(jù)并控制其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算機(jī)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)包括微處理器、通用存儲(chǔ)器、非易失性存儲(chǔ)元件、包括與具有一個(gè)或多個(gè)傳感器的微型培養(yǎng)裝置之間的界面的輸入/輸出界面、和計(jì)算機(jī)軟件。該計(jì)算機(jī)軟件可在微處理器上執(zhí)行，以分析來(lái)自傳感器的數(shù)據(jù)，確定該微型培養(yǎng)裝置的許多腔室中的生理學(xué)事件，調(diào)節(jié)該微型培養(yǎng)裝置的腔室中培養(yǎng)基的流體流速，檢測(cè)該微型培養(yǎng)裝置的腔室中的生物學(xué)或毒理學(xué)反應(yīng)，并且在檢測(cè)后改變微型培養(yǎng)裝置的一個(gè)或多種藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
如本文使用的單數(shù)形式“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文中明確說(shuō)明不是這樣。例如，“一種化合物”是指一種或多種這樣的化合物，而“該細(xì)胞”包括一種特定細(xì)胞以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其他家族成員及其等同物。
本申請(qǐng)公開(kāi)內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種裝置，該裝置包括至少一個(gè)部件，該部件的尺寸設(shè)置為在如下條件下保持生物材料在體外提供與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值相當(dāng)?shù)闹辽僖粋€(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值。該裝置進(jìn)一步包括通透性材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述部件是微型部件。在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料選自膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸鹽、膠原、MATRIGEL、細(xì)胞、細(xì)胞材料、組織和組織片中的至少一個(gè)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料進(jìn)一步包括位于微孔表面之中、之上或附近的有機(jī)或無(wú)機(jī)材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料構(gòu)造為模擬以下至少一種生物屏障，物質(zhì)在生物屏障中通過(guò)或穿過(guò)，或者物質(zhì)在生物屏障中、通過(guò)生物屏障或被生物屏障吸收。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物屏障選自下面的至少一種胃腸屏障、血腦屏障、肺屏障、胎盤(pán)屏障、表皮屏障、眼屏障、嗅覺(jué)屏障、胃食管屏障、粘膜、血-尿屏障、空氣-組織屏障、血液-膽汁屏障、口屏障、肛門(mén)直腸屏障、陰道屏障和尿道屏障。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)選自以下至少一個(gè)組織大小、組織大小比、組織∶血液體積比、藥物停留時(shí)間、細(xì)胞間相互作用、液體停留時(shí)間、液體∶細(xì)胞比、細(xì)胞的代謝、剪應(yīng)力、流速、幾何形狀、循環(huán)通過(guò)時(shí)間、液體分布、組織和/或器官之間的相互作用、和細(xì)胞的分子轉(zhuǎn)運(yùn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該裝置決定了物質(zhì)在通透性材料中、通過(guò)通透性材料或被通透性材料的吸收、代謝或分布。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述部件構(gòu)造為代表下列至少一個(gè)中樞神經(jīng)、循環(huán)、消化、膽道、肺、泌尿、眼、嗅覺(jué)、表皮和淋巴系統(tǒng)的至少一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料位于所述裝置的內(nèi)部或外部。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置進(jìn)一步包括至少一個(gè)與通透性材料連接的微流通道。
在一個(gè)實(shí)施方案中，流體在通透性材料中、通過(guò)通透性材料或靠近通透性材料的流動(dòng)提供了至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，流體通過(guò)該裝置流動(dòng)的特性基于一種數(shù)學(xué)模型。在一個(gè)實(shí)施方案中，該數(shù)學(xué)模型是一種基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(″PBPK″)模型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述部件或通透性材料集成為芯片格式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料包括在微孔材料上培養(yǎng)的胃腸腸細(xì)胞層。在一個(gè)實(shí)施方案中，胃腸腸細(xì)胞層的至少一部分位于所述裝置中，使得流體可以沿該層的任一側(cè)流動(dòng)，但是不穿過(guò)該層。在一個(gè)實(shí)施方案中，位于胃腸腸細(xì)胞層第一側(cè)面上的至少第一微型部件代表胃腸道，位于該單層第二側(cè)面上的至少第二微型部件代表循環(huán)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置進(jìn)一步包括構(gòu)造為含有相同或不同類(lèi)型的生物材料的第三微型部件。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料包括至少部分包覆有機(jī)材料的微孔材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備進(jìn)一步包括位于通透性材料之中、之上或靠近其兩側(cè)的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該裝置提供吸收特性、代謝酶活性和/或表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料任一側(cè)上的細(xì)胞為相同的類(lèi)型或不同的類(lèi)型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備進(jìn)一步在通透性材料微孔表面之中、之上或附近包括肝細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該微孔表面的至少一部分包括使肝細(xì)胞極化的蛋白質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料包括能夠形成匯合單層的細(xì)胞系。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備進(jìn)一步包括使肝細(xì)胞與通透性材料結(jié)合的粘合劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該粘合劑使肝細(xì)胞極化。在一個(gè)實(shí)施方案中，該粘合劑包括選自以下物質(zhì)的至少一種蛋白質(zhì)、連接蛋白32、緊密連接蛋白、閉合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘著連接蛋白、E-鈣粘蛋白、β-聯(lián)蛋白、細(xì)胞粘附分子和桑椹粘著蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備進(jìn)一步在通透性材料之中、之上或附近包括第二種類(lèi)型的生物材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備進(jìn)一步在通透性材料之中、之上或附近包括成纖維細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備進(jìn)一步包括靠近通透性材料的第一側(cè)面的血液替代物流動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述設(shè)備進(jìn)一步包括靠近通透性材料的第二側(cè)面的膽汁替代物流動(dòng)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種方法，該方法包括在如下條件下保持生物材料在體外提供與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值相當(dāng)?shù)闹辽僖粋€(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值。該方法進(jìn)一步包括使物質(zhì)通過(guò)通透性材料的至少一部分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將生物材料保持在微型部件之內(nèi)或附近。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料選自膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸鹽、膠原、MATRIGEL、細(xì)胞、細(xì)胞材料、組織和組織片中的至少一種。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料進(jìn)一步包括在微孔表面之中、之上或附近的有機(jī)或無(wú)機(jī)材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料構(gòu)造為模擬以下至少一種生物屏障，物質(zhì)在生物屏障中通過(guò)或穿過(guò)，或者物質(zhì)在生物屏障中、通過(guò)生物屏障或被生物屏障吸收。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物屏障選自下面的至少一種胃腸屏障、血腦屏障、血液-膽汁屏障、肺屏障、胎盤(pán)屏障、表皮屏障、眼屏障、嗅覺(jué)屏障、胃食管屏障、粘膜、血-尿屏障、空氣-組織屏障、口屏障、肛門(mén)直腸屏障、陰道屏障和尿道屏障。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)選自以下至少一個(gè)組織大小、組織大小比、組織∶血液體積比、藥物停留時(shí)間、細(xì)胞間相互作用、液體停留時(shí)間、液體∶細(xì)胞比、細(xì)胞的代謝、剪應(yīng)力、流速、幾何形狀、循環(huán)通過(guò)時(shí)間、液體分布、組織和/或器官之間的相互作用、和細(xì)胞的分子轉(zhuǎn)運(yùn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括確定物質(zhì)在通透性材料中、通過(guò)通透性材料或被通透性材料的吸收、代謝或分布。在一個(gè)實(shí)施方案中，部件構(gòu)造為代表下列至少一個(gè)中樞神經(jīng)、循環(huán)、消化、膽道、肺、泌尿、眼、嗅覺(jué)、表皮和淋巴系統(tǒng)的至少一部分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在微型裝置的內(nèi)部或外部設(shè)置通透性材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使流體通過(guò)與通透性材料連接的至少一個(gè)微流通道流動(dòng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，流體在通透性材料中、通過(guò)通透性材料或靠近通透性材料的流動(dòng)提供了至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，流體通過(guò)該裝置流動(dòng)的特性基于一種數(shù)學(xué)模型。在一個(gè)實(shí)施方案中，該數(shù)學(xué)模型是一種基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(″PBPK″)模型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將微型部件或通透性材料集成為芯片格式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料包括在微孔材料上培養(yǎng)的胃腸腸細(xì)胞層。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括定位胃腸腸細(xì)胞層的至少一部分，使得所述流體可以沿該層的任一側(cè)流動(dòng)，但是不通過(guò)該層。在一個(gè)實(shí)施方案中，位于胃腸腸細(xì)胞層的第一側(cè)面上的至少第一微型部件代表胃腸道，位于該單層的第二側(cè)面上的至少第二微型部件代表循環(huán)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第三微型部件構(gòu)造為含有相同或不同類(lèi)型的生物材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料包括至少部分包覆有機(jī)材料的微孔材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將細(xì)胞定位于通透性材料之中、之上或靠近其兩側(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括提供吸收特性、代謝酶活性和/或表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料任一側(cè)上的細(xì)胞為相同的類(lèi)型或不同的類(lèi)型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將肝細(xì)胞定位于通透性材料微孔表面之中、之上或附近。在一個(gè)實(shí)施方案中，該微孔表面的至少一部分包括使肝細(xì)胞極化的蛋白質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料包括能夠形成匯合單層并極化的細(xì)胞系。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將肝細(xì)胞結(jié)合在通透性材料上。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使肝細(xì)胞極化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合包括選自以下至少一種的粘合劑蛋白質(zhì)、連接蛋白32、緊密連接蛋白、閉合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘著連接蛋白、E-鈣粘蛋白、β-聯(lián)蛋白、細(xì)胞粘附分子和桑椹粘著蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將第二種類(lèi)型的生物材料定位在通透性材料之中、之上或附近。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將成纖維細(xì)胞定位在通透性材料之中、之上或附近。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使血液替代物靠近通透性材料的第一側(cè)面流動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使膽汁替代物靠近通透性材料的第二側(cè)面流動(dòng)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種形成裝置的方法。該方法包括形成一個(gè)部件，該部件構(gòu)造為在如下條件下保持生物材料在體外提供與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值相當(dāng)?shù)闹辽僖粋€(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值。該方法進(jìn)一步包括添加、形成或提供通透性材料。該通透性材料構(gòu)造為使物質(zhì)通過(guò)通透性材料的至少一部分。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種裝置，該裝置具有在如下條件下保持生物材料的裝置以及提供通透性屏障的裝置在體外提供與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值相當(dāng)?shù)闹辽僖粋€(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種裝置，該裝置包括微型通透性材料和至少一種用于將物質(zhì)極化的粘合劑，其中該物質(zhì)表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種或多種肝細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是遺傳工程生物材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述粘合劑將肝細(xì)胞結(jié)合并極化到微型通透性材料上。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置進(jìn)一步包括第二種物質(zhì)類(lèi)型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置進(jìn)一步包括一種或多種位于微型通透性材料的至少一個(gè)表面附近的成纖維細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性材料選自有機(jī)材料、無(wú)機(jī)材料、膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸鹽、膠原、MATRIGEL、細(xì)胞、細(xì)胞材料、組織和組織片中的至少一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性材料位于微孔表面之中、之上或附近。在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性材料構(gòu)造為模擬以下至少一種生物屏障，物質(zhì)在生物屏障中通過(guò)或穿過(guò)，或者物質(zhì)在生物屏障中、通過(guò)生物屏障或被生物屏障吸收。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置由微型通透性材料或通過(guò)微型通透性材料處理物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述處理進(jìn)一步包括以下至少一種分子的吸收、提取、排泄、代謝和分配。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性材料位于所述裝置的內(nèi)部或外部。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置進(jìn)一步包括至少一個(gè)與微型通透性材料連接的微流通道。
在一個(gè)實(shí)施方案中，流體通過(guò)所述裝置流動(dòng)的特性基于一種數(shù)學(xué)模型。在一個(gè)實(shí)施方案中，該數(shù)學(xué)模型是一種基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(″PBPK″)模型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述部件或通透性材料集成為芯片格式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置提供吸收特性、代謝酶活性和/或表達(dá)水平。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置進(jìn)一步包括位于微型通透性材料之中、之上或靠近其兩側(cè)的生物材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，位于微型通透性材料任一側(cè)上的生物材料為相同的類(lèi)型或不同的類(lèi)型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性材料包括能夠形成匯合單層的細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述粘合劑包括選自下列的至少一種蛋白質(zhì)、連接蛋白32、緊密連接蛋白、閉合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘著連接蛋白、E-鈣粘蛋白、β-聯(lián)蛋白、細(xì)胞粘附分子和桑椹粘著蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置進(jìn)一步包括靠近微型通透性材料的第一側(cè)面的血液替代物流動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述裝置進(jìn)一步包括靠近微型通透性材料的第二側(cè)面的膽汁替代物流動(dòng)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種方法，該方法包括將表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性的物質(zhì)以使該物質(zhì)極化的方式結(jié)合到微型通透性材料上。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是一種或多種肝細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)是遺傳工程生物材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括提供第二種物質(zhì)類(lèi)型。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將一種或多種成纖維細(xì)胞定位于微型通透性材料的至少一個(gè)表面附近。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性材料選自有機(jī)材料、無(wú)機(jī)材料、膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸鹽、膠原、MATRIGEL、細(xì)胞、細(xì)胞材料、組織和組織片中的至少一種。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將微型通透性材料定位于微孔表面之中、之上或附近。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性材料模擬以下至少一種生物屏障，物質(zhì)在生物屏障中通過(guò)或穿過(guò)，或者物質(zhì)在生物屏障中、通過(guò)生物屏障或被生物屏障吸收。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括由微型通透性材料或通過(guò)微型通透性材料處理物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述處理進(jìn)一步包括以下至少一種分子的吸收、提取、排泄、代謝和分配。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將微型通透性材料定位于裝置的內(nèi)部或外部。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括提供至少一個(gè)與微型通透性材料連接的微流通道。
在一個(gè)實(shí)施方案中，與肝功能的至少一個(gè)特性有關(guān)的流體流動(dòng)的特性基于一種數(shù)學(xué)模型。在一個(gè)實(shí)施方案中，該數(shù)學(xué)模型是一種基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(″PBPK″)模型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將微型通透性材料集成為芯片格式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括提供吸收特性、代謝酶活性和/或表達(dá)水平。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將生物材料定位于微型通透性材料之中、之上或靠近其兩側(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，位于微型通透性材料任一側(cè)上的生物材料為相同的類(lèi)型或不同的類(lèi)型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性材料包括能夠形成匯合單層的細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合包括提供選自下列至少一種的粘合劑蛋白質(zhì)、連接蛋白32、緊密連接蛋白、閉合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘著連接蛋白、E-鈣粘蛋白、β-聯(lián)蛋白、細(xì)胞粘附分子和桑椹粘著蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括提供靠近微型通透性材料的第一側(cè)面的血液替代物流動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括提供靠近微型通透性材料的第二側(cè)面的膽汁替代物流動(dòng)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種形成裝置的方法。該方法包括形成一種微型通透性材料，該材料構(gòu)造為結(jié)合并且極化表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性的物質(zhì)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種微型設(shè)備，該設(shè)備具有將表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性的物質(zhì)以使該物質(zhì)極化的方式結(jié)合到微型通透性材料上的設(shè)置。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種裝置，該裝置包括微型通透性材料和至少一種構(gòu)造為表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性的物質(zhì)，其中該物質(zhì)處理的分子被引導(dǎo)通過(guò)微型通透性材料的至少一部分。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種方法，該方法包括將物質(zhì)處理的分子引導(dǎo)通過(guò)微型通透性材料的至少一部分，其中該物質(zhì)設(shè)置為表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種形成裝置的方法。該方法包括形成微型通透性材料，該材料構(gòu)造為將物質(zhì)處理的分子引導(dǎo)通過(guò)微型通透性材料的至少一部分，其中該物質(zhì)設(shè)置為表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種裝置，該裝置具有將物質(zhì)處理的分子引導(dǎo)通過(guò)微型通透性材料的至少一部分的設(shè)置，其中該物質(zhì)設(shè)置為表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性。



圖1是根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的框圖。
圖2是本發(fā)明系統(tǒng)外部的一個(gè)實(shí)施方案的簡(jiǎn)化透視圖。
圖3是本發(fā)明系統(tǒng)的另一實(shí)施方案的詳細(xì)示圖。
圖4是本發(fā)明系統(tǒng)的另一實(shí)施方案的示意圖。
圖5A至5G顯示用來(lái)由塑料制造芯片的步驟。圖5A顯示用正性光刻膠(photoresist)材料涂覆硅晶片。圖5B顯示通過(guò)光材料將涂覆光刻膠的硅晶片暴露于紫外線(xiàn)。圖5C顯示曝光的(developing)光刻膠材料。圖5D顯示蝕刻硅。圖5E顯示在光刻膠材料上刻紋并且蒸發(fā)金。圖5F顯示電鍍鎳。圖5G顯示除去硅并模壓聚合物。
圖6是本發(fā)明系統(tǒng)的另一實(shí)施方案的示意圖。
圖7是詳述與芯片結(jié)合的計(jì)算機(jī)的圖示。
圖8是顯示位于外殼內(nèi)的一個(gè)以上芯片的圖示。
圖9是包括來(lái)自不同外殼的一組芯片的系統(tǒng)的圖示。
圖10是芯片的另一實(shí)施方案的圖示。
圖11是系統(tǒng)的等比例局部分解圖。
圖12是用于制造與圖11所示系統(tǒng)結(jié)合的芯片的步驟的等距視圖。
圖13是與圖11所示系統(tǒng)結(jié)合的泵的單溝槽彈性體部分的等距視圖。
圖14是泵的多溝槽彈性體部分的等距視圖。
圖15是四區(qū)室芯片的示意圖。
圖16是替加氟的劑量應(yīng)答。芯片在肝區(qū)室中接種HepG2-C3A細(xì)胞，在靶組織區(qū)室中接種HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞。該芯片用指定濃度的替加氟處理24小時(shí)。第一張圖(圖16A)是在芯片上再循環(huán)24小時(shí)后死亡細(xì)胞百分比相對(duì)于替加氟或5-FU濃度的圖。第二張圖(圖16B)是應(yīng)用48小時(shí)暴露，使用HCT 116細(xì)胞進(jìn)行傳統(tǒng)體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)獲得的類(lèi)似的劑量應(yīng)答。將HCT-116細(xì)胞接種到聚賴(lài)氨酸處理的蓋玻片上，并且暴露于指定濃度的替加氟或5-FU。在48小時(shí)孵育后，如上所述處理蓋玻片，并且確定細(xì)胞死亡的百分比。
圖17A顯示“第一代”三區(qū)室裝置。圖17B顯示該裝置的橫斷面視圖。
圖18A顯示“第二代”裝置。圖18B顯示腔室中5μm高的嵴，圖18C顯示腔室中20μm高的柱。
圖19顯示“第三代”裝置。
圖20是五區(qū)室PBPK模型CCA的流程圖。
圖21顯示人類(lèi)生物芯片原型，其含有肺、靶組織和其他組織的區(qū)室。區(qū)室和通道的尺寸如下 入口1mm×1mm 肝3.2mm寬，4mm長(zhǎng) 靶組織2mm寬，2mm長(zhǎng) 其他組織340μm寬，110mm長(zhǎng) 出口1mm×1mm 連接肝與Y連接的通道440μm寬 從Y連接到靶組織的通道100μm寬 圖22顯示微型芯片系統(tǒng)的示意圖。
圖23顯示Hep G2、HepG2/C3A和人類(lèi)肝臟的基礎(chǔ)CYP表達(dá)水平。來(lái)自3個(gè)單獨(dú)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖24A顯示HepG2/C3A在EMEM、DMEM、McCoy′s和RPMI中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。圖24B顯示HCT116在EMEM、DMEM、McCoy′s和RPMI中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。來(lái)自3個(gè)單獨(dú)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖25顯示在不同生長(zhǎng)培養(yǎng)基條件下HepG2/C3A中CYP同種型的表達(dá)的RT-PCR測(cè)定。
圖26顯示在不同基底上生長(zhǎng)的HepG2/C3A中CYP同種型表達(dá)的RT-PCR測(cè)定。
圖27顯示人類(lèi)生物芯片原型。
圖28A是說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案用于控制微型培養(yǎng)裝置的系統(tǒng)的框圖。圖28B是說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案用于控制微型培養(yǎng)裝置的系統(tǒng)的框圖。
圖29是說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案用于動(dòng)態(tài)控制微型培養(yǎng)裝置的計(jì)算機(jī)化方法的流程圖。
圖30是說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案用于控制微型培養(yǎng)裝置的計(jì)算機(jī)的框圖。
圖31顯示在一個(gè)實(shí)施方案中，在生理參數(shù)值類(lèi)似于體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的值的條件下，可以在體外提供和保持第一和第二流體系統(tǒng)之間的相互作用； 圖32顯示可以在體外模擬各種系統(tǒng)間相互作用的一些實(shí)例流體系統(tǒng)的框圖； 圖33A顯示兩種流體系統(tǒng)之間的實(shí)例相互作用； 圖33B顯示在一個(gè)實(shí)施方案中，一種給定的流體系統(tǒng)可以與一種以上的流體系統(tǒng)相互作用； 圖33C顯示在一個(gè)實(shí)施方案中，一種給定的流體系統(tǒng)可以與兩種以上的流體系統(tǒng)相互作用； 圖33D顯示在一個(gè)實(shí)施方案中，流體系統(tǒng)相互作用可以提供再循環(huán)功能； 圖34A顯示雙流體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的一種實(shí)例實(shí)施方案的局部分解圖，其中通透性材料可以促進(jìn)系統(tǒng)間相互作用； 圖34B顯示圖34A的雙流體系統(tǒng)的裝配圖； 圖34C顯示圖34A的雙流體系統(tǒng)的俯視圖； 圖34D顯示圖34A的系統(tǒng)的一種變形的一個(gè)實(shí)施方案； 圖35A顯示三流體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的一種實(shí)例實(shí)施方案的局部分解圖，其中一種或多種類(lèi)型的通透性材料可以促進(jìn)兩個(gè)系統(tǒng)間相互作用； 圖35B顯示圖35A的三流體系統(tǒng)的裝配圖； 圖36顯示一種三流體系統(tǒng)實(shí)例的框圖，其中器官系統(tǒng)顯示為與藥物遞送系統(tǒng)如胃腸(GI)系統(tǒng)和靶系統(tǒng)如腦系統(tǒng)相互作用； 圖37顯示涉及與肝臟有關(guān)的各種系統(tǒng)間相互作用的實(shí)例結(jié)構(gòu)的框圖，其中這些相互作用可以是再循環(huán)過(guò)程如腸肝循環(huán)的一部分； 圖38顯示圖37的腸肝循環(huán)的框圖； 圖39顯示微型通透性裝置的一個(gè)實(shí)施方案，其具有可以促進(jìn)兩個(gè)流體系統(tǒng)之間的一個(gè)或多個(gè)相互作用的通透性材料； 圖40A顯示微型通透性裝置的一個(gè)實(shí)施方案，其構(gòu)造為促進(jìn)血液和膽汁系統(tǒng)之間的相互作用； 圖40B顯示微型通透性裝置的一個(gè)實(shí)施方案，其構(gòu)造為促進(jìn)胃腸和血液系統(tǒng)之間的相互作用； 圖41A和41B顯示腸肝循環(huán)模擬裝置的一個(gè)實(shí)施方案的局部分解圖和裝配圖； 圖41C顯示圖41A的另一局部分解圖，其中詳細(xì)示出了微型通透性裝置的一個(gè)實(shí)施方案； 圖42顯示圖41A和41B的實(shí)例腸肝循環(huán)模擬裝置中可以進(jìn)行的各種流體流動(dòng)的示意圖； 圖43A至43E顯示制造圖39的微型通透性裝置的一個(gè)實(shí)施方案的各個(gè)階段； 圖44顯示制造圖43A至43D的微型通透性裝置的過(guò)程的一個(gè)實(shí)施方案； 圖45顯示可以由微型通透性裝置促進(jìn)的系統(tǒng)間相互作用的非限制性實(shí)例； 圖46顯示可以由微型通透性裝置促進(jìn)的第一和第二系統(tǒng)之間的系統(tǒng)間相互作用的概括圖示；和 圖47顯示在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性裝置可以構(gòu)造為促進(jìn)在同一層上形成的兩個(gè)區(qū)室之間的系統(tǒng)間相互作用，其中這兩個(gè)區(qū)室是兩個(gè)不同系統(tǒng)的部分。
在閱讀以下的詳細(xì)描述和參閱附圖后，本申請(qǐng)教導(dǎo)的這些和其他方面、優(yōu)點(diǎn)和新特征將是顯而易見(jiàn)的。在這些附圖中，類(lèi)似的元件使用類(lèi)似的數(shù)字標(biāo)記。
實(shí)施方案詳述 本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種微型細(xì)胞培養(yǎng)模擬(CCA)系統(tǒng)。該微型CCA系統(tǒng)與以前的微型系統(tǒng)相比具有許多優(yōu)點(diǎn)。該微型系統(tǒng)使用較少量的試劑、較少的細(xì)胞(這允許采用真正的原代細(xì)胞而不是培養(yǎng)的細(xì)胞)、在生理學(xué)上更加現(xiàn)實(shí)(例如，停留時(shí)間、器官比、剪應(yīng)力)、裝置成本更低、尺寸更小(可以進(jìn)行多種檢驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析)。而且，可以將多個(gè)生物傳感器集成在同一芯片上。
最簡(jiǎn)單地，本發(fā)明的芯片提供整個(gè)動(dòng)物或人的精確體外替代物。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，使用基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(PBPK)模型—一種將身體表示為互相連接的特定器官特異性區(qū)室的數(shù)學(xué)模型—產(chǎn)生最初的設(shè)計(jì)。根據(jù)PBPK模型和發(fā)表的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，長(zhǎng)期、廣泛的發(fā)展計(jì)劃產(chǎn)生了一種微型裝置，該裝置精確地模擬了已知的組織大小比、組織∶血液體積比、藥物停留時(shí)間和整個(gè)動(dòng)物或人的其他重要的生理參數(shù)。本質(zhì)上，本發(fā)明的芯片技術(shù)是整個(gè)動(dòng)物或人的微型模型(對(duì)于人為大約1/100,000)。
在運(yùn)行中，該裝置通過(guò)將活細(xì)胞分隔為不連續(xù)的、相互連接的“器官”區(qū)室而復(fù)制再循環(huán)的多器官系統(tǒng)(參見(jiàn)，例如，圖15)。設(shè)計(jì)流體系統(tǒng)，以精確地模擬循環(huán)系統(tǒng)的主要元件和器官系統(tǒng)的相互作用。每個(gè)器官區(qū)室含有仔細(xì)選擇的或者工程構(gòu)建為模擬相應(yīng)整個(gè)器官的主要功能(例如肝臟的生物異源物質(zhì)代謝)的特定細(xì)胞型。細(xì)胞型可以是附著的或非附著的，并且來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)系或原發(fā)組織。人細(xì)胞用做人類(lèi)替代物或適當(dāng)?shù)厥褂脕?lái)自其他物種的細(xì)胞。
器官區(qū)室由作為“血液替代物”起作用的再循環(huán)培養(yǎng)基連接。培養(yǎng)基中的受檢試劑分布在器官區(qū)室中并與其中的細(xì)胞相互作用，如同它們?cè)谌梭w中或整個(gè)動(dòng)物中一樣。這些化合物和/或其代謝物對(duì)各種細(xì)胞型的效果通過(guò)檢測(cè)或監(jiān)測(cè)諸如細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖、分化、免疫應(yīng)答、或干擾代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等關(guān)鍵生理事件來(lái)檢測(cè)。另外，藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)可以通過(guò)收集和分析培養(yǎng)基等份中的藥物代謝物來(lái)確定。
本發(fā)明的微型芯片裝置具有傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)在成本和通量方面的優(yōu)點(diǎn)，以及整體動(dòng)物模型的高信息含量。但是與整體動(dòng)物試驗(yàn)不同，該芯片便宜而且大多是一次性的。低流體體積(大約5μl)的裝置提供微流體裝置的高靈敏度和通量特性。而且，該裝置的讀數(shù)是非常靈活的和獨(dú)立于試驗(yàn)的——幾乎任何細(xì)胞型或試驗(yàn)都可以不加改變地使用?？梢岳么罅炕诠鈱W(xué)探詢(xún)(interrogation)和讀取的生物測(cè)定(例如熒光、發(fā)光)，從而使實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)可行。此外，可以直接使用標(biāo)準(zhǔn)病理學(xué)、生物化學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)定，因?yàn)樵撓到y(tǒng)可以設(shè)計(jì)為與傳統(tǒng)蓋玻片(22mm×22mm)或96孔形式完全相容。此外，遺傳工程細(xì)胞也可以用于特定的最終用戶(hù)應(yīng)用。另外，可以利用包括其他區(qū)室和模塊的“3D”芯片分析胃腸道或血-腦屏障吸收。
與傳統(tǒng)體外試驗(yàn)不同，本發(fā)明的芯片更接近地模擬整個(gè)生物體的復(fù)雜的多組織(肝臟、肺、脂肪、循環(huán)系統(tǒng)等)生物學(xué)。候選藥物暴露于更現(xiàn)實(shí)的動(dòng)物或人類(lèi)生理環(huán)境，因此比典型的體外試驗(yàn)提供更高和更精確的信息內(nèi)容(例如吸收、分布、生物積累、代謝、排泄、效力和毒性)。這些優(yōu)點(diǎn)直接影響了對(duì)先導(dǎo)藥物的安全性和效力的預(yù)測(cè)，特別是在進(jìn)入昂貴且耗時(shí)的非臨床或臨床試驗(yàn)之前的優(yōu)化。這種優(yōu)化由于允許在進(jìn)入這些試驗(yàn)之前快速且直接地評(píng)價(jià)潛在的毒性或有效性的缺乏，而提高了藥物開(kāi)發(fā)通量、減少了毒理學(xué)篩選所需的動(dòng)物數(shù)量、降低了非臨床研究的成本、并且提高了臨床試驗(yàn)的有效性。
這些證明了本發(fā)明的芯片技術(shù)的一些優(yōu)點(diǎn)?？傊c傳統(tǒng)體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)、動(dòng)物研究或臨床試驗(yàn)相比，數(shù)據(jù)的獲得比較快速。數(shù)據(jù)也是有力的，提供了無(wú)法由傳統(tǒng)體外試驗(yàn)獲得的高度預(yù)測(cè)性的內(nèi)容。芯片平臺(tái)設(shè)計(jì)為與現(xiàn)有的試驗(yàn)—標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片或96孔形式—完全相容。裝置本身可為任何動(dòng)物種或多器官區(qū)室的組合而構(gòu)造。單個(gè)芯片的價(jià)格具有成本效益，是一次性的。而且，該裝置的小體積進(jìn)一步降低了篩選潛在化合物中的試劑成本。
與當(dāng)前可以利用的技術(shù)不同，本發(fā)明的芯片系統(tǒng)不僅在臨床階段而且在減少進(jìn)行臨床前試驗(yàn)所需的化合物數(shù)量方面大大提高了成功率。因此，制藥公司可以(1)在開(kāi)發(fā)過(guò)程早期確定哪種候選藥物對(duì)人類(lèi)可能具有毒性；(2)較好地選擇最佳預(yù)測(cè)人類(lèi)應(yīng)答的動(dòng)物種；和(3)確定哪種候選藥物可能具有有效性。因此，本發(fā)明的芯片大大提高了成功率并且縮短了可市場(chǎng)化的藥物的開(kāi)發(fā)時(shí)間。 基于藥代動(dòng)力學(xué)的微型培養(yǎng)裝置 提供了用于CCA裝置的裝置、體外細(xì)胞培養(yǎng)物和方法。該方法和裝置提供在體外將細(xì)胞保持在生理學(xué)代表性環(huán)境中的設(shè)置，由此提高篩選和毒性試驗(yàn)的預(yù)測(cè)值和體內(nèi)相關(guān)性。本發(fā)明的微型藥代動(dòng)力學(xué)培養(yǎng)裝置在每一培養(yǎng)腔室中接種適當(dāng)?shù)募?xì)胞，然后將該培養(yǎng)系統(tǒng)用于化合物篩選、毒性測(cè)定、開(kāi)發(fā)目標(biāo)細(xì)胞的模型、感染動(dòng)力學(xué)模型等。向建立的培養(yǎng)系統(tǒng)中增加輸入變量，該變量可以是，例如，化合物、樣品、基因序列、病原體、細(xì)胞(例如干細(xì)胞或祖細(xì)胞)?？梢栽u(píng)價(jià)各種細(xì)胞輸出，以確定細(xì)胞對(duì)輸入變量的應(yīng)答，該輸出包括培養(yǎng)基的pH、培養(yǎng)基中O2和CO2的濃度、蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)、細(xì)胞存活力、或細(xì)胞產(chǎn)物向培養(yǎng)基中的釋放。
培養(yǎng)基底或裝置的設(shè)計(jì)和幾何形狀提供了本發(fā)明獨(dú)特的生長(zhǎng)條件。每個(gè)裝置包括一個(gè)或多個(gè)腔室，這些腔室通過(guò)流體通道互相連接。每個(gè)腔室可以具有與該裝置中存在的其他腔室不同的幾何結(jié)構(gòu)。例如，該裝置的一個(gè)實(shí)施方案由代表肺、肝臟和其他組織的腔室組成(圖18A)。為了達(dá)到現(xiàn)實(shí)的細(xì)胞∶液體體積比和液體停留時(shí)間，該實(shí)施方案中的肺腔室包括5μm高的嵴(圖18B)。為了達(dá)到現(xiàn)實(shí)的細(xì)胞∶液體體積比和液體停留時(shí)間，該實(shí)施方案中的肝腔室含有20μm高的柱(圖18C)。該裝置還含有入口和出口，使得培養(yǎng)基可以循環(huán)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)裝置是芯片格式，即，腔室和流體通道由制造母版制造或模建，使得該裝置形成為單一單元或在單獨(dú)單元上具有一個(gè)或多個(gè)腔室的模塊系統(tǒng)。通常提供小型的芯片格式，通常側(cè)邊不超過(guò)大約10cm，或者甚至不超過(guò)大約5cm。其側(cè)邊甚至可以?xún)H為大約2cm或更小。在另一個(gè)實(shí)例中，芯片可以以96孔格式嵌入，其中單個(gè)芯片小于0.9cm×0.9cm。腔室和流體通道在尺寸上相應(yīng)地是微型的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)裝置是由桌面設(shè)備組成的集成裝置的形式，該裝置中包裝有多個(gè)制造為基于聚合物的一次性塑料部件的微型芯片。該設(shè)備可以包括基底，該基底上具有凹陷部，以容納各個(gè)細(xì)胞芯片，或標(biāo)準(zhǔn)96孔格式的單個(gè)“芯片”(即，8×12格式的96個(gè)單個(gè)芯片)。設(shè)備頂部在關(guān)閉時(shí)密封這些芯片并且提供流體互相連通。該設(shè)備含有將流體再循環(huán)到芯片上的低容量泵，以及具有注射環(huán)路的小的三通閥，以提供受試化合物的引入，或者直接從96或384孔板吸取化合物。使用該設(shè)備可以同時(shí)評(píng)價(jià)多種化合物的效力、毒性和/或代謝物產(chǎn)生。該設(shè)備也可以集成芯片上的熒光檢測(cè)，以使用良好表征的生物標(biāo)記進(jìn)行實(shí)時(shí)生理學(xué)監(jiān)測(cè)。
該裝置可以包括從細(xì)胞和培養(yǎng)基獲得信號(hào)的機(jī)構(gòu)?？梢詫?shí)時(shí)監(jiān)測(cè)來(lái)自不同腔室和通道的信號(hào)。例如，生物傳感器可以集成到該裝置中或者位于其外部，其允許實(shí)時(shí)讀取系統(tǒng)中細(xì)胞的生理學(xué)狀態(tài)。
本發(fā)明提供一種理想的高通量篩選系統(tǒng)，用于鑒定對(duì)許多物質(zhì)如藥物組合物、疫苗制品、細(xì)胞毒性化學(xué)藥品、誘變劑、細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、激素、抑制性化合物、化療劑和許多其他化合物或因子的陽(yáng)性或陰性應(yīng)答。受試物質(zhì)可以是天然存在的，也可以是合成的，并且可以是有機(jī)的或無(wú)機(jī)的。
例如，細(xì)胞毒性化合物的活性可以根據(jù)其損傷或殺死培養(yǎng)中的細(xì)胞的能力來(lái)測(cè)定。這可以通過(guò)活體染色技術(shù)容易地評(píng)價(jià)。生長(zhǎng)/調(diào)節(jié)因子的效應(yīng)可以通過(guò)分析基質(zhì)的細(xì)胞含量例如通過(guò)總細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)。這可以使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞學(xué)和/或組織學(xué)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括使用采用限定類(lèi)型特異性細(xì)胞抗原的抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)?？梢栽u(píng)價(jià)各種藥物對(duì)在該裝置中培養(yǎng)的正常細(xì)胞的作用。例如，可以在骨髓培養(yǎng)物上檢測(cè)提高紅細(xì)胞形成的藥物。例如通過(guò)降低膽固醇產(chǎn)量影響膽固醇代謝的藥物可以在肝系統(tǒng)上檢測(cè)。腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物可以作為模型系統(tǒng)，例如，用于檢測(cè)抗腫瘤劑的效力。
本發(fā)明的裝置可以用作研究生理學(xué)或病理學(xué)條件的模型系統(tǒng)。例如，在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，一種裝置可以用作血-腦屏障模型；這種模型系統(tǒng)可以用來(lái)研究物質(zhì)通過(guò)血-腦屏障的滲透。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，并非作為限制，一種含有粘膜上皮的系統(tǒng)可以用作研究皰疹病毒或乳頭瘤病毒感染的模型系統(tǒng)；這種模型系統(tǒng)可以周來(lái)檢測(cè)抗病毒藥物的效力。
本發(fā)明的裝置也可以用來(lái)輔助惡性腫瘤和疾病的診斷和治療。例如，可以從懷疑具有惡性腫瘤的患者中采集任何組織(例如骨髓、皮膚、肝臟)的活檢樣品。患者的培養(yǎng)物可以在體外用于篩選細(xì)胞毒性和/或藥物化合物，以鑒定最有效的化合物，即，殺死惡性腫瘤或疾病細(xì)胞而放過(guò)正常細(xì)胞的那些化合物。然后可以用這些試劑治療性地治療患者。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該裝置可以在體外用來(lái)高產(chǎn)率地產(chǎn)生生物產(chǎn)物。例如，天然產(chǎn)生大量特定生物產(chǎn)物(例如生長(zhǎng)因子、調(diào)節(jié)因子、肽激素、抗體)的細(xì)胞或遺傳工程化為產(chǎn)生外源基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞可以使用體外裝置克隆擴(kuò)增。如果轉(zhuǎn)化的細(xì)胞向營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中分泌基因產(chǎn)物，則可以使用標(biāo)準(zhǔn)分離方法(例如HPLC、柱層析、電泳技術(shù)，僅以此為例)從消耗的或條件培養(yǎng)基中容易地分離該產(chǎn)物。“生物反應(yīng)器”可以設(shè)計(jì)為利用連續(xù)流動(dòng)方法在體外向培養(yǎng)物中補(bǔ)料。實(shí)質(zhì)上，由于新鮮培養(yǎng)基通過(guò)裝置中的培養(yǎng)物，基因產(chǎn)物將與從培養(yǎng)物中釋放的細(xì)胞一起從培養(yǎng)物中洗出?；虍a(chǎn)物可以從消耗的或條件培養(yǎng)基的流出物中分離(例如，通過(guò)HPLC、柱層析、電泳)。
本發(fā)明也提供用于篩選或測(cè)定各種環(huán)境條件或化合物對(duì)生物系統(tǒng)的影響的系統(tǒng)。例如，可以在裝置中模擬或改變空氣或水條件?？梢詸z測(cè)不同已知的或懷疑的毒性物質(zhì)的影響。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于篩選消費(fèi)產(chǎn)品如化妝品、清潔劑或洗液的系統(tǒng)。也提供了用于確定營(yíng)養(yǎng)品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑或食品添加劑的安全性和/或效力的系統(tǒng)。本發(fā)明也可以作為微型生物反應(yīng)器或細(xì)胞群體平臺(tái)用于大量產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)品。
使用本發(fā)明的芯片格式微型培養(yǎng)裝置的典型效力或毒性實(shí)驗(yàn)在24-48小時(shí)或更短的時(shí)間內(nèi)完成，這取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。然而，為了檢測(cè)長(zhǎng)期暴露(例如基因毒性、致癌性或潛伏性疾病)的效果，也可以進(jìn)行延長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明提供如本說(shuō)明書(shū)所述的新型裝置、系統(tǒng)和方法。通常，除非另外明確說(shuō)明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。為了清楚起見(jiàn)，下面列出了本文使用的特定術(shù)語(yǔ)的定義來(lái)描述本發(fā)明。除非另外明確說(shuō)明，在貫穿本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)這些術(shù)語(yǔ)使用這些定義。術(shù)語(yǔ)的定義 基于藥代動(dòng)力學(xué)的培養(yǎng)系統(tǒng)一種體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中細(xì)胞保持在提供模擬在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的值的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值的條件下。藥代動(dòng)力學(xué)培養(yǎng)裝置包含分隔為不連續(xù)的但是互相連接的腔室的通道流體網(wǎng)絡(luò)，其中具體的腔室?guī)缀涡螤钤O(shè)計(jì)為提供與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)細(xì)胞、組織或器官系統(tǒng)的參數(shù)相關(guān)的細(xì)胞相互作用、液體流動(dòng)和液體停留參數(shù)。該裝置接種適合所模擬的條件的細(xì)胞，例如在基于肝臟的培養(yǎng)腔室中接種肝細(xì)胞、在基于肺的培養(yǎng)腔室中接種肺細(xì)胞，等等，以提供培養(yǎng)系統(tǒng)。
本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)提供與在體內(nèi)獲得的目標(biāo)細(xì)胞、組織或器官系統(tǒng)的值相當(dāng)?shù)闹辽僖粋€(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值，優(yōu)選至少兩個(gè)參數(shù)值，并且可以提供三個(gè)或多個(gè)相當(dāng)?shù)膮?shù)值。感興趣的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括，例如，細(xì)胞之間的相互作用、液體停留時(shí)間、液體∶細(xì)胞比、細(xì)胞的代謝、或剪應(yīng)力。
相當(dāng)?shù)闹凳侵笇?shí)際值與理論值偏離不超過(guò)25％。例如，大鼠的肺區(qū)室中液體停留時(shí)間的計(jì)算值或理論值為2秒，而在大鼠CCA裝置的肺細(xì)胞培養(yǎng)腔室中測(cè)定的實(shí)際值為2.5+/-0.7秒。
藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值利用PBPK模型方程獲得。該方程在本領(lǐng)域中已有描述，例如，參見(jiàn)，Poulin和Theil(2000)J Pharm Sci.89(1)16-35；Slob等人.(1997)Crit Rev Toxicol.27(3)261-72；Haddad等人.(1996)Toxicol Lett.85(2)113-26；Hoang(1995)Toxicol Lett.79(1-3)99-106；Knaak等人.(1995)Toxicol Lett.79(1-3)87-98；以及Ball和Schwartz(1994)Comput Biol Med.24(4)269-76，引入本文作為參考。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)也可以從發(fā)表的文獻(xiàn)中獲得，例如，參見(jiàn)Buckpitt等人，(1984)J.Pharmacol.Exp.Ther.231291-300；DelRaso(1993)Toxicol.Lett.6891-99；Haies等人，(1981)Am.Rev.Respir.Dis.123533-541。
感興趣的具體生理學(xué)參數(shù)包括組織或器官的液體停留時(shí)間、組織或器官質(zhì)量、液體∶細(xì)胞體積比、細(xì)胞剪應(yīng)力等。生理學(xué)相關(guān)參數(shù)值可以按照常規(guī)方法根據(jù)經(jīng)驗(yàn)獲得，或者可以從本領(lǐng)域已知的和可公開(kāi)獲得的值獲得。獲得動(dòng)物、通常是哺乳動(dòng)物的目標(biāo)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值，盡管也可以使用其他動(dòng)物模型，例如，昆蟲(chóng)、魚(yú)、爬行動(dòng)物或禽類(lèi)。哺乳動(dòng)物包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠，具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的哺乳動(dòng)物，例如，馬、綿羊、山羊、牛、犬或貓；靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，包括猴、猿或人類(lèi)；等等。對(duì)于不同年齡的動(dòng)物，例如，胚胎、新生、嬰幼、幼年、成年或老年期動(dòng)物；以及對(duì)于不同的生理狀態(tài)，例如，患病、接觸藥物活性劑后、感染后、或在大氣壓改變的條件下，可以獲得并且使用不同的值。
在培養(yǎng)系統(tǒng)的數(shù)據(jù)處理部件中任選地提供與藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值有關(guān)的信息以及適用于將在該系統(tǒng)中模擬的各種物質(zhì)的質(zhì)量平衡方程，例如，存儲(chǔ)于通用存儲(chǔ)器中的查閱表，等等。這些方程代表用于該系統(tǒng)中各種生物/化學(xué)物質(zhì)的基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)模型。
藥代動(dòng)力學(xué)培養(yǎng)裝置本發(fā)明的培養(yǎng)裝置為細(xì)胞生長(zhǎng)提供基底。每個(gè)裝置含有至少一個(gè)腔室，通常至少兩個(gè)腔室，并且可以含有三個(gè)或多個(gè)腔室，其中這些腔室通過(guò)流體通道相互連接。這些腔室可以設(shè)置在一個(gè)基板上，也可以設(shè)置在不同的基板上。優(yōu)選地，每個(gè)腔室具有與該裝置上的其他腔室不同的幾何結(jié)構(gòu)。該裝置具有一個(gè)密封腔室和通道的蓋子，并且具有允許培養(yǎng)基再循環(huán)的至少一個(gè)入口和一個(gè)出口。該裝置含有泵送培養(yǎng)基通過(guò)該系統(tǒng)的機(jī)構(gòu)。培養(yǎng)基設(shè)計(jì)為保持培養(yǎng)的細(xì)胞的存活力。該裝置含有可以將受試化合物導(dǎo)入系統(tǒng)中的機(jī)構(gòu)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該裝置微型地制造為側(cè)邊不超過(guò)大約2.5cm的單一單元，優(yōu)選地包含至少兩個(gè)互相連接的腔室。兩個(gè)器官區(qū)室通過(guò)大約50-150μm寬、15-25μm深的通道連接。例如，一個(gè)腔室可以代表肺，包含相互連接的平行通道的陣列，通常是至少大約10個(gè)通道，優(yōu)選地至少大約20個(gè)通道。這些通道可以具有典型的微流尺寸，例如大約30-50μm寬、5-15μm深和3-7mm長(zhǎng)。另外一個(gè)區(qū)室可以代表肝，包含兩個(gè)或多個(gè)平行的通道，通常大約50-150μm寬、15-25μm深和5-15cm長(zhǎng)，為蛇形。
該裝置通常包括用于從細(xì)胞和培養(yǎng)基中獲得信號(hào)的機(jī)構(gòu)。可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)來(lái)自不同腔室和通道的信號(hào)。例如，生物傳感器可以集成在該裝置中或者位于其外部，其允許實(shí)時(shí)讀取系統(tǒng)中細(xì)胞的生理狀態(tài)。
本發(fā)明的藥代動(dòng)力學(xué)培養(yǎng)裝置可以作為芯片或基板提供。除了提高流體動(dòng)力學(xué)以外，這些微系統(tǒng)還節(jié)省空間，特別是在高度平行的系統(tǒng)中使用時(shí)，并且可以便宜地產(chǎn)生。該培養(yǎng)裝置可以由諸如但不限于聚苯乙烯的聚合物形成，并且在使用一次后丟棄，不需要滅菌。因此，體外子系統(tǒng)可以便宜地生產(chǎn)并且廣泛地應(yīng)用。另外，細(xì)胞可以以三維方式生長(zhǎng)，例如，形成管形物，該管形物更接近地復(fù)制體內(nèi)環(huán)境。
為了模擬動(dòng)物對(duì)任何特定試劑的代謝應(yīng)答，平行或多路陣列庫(kù)包含多個(gè)(即至少兩個(gè))細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中每個(gè)系統(tǒng)可以相同，或者可以隨預(yù)定的參數(shù)值或輸入試劑和濃度而不同。該陣列可以包含至少大約10個(gè)、甚至多達(dá)100個(gè)或更多系統(tǒng)。有利地，微芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以容納在單個(gè)腔室內(nèi)，使得所有細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)在測(cè)定過(guò)程中暴露于相同的條件下。
此外，多個(gè)芯片可以互相連接，形成單個(gè)裝置，例如，模擬胃腸屏障或血腦屏障。
細(xì)胞在本發(fā)明的試驗(yàn)中使用的細(xì)胞可以是一種有機(jī)體、來(lái)源于一種有機(jī)體的單細(xì)胞型，并且可以是細(xì)胞型的混合物，如體內(nèi)環(huán)境典型的情況。培養(yǎng)條件可以包括，例如，溫度、pH、因子的存在、其他細(xì)胞型的存在，等等?？梢允褂枚喾N動(dòng)物細(xì)胞，包括如前所述可以獲得其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值的任何動(dòng)物。
本發(fā)明適合應(yīng)用任何細(xì)胞型，包括原代細(xì)胞、干細(xì)胞、祖細(xì)胞、正常的、遺傳修飾的、遺傳改變的、無(wú)限增殖化的、和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。本發(fā)明適合應(yīng)用單細(xì)胞型或細(xì)胞系，或者與不同細(xì)胞型組合。優(yōu)選地，培養(yǎng)的細(xì)胞保持對(duì)刺激應(yīng)答的能力，該刺激在其天然存在的對(duì)應(yīng)物中引起應(yīng)答。這些細(xì)胞可以來(lái)源于所有來(lái)源，例如真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。真核細(xì)胞實(shí)際上可以是植物或動(dòng)物細(xì)胞，如人、猿或嚙齒類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞。它們可以是任何組織型(例如心臟、胃、腎、腸、肺、肝、脂肪、骨、軟骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、骨髓、肌肉、腦、胰)和細(xì)胞型(例如上皮、內(nèi)皮、間質(zhì)、脂肪細(xì)胞、造血細(xì)胞)的。此外，也可以使用組織或器官的橫截面。例如，也可以使用動(dòng)脈、靜脈、胃腸道、食道或結(jié)腸的橫截面。
另外，本發(fā)明可以使用經(jīng)遺傳改變或修飾為含有非天然“重組”(也被稱(chēng)為“外源”)核酸序列或者通過(guò)反義技術(shù)修飾為提供遺傳功能增加或損失的細(xì)胞。產(chǎn)生遺傳修飾的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的，參見(jiàn)，例如“Current Protocols in Molecular Biology，”Ausubel等人，eds，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，2000。細(xì)胞可以最終分化或不分化，如干細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞可以是來(lái)自多種遺傳學(xué)上不同的個(gè)體的培養(yǎng)的細(xì)胞，這些個(gè)體對(duì)生物劑和藥劑可以有不同的應(yīng)答。遺傳多樣性可以間接和直接地影響疾病易感性。在直接影響的情況下，甚至導(dǎo)致單核苷酸多態(tài)性(SNP)的單核苷酸改變也可以改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，并且直接貢獻(xiàn)于疾病或疾病易感性。例如，某些APO-載脂蛋白E基因型與某些個(gè)體中阿爾茨海默病的發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)。
當(dāng)某些多態(tài)性與特定疾病表型相關(guān)時(shí)，可以研究來(lái)自被鑒定為多態(tài)性載體的個(gè)體的細(xì)胞的發(fā)育異常，使用來(lái)自非載體的細(xì)胞作為對(duì)照。本發(fā)明提供用于研究與特定遺傳疾病表現(xiàn)有關(guān)的發(fā)育異常的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，因?yàn)閹追N不同的細(xì)胞型可以同時(shí)研究，并且與相關(guān)的細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。例如，在裝置中可以使用神經(jīng)元祖細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)來(lái)源的其他細(xì)胞來(lái)表征化合物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞效應(yīng)。也可以建立系統(tǒng)，從而可以研究細(xì)胞，以鑒定影響藥物敏感性、趨化因子和細(xì)胞因子應(yīng)答、對(duì)生長(zhǎng)因子、激素和抑制劑的應(yīng)答、以及對(duì)受體表達(dá)和/或功能改變的應(yīng)答的遺傳元件。該信息在設(shè)計(jì)對(duì)于基因來(lái)源的或具有遺傳傾向的疾病的治療方法方面可能是非常有價(jià)值的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞與藥物活性化合物的解毒和代謝有關(guān)，例如肝臟細(xì)胞，包括肝細(xì)胞；腎細(xì)胞，包括腎小管細(xì)胞；脂肪細(xì)胞，包括可以長(zhǎng)時(shí)間保持有機(jī)化合物的脂肪細(xì)胞。這些細(xì)胞可以與參與呼吸和供氧過(guò)程的細(xì)胞如肺細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中組合。這些細(xì)胞也可以與對(duì)目標(biāo)試劑損傷特別敏感的細(xì)胞組合，例如腸上皮細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和其他快速分化的正常細(xì)胞，用于影響細(xì)胞分化的試劑。神經(jīng)細(xì)胞可以用來(lái)監(jiān)測(cè)試劑對(duì)神經(jīng)毒性的影響，等等。
腫瘤的生長(zhǎng)特征和周?chē)M織和免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的應(yīng)答也是有意義的?？梢匝芯客诵行约膊?，包括受影響的組織和周?chē)膮^(qū)域，來(lái)確定受影響的組織的應(yīng)答以及與身體其他部分的相互作用。
術(shù)語(yǔ)“環(huán)境”或“培養(yǎng)條件”包括細(xì)胞、培養(yǎng)基、因子、時(shí)間和溫度。環(huán)境也可以包括藥物和其他化合物，特別是大氣條件、pH、鹽組成、礦物質(zhì)等。細(xì)胞培養(yǎng)一般在模擬生理?xiàng)l件的無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，例如，在37℃下在含有潮濕92-95％空氣/5-8％CO2大氣的孵箱中進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)可以在含有不確定的生物液體如胎牛血清的營(yíng)養(yǎng)混合物中或完全確定的和不含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行。有多種培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中已知，并且可以從商業(yè)上獲得。
如本文使用的術(shù)語(yǔ)“生理?xiàng)l件”定義為表示非常具體地監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)條件，以盡可能接近地模擬體內(nèi)特定細(xì)胞型的天然組織條件。這些條件包括諸如液體停留時(shí)間(即液體在器官中滯留的時(shí)間)、細(xì)胞∶血液體積比、對(duì)細(xì)胞的剪應(yīng)力、與天然器官相當(dāng)?shù)膮^(qū)室大小等參數(shù)。
篩選試驗(yàn)藥物、毒素、細(xì)胞、病原體、樣品等在本文中通稱(chēng)為“輸入變量”，通過(guò)將其加入基于藥代動(dòng)力學(xué)的培養(yǎng)系統(tǒng)中，然后評(píng)價(jià)培養(yǎng)的細(xì)胞的目標(biāo)輸出變量例如O2消耗、CO2產(chǎn)生、細(xì)胞存活力或目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，來(lái)篩選其生物活性。輸入變量一般以溶液或易溶形式添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中。輸入變量可以使用流通(flow-through)系統(tǒng)添加，或者向靜態(tài)溶液中添加大丸劑。在流通系統(tǒng)中，使用兩種流體，其中一種是生理中性溶液，另一種是加有受試化合物的相同溶液。第一流體在細(xì)胞上通過(guò)，然后是第二流體。在單溶液方法中，向圍繞細(xì)胞的基質(zhì)體積中添加受試輸入變量的大丸劑。培養(yǎng)基的總組成應(yīng)當(dāng)不隨大丸劑的添加而顯著變化，或者在流通方法中，在兩種溶液之間沒(méi)有顯著變化。
優(yōu)選的輸入變量制劑不包括對(duì)總體制劑具有顯著影響的額外的成分，如防腐劑。因此，優(yōu)選的制劑包括生物活性劑和生理學(xué)可接受的載體，例如水、乙醇或DMSO。然而，如果試劑是不含賦形劑的液體，則該制劑可以?xún)H是化合物本身。
優(yōu)選的輸入變量包括但不限于病毒、病毒顆粒、脂質(zhì)體、納米顆粒、可生物降解聚合物、放射性標(biāo)記的顆粒、放射性標(biāo)記的生物分子、毒素偶聯(lián)的顆粒、毒素偶聯(lián)的生物分子、和與穩(wěn)定劑偶聯(lián)的顆?；蛏锓肿印！胺€(wěn)定劑”是用來(lái)穩(wěn)定化藥物并提供控制釋放的試劑。這些試劑包括明礬、聚乙二醇、聚(乙烯-共聚-乙酸乙烯酯)和聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
可以用不同的輸入變量濃度平行地進(jìn)行多種測(cè)定，以獲得對(duì)各種濃度的不同的應(yīng)答。本領(lǐng)域中已知，確定試劑的有效濃度一般使用從1∶10或其他對(duì)數(shù)規(guī)模的稀釋度產(chǎn)生的濃度范圍。必要時(shí)，該濃度可以進(jìn)一步用第二系列的稀釋度優(yōu)化。一般使用這些濃度中的一個(gè)作為陰性對(duì)照，即零濃度或低于檢測(cè)水平以下。
目標(biāo)輸入變量包括大量化學(xué)類(lèi)別，但通常是有機(jī)分子。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是使用本發(fā)明的方法根據(jù)毒性篩選樣品，例如環(huán)境樣品或藥物。候選試劑可以包含與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)相互作用(特別是氫鍵鍵合)所需的官能團(tuán)，一般包括至少一個(gè)胺、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個(gè)化學(xué)官能團(tuán)。候選試劑通常包含環(huán)碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或被一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代的芳香族或多環(huán)芳香族結(jié)構(gòu)。候選試劑也可以是生物分子，包括肽、糖類(lèi)、脂肪酸、類(lèi)固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或其組合。
包括藥理活性藥物和遺傳活性分子。目標(biāo)化合物包括化療劑、抗炎劑、激素或激拮抗劑、離子通道修飾劑、神經(jīng)活性劑。適合本發(fā)明的藥劑的例子描述于″The Pharmacological Basis ofTherapeutics，″Goodman和Gilman，McGraw-Hill，New York，N.Y.，(1996)，第九版，以下章節(jié)Drugs Acting at Synaptic andNeuroeffector Junctional Sites；Drugs Acting on the CentralNervous System；AutacoidsDrug Therapy of Inflammation；Water，Salts and Ions；Drugs Affecting Renal Function and ElectrolyteMetabolism；Cardiovascular Drugs；Drugs AffectingGastrointestinal Function；Drugs Affecting Uterine Motility；Chemotherapy of Parasitic Infections；Chemotherapy ofMicrobial Diseases；Chemotherapy of Neoplastic Diseases；DrugsUsed for Immunosuppression；Drugs Acting on Blood-FormingOrgans；Hormones and Hormone Antagonists；Vitamins，Dermatology；and-Toxicology，均引入本文作為參考。也包括毒素和生物及化學(xué)戰(zhàn)劑，例如，參見(jiàn)Somani，S.M.(Ed.)，″ChemicalWarfare Agents，″Academic Press，New York，1992。
受試化合物包括上述所有類(lèi)別的分子，可進(jìn)一步包括未知內(nèi)含物的樣品。盡管許多樣品在溶液中包含化合物，但是也可以測(cè)定可以溶解在適當(dāng)溶劑中的固體樣品。目標(biāo)樣品包括環(huán)境樣品，例如地下水、海水或采礦廢物；生物樣品，例如由作物或組織樣品制備的裂解物；制造樣品，例如藥物制備過(guò)程中的時(shí)程；以及為了分析而制備的化合物文庫(kù)；等等。目標(biāo)樣品包括評(píng)價(jià)其潛在治療價(jià)值的化合物，例如來(lái)自植物或真菌細(xì)胞的候選藥物。
術(shù)語(yǔ)“樣品”也包括已添加額外成分(例如，影響離子強(qiáng)度、pH或總蛋白質(zhì)濃度的成分)的上述流體。另外，也可以處理樣品，以實(shí)現(xiàn)至少部分分離或濃縮。如果必須減少化合物的降解，則可以貯存生物樣品，例如貯存在氮?dú)庀?、冷凍或它們的組合。使用的樣品的體積足以允許可檢測(cè)到，通常約0.1μl至1ml生物樣品就足夠了。
化合物和候選試劑從多種來(lái)源獲得，包括合成或天然化合物文庫(kù)。例如，可以利用大量手段隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物和生物分子，包括隨機(jī)化寡核苷酸和寡肽的表達(dá)。此外，細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物文庫(kù)可以獲得或者易于產(chǎn)生。另外，天然或合成產(chǎn)生的文庫(kù)和化合物易于通過(guò)常規(guī)化學(xué)、物理和生物化學(xué)手段修飾，并且可以用來(lái)產(chǎn)生組合文庫(kù)。已知藥劑可以經(jīng)歷定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，如?；?、烷基化、酯化、酰胺化，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。
輸出變量輸出變量是細(xì)胞的可定量部分(element)，特別是可以在高通量系統(tǒng)中精確測(cè)定的部分。輸出可以是任何細(xì)胞成分或細(xì)胞產(chǎn)物，包括，例如，存活力、呼吸、代謝、細(xì)胞表面決定簇、受體、蛋白質(zhì)或其構(gòu)象或翻譯后修飾、脂質(zhì)、碳水化合物、有機(jī)或無(wú)機(jī)分子、mRNA、DNA或來(lái)源于這種細(xì)胞成分的一部分。盡管大多數(shù)輸出提供定量讀數(shù)，但是在一些情況下，獲得半定量或定性結(jié)果。讀數(shù)可以包括測(cè)定的單個(gè)值，或者可以包括平均值、中值或方差。典型地，每個(gè)輸出將獲得一定的讀數(shù)值范圍。使用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法預(yù)測(cè)可變性，并且可以確定一組受檢輸出的數(shù)值范圍。
可以利用多種方法定量所選標(biāo)記的存在。為了測(cè)定存在的分子的量，一種常規(guī)方法是用可檢測(cè)部分標(biāo)記該分子，該可檢測(cè)部分可以具有熒光、發(fā)光、放射性或酶活性。熒光和發(fā)光部分易于標(biāo)記實(shí)際上任何生物分子、結(jié)構(gòu)或細(xì)胞型，免疫熒光部分不僅可以被引導(dǎo)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，而且可以結(jié)合特定構(gòu)象、切割產(chǎn)物或位點(diǎn)修飾，如磷酸化。各個(gè)肽和蛋白質(zhì)可以改造為自發(fā)熒光(autofluoresce)，例如通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)為綠色熒光蛋白嵌合體(關(guān)于綜述，參見(jiàn)Jones等人.(1999)Trends Biotechnol.17(12)477-81)。
輸出變量可以利用免疫測(cè)定技術(shù)測(cè)定，例如免疫組化、放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和相關(guān)的非酶技術(shù)。這些技術(shù)利用特異性抗體作為報(bào)道分子，由于這些抗體具有附著于單個(gè)分子靶標(biāo)的高度特異性，因此是特別有用的?；诩?xì)胞的ELISA或有關(guān)的非酶或基于熒光的方法使得細(xì)胞表面參數(shù)的測(cè)定成為可能。這些試驗(yàn)的讀數(shù)可以是與單個(gè)熒光抗體-檢測(cè)的細(xì)胞表面分子或細(xì)胞因子有關(guān)的熒光平均值，或平均熒光強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度中值、熒光強(qiáng)度方差、或它們之間的一定的關(guān)系。
數(shù)據(jù)分析篩選試驗(yàn)的結(jié)果可以與從參照化合物、濃度曲線(xiàn)、對(duì)照等獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果的比較利用適當(dāng)?shù)难堇[法、A1系統(tǒng)、統(tǒng)計(jì)學(xué)比較等實(shí)現(xiàn)。
可以匯編參照輸出數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)。這些數(shù)據(jù)庫(kù)可以包括來(lái)自已知試劑或試劑組合的結(jié)果，以及分析在環(huán)境條件下處理的細(xì)胞得到的參照，在該環(huán)境條件中除去或具體改變了一個(gè)或多個(gè)環(huán)境條件或參數(shù)?？梢援a(chǎn)生數(shù)據(jù)矩陣，其中數(shù)據(jù)矩陣的每一個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于來(lái)自輸出變量的讀數(shù)，其中每個(gè)輸出的數(shù)據(jù)可以來(lái)自重復(fù)測(cè)定，例如同一類(lèi)型的多個(gè)個(gè)體細(xì)胞。
讀數(shù)可以是平均值、中值或方差或其他通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)或數(shù)學(xué)方法得到的與測(cè)量有關(guān)的數(shù)值。輸出讀數(shù)信息可以通過(guò)與相應(yīng)的參照讀數(shù)直接比較而進(jìn)一步優(yōu)化。在相同條件下獲得的每一輸出的絕對(duì)值將顯示在活生物系統(tǒng)中固有的變異性，并且也反映了個(gè)體細(xì)胞變異性，以及個(gè)體之間固有的變異性。
細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)裝置 本發(fā)明的培養(yǎng)裝置包括通道的微流網(wǎng)絡(luò)，這些通道分隔為一個(gè)或多個(gè)不連續(xù)的但是互相連接的腔室，優(yōu)選地集成為芯片格式。設(shè)計(jì)特定的腔室?guī)缀涡螤?，以提供與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)細(xì)胞、組織或器官系統(tǒng)的參數(shù)有關(guān)的細(xì)胞相互作用、液流和液體停留參數(shù)。
可以通過(guò)重復(fù)檢測(cè)響應(yīng)液流和尺寸變化的參數(shù)值的程序，直到獲得選擇的值，來(lái)開(kāi)發(fā)優(yōu)化的腔室?guī)缀涡螤睢；椎膬?yōu)化包括選擇腔室數(shù)、選擇提供適當(dāng)細(xì)胞∶體積比的腔室?guī)缀涡螤?、選擇提供適當(dāng)組織或器官比的腔室大小、選擇提供正確液體停留時(shí)間的最佳流體流速，然后基于這些值計(jì)算細(xì)胞剪應(yīng)力。如果細(xì)胞剪應(yīng)力高于最大允許值，則選擇新的參數(shù)值，并重復(fù)該過(guò)程。CCA裝置的另一實(shí)施方案包括在空心管內(nèi)而不是在通道或腔室的底部和側(cè)面上生長(zhǎng)細(xì)胞。已經(jīng)證明在這種三維組織構(gòu)建體中生長(zhǎng)的細(xì)胞比某些體內(nèi)組織更真實(shí)(Griffith(1998)PhARMA Biol.Biotech.Conf.，Coronado，Calif.，March15-18)。
在產(chǎn)生三維培養(yǎng)裝置時(shí)考慮三個(gè)主要的設(shè)計(jì)參數(shù)。第一個(gè)是流體與特定組織接觸或在孔內(nèi)的停留時(shí)間。停留時(shí)間選擇為反映血液保持與器官組織接觸的時(shí)間長(zhǎng)度，該器官組織由循環(huán)系統(tǒng)的一個(gè)通路中的孔代表。第二個(gè)是細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的管的半徑。例如，用于復(fù)制肝的管的半徑在200-400μm范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)注意到如果管的半徑太大，則細(xì)胞實(shí)際上將會(huì)遇到平面，并且將在管上形成單層。
第三個(gè)參數(shù)是到達(dá)每一模塊的流動(dòng)的比例。調(diào)節(jié)流動(dòng)通道的幾何形狀可將來(lái)自腔室的流動(dòng)分配。通往每個(gè)模塊或腔室的通道或管一般具有不同的長(zhǎng)度，以平衡壓降并且平衡流動(dòng)。在流體離開(kāi)其他組織后，它可以被泵再循環(huán)。通過(guò)管的流速根據(jù)管的尺寸和停留時(shí)間計(jì)算。得出流速后，計(jì)算對(duì)細(xì)胞的剪應(yīng)力，以確保該值不大于細(xì)胞應(yīng)力的限度。肺組織中需要的極短的停留時(shí)間使得不可能對(duì)該器官使用孔和管的方法。剪應(yīng)力太高，因此肺組織部分保持流過(guò)(flow-over)肺組織單層。
由于本發(fā)明的系統(tǒng)是交互的(即計(jì)算機(jī)不僅感知而且控制試驗(yàn)的條件)，因此可以對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)校正，并且適當(dāng)?shù)赜^(guān)察并記錄，向研究人員報(bào)告所進(jìn)行的檢測(cè)的動(dòng)力學(xué)。
計(jì)算機(jī)收集的數(shù)據(jù)由連續(xù)聯(lián)機(jī)監(jiān)測(cè)從每個(gè)區(qū)室流出的受試化學(xué)物質(zhì)所需的數(shù)據(jù)集合組成。傳感器，優(yōu)選流通型傳感器，與從每個(gè)區(qū)室的流出物對(duì)齊布置，由此檢測(cè)、分析和提供關(guān)于從每個(gè)區(qū)室流出的受試化學(xué)物質(zhì)的定量數(shù)據(jù)。
微處理器也可以用來(lái)計(jì)算特定受試化學(xué)試劑的基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(PBPK)模型。這些計(jì)算可以作為設(shè)置區(qū)室之間的流速和受試化學(xué)試劑從系統(tǒng)中排出的速度的基礎(chǔ)。然而，它們也可以作為受試化學(xué)試劑的理論估計(jì)值。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，可以將通過(guò)PBPK測(cè)定進(jìn)行的關(guān)于受試化學(xué)試劑和代謝物濃度的預(yù)測(cè)與傳感器數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。硬拷貝輸出將PBPK模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。
已經(jīng)構(gòu)建并檢驗(yàn)了幾種原型CCA系統(tǒng)。圖17A示出了“第一代”三區(qū)室裝置。其尺寸如下晶片為2cm×2cm；肺腔室具有20個(gè)通道(5mm長(zhǎng))40μm×20μm(w×d)；肝腔室具有2個(gè)通道(100mm長(zhǎng))100μm×20μm(w×d)。使用該裝置的第一步是使用注射泵注射流體，直到充滿(mǎn)所有通道。第二步，利用蠕動(dòng)泵再循環(huán)該流體。圖17B示出該裝置的橫截面視圖，證明了該系統(tǒng)的流體學(xué)。發(fā)現(xiàn)400μm厚的彈性體獲得良好的密封，有機(jī)玻璃(plexiglass)和凝膠加樣吸嘴比其他材料脆性更低。該裝置存在高壓降和在90°彎曲時(shí)發(fā)生滲漏的問(wèn)題。
使用這種“第一代”裝置進(jìn)行細(xì)胞附著研究。L2細(xì)胞置于肺腔室中，H4IIE細(xì)胞置于肝腔室中。聚-D-賴(lài)氨酸吸附到腔室表面上以促進(jìn)細(xì)胞在通道內(nèi)的附著。遺憾的是，細(xì)胞附著在溝槽的外部，因此檢測(cè)了不同的基板，并修飾了表面。
圖18A顯示“第二代”裝置。其尺寸如下芯片為2cm×2cm；蝕刻深20μm；肺腔室為2mm×2mm(w×l)；肝腔室為7.5mm×10mm(w×l)。肺腔室含有5μm高的嵴來(lái)提高細(xì)胞附著(圖18B)，肝腔室含有20μm高的柱來(lái)模擬滲透(圖18C)。
圖19顯示了“第三代”裝置。其尺寸如下芯片為2cm×2cm；肺腔室為2mm×2mm(w×l)；肝腔室為3.7mm×3.8mm(w×l)；“其他組織”腔室為7mm×7mm(w×l)。流體從肺腔室分流，20％流往肝，80％流往其他組織腔室。為了減少壓降，腔室的某些部分(虛線(xiàn))深100μm，其余部分(實(shí)線(xiàn))深20μm，以獲得現(xiàn)實(shí)的液體∶細(xì)胞比。
圖20是五區(qū)室PBPK模型CCA的流程圖。該裝置增加了脂肪細(xì)胞的腔室、緩慢灌注的流體和快速灌注的流體的腔室。這種裝置可以用于生物累積研究、細(xì)胞毒性研究和代謝活性研究?？梢蚤_(kāi)發(fā)其他具有各種排列的裝置。例如，可以增加具有氣體交換的隔膜泵，或聯(lián)機(jī)生物傳感器，或微型機(jī)電(MEM)泵，或生物傳感器和電子界面?？梢蚤_(kāi)發(fā)一種裝置來(lái)模擬藥物的經(jīng)口給藥。此外，也可以開(kāi)發(fā)一種裝置來(lái)模擬血腦屏障。 制造 細(xì)胞培養(yǎng)裝置一般包括單獨(dú)元件例如腔室、通道、入口或出口的集合體，當(dāng)它們適當(dāng)配合或連接在一起時(shí)，形成本發(fā)明的培養(yǎng)裝置。優(yōu)選地，以集成的、“基于芯片”的格式提供這些元件。
根據(jù)裝置的尺寸適當(dāng)?shù)卮_定裝置的流體學(xué)的規(guī)模。在基于芯片的格式中，流體連接是“微流體的”，這種系統(tǒng)含有流體元件，如至少一個(gè)內(nèi)部橫截面尺寸例如深度或?qū)挾却蠹s為0.1μm至500μm的通道、腔室或?qū)Ч?。在本發(fā)明的裝置中，腔室之間的通道一般包括至少一個(gè)微型通道。
微流裝置一般包括頂部、底部和內(nèi)部，其中內(nèi)部實(shí)際限定了該裝置的通道和腔室。在優(yōu)選的方面，底部包括在結(jié)構(gòu)上基本為平面的固體基底，其具有至少一個(gè)基本上扁平的上表面?？梢允褂枚喾N基底材料作為底部。一般地，由于該裝置是微制造的，通?；谒鼈兣c已知微制造技術(shù)的相容性來(lái)選擇基底材料，這些微制造技術(shù)例如是光刻法、薄膜沉積法、濕式化學(xué)蝕刻法、活性離子蝕刻法、感應(yīng)耦合等離子體深硅蝕刻法、激光消融、空氣磨損技術(shù)、注射成型、壓印法(embossing)和其他技術(shù)。
本發(fā)明的基底材料包括聚合材料，例如塑料，如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(TEFLONTM)、聚氯乙烯(PVC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚砜等。這些基板使用眾所周知的模制技術(shù)如注射成型、壓印法或沖壓法，或者通過(guò)將聚合前體材料在模具內(nèi)聚合，由微制造母版容易地制造。這些聚合基底材料是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈円子谥圃臁⒊杀镜筒⑶沂且淮涡缘?，并且?duì)大多數(shù)極端的反應(yīng)條件通常是惰性的。這些聚合材料可以包括經(jīng)過(guò)處理的表面，例如衍生化的或涂覆的表面，以提高它們?cè)谙到y(tǒng)中的應(yīng)用，例如提供增強(qiáng)的流體方向、細(xì)胞附著或細(xì)胞分隔。
一般利用上述微制造技術(shù)在基底的上表面或底部?jī)?nèi)制造微流裝置的通道和/或腔室，作為微型凹槽或凹痕。然后將微流裝置的頂部(該頂部一般包括第二平面基底)的下表面覆蓋并且粘接在基底的表面上，在這兩個(gè)部件的界面處密封該裝置的通道和/或腔室(內(nèi)部)。頂部與底部的粘接可以根據(jù)基底材料的性質(zhì)采用多種已知的方法進(jìn)行。例如，在玻璃基底的情況中，可以采用熱粘合技術(shù)，該技術(shù)利用升高的溫度和壓力將裝置的頂部與底部粘接。聚合基底可以采用類(lèi)似的技術(shù)粘接，不同之處是使用的溫度通常較低，以防止基底材料過(guò)度熔化。也可以使用替代方法將該裝置的聚合部分粘接在一起，包括聲音焊接技術(shù)，或者使用粘合劑，例如紫外線(xiàn)可固化的粘合劑，等等。
該裝置通常包括泵，如低流速蠕動(dòng)泵。小口徑軟管連接到該裝置的出口上，通過(guò)蠕動(dòng)泵，并且連接到該裝置的入口上，這樣形成閉環(huán)系統(tǒng)。泵通常以1μL/min數(shù)量級(jí)的流速運(yùn)轉(zhuǎn)。泵系統(tǒng)可以是任何流體泵裝置，如隔膜，并且可以如上所述集成到CCA裝置(基于芯片的系統(tǒng))或單獨(dú)的部件上。
該裝置可以連接到處理器上或者與處理器界面連接，該處理器存儲(chǔ)和/或分析來(lái)自每一個(gè)生物傳感器的信號(hào)。該處理器隨后又將數(shù)據(jù)傳送給計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器(硬盤(pán)或RAM)，軟件程序可以使用來(lái)自該存儲(chǔ)器的數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析、打印和/或顯示結(jié)果。
示例性實(shí)施方案的描述 在下面對(duì)具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述中，參照附圖，這些附圖構(gòu)成其一部分，其中舉例說(shuō)明了可以實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明范圍的情況下，可以應(yīng)用其他實(shí)施方案，并且可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)改變。
圖1是根據(jù)本發(fā)明的體外系統(tǒng)的框圖。模擬肺細(xì)胞的腔室102接受來(lái)自氣體交換裝置103的充氧培養(yǎng)基。這些充氧培養(yǎng)基是通過(guò)將培養(yǎng)基接觸含氧氣體以使培養(yǎng)基吸收含氧氣體并且解吸含二氧化碳?xì)怏w而獲得的。離開(kāi)模擬肺細(xì)胞的腔室102的培養(yǎng)基類(lèi)似于哺乳動(dòng)物中的動(dòng)脈血106。然后向模擬肝臟的腔室108、模擬其他組織的腔室110、模擬脂肪的腔室112和模擬腎臟的腔室114供應(yīng)組成動(dòng)脈血106的含氧培養(yǎng)基。離開(kāi)模擬肝臟的腔室108、模擬其他組織的腔室110、模擬脂肪的腔室112和模擬腎臟的腔室114的培養(yǎng)基類(lèi)似于哺乳動(dòng)物中的靜脈血104。如圖1所示，對(duì)應(yīng)于靜脈血104的培養(yǎng)基返回模擬肺細(xì)胞的腔室102中。本發(fā)明的系統(tǒng)也包括模擬腸的腔室116和模擬腹腔的腔室118，這兩個(gè)腔室構(gòu)成導(dǎo)入受試化合物的部位。在哺乳動(dòng)物中，廢液115從模擬腎臟的腔室114中排出。
圖2是本發(fā)明的系統(tǒng)200的一個(gè)實(shí)施方案的簡(jiǎn)化示意圖。系統(tǒng)200包括肺細(xì)胞培養(yǎng)腔室210、肝細(xì)胞培養(yǎng)腔室212、脂肪細(xì)胞培養(yǎng)腔室213、其他組織腔室214和氣體交換腔室250。腔室210、212、213、214和250在硅基板上形成，通常被稱(chēng)為芯片230。應(yīng)當(dāng)指出，在單個(gè)芯片230上可以容納或形成4個(gè)以上的細(xì)胞培養(yǎng)腔室。流體路徑240連接腔室210、212、213、214和250。
該腔室具有入口211和出口215。入口211位于氣體交換腔室250的一端。出口215位于肝細(xì)胞培養(yǎng)腔室212的一端。腔室210、212、213、214和250和流體路徑240基本上位于入口211和出口215之間。該系統(tǒng)包括用于在系統(tǒng)200中循環(huán)流體的泵260。微管270連接出口215和泵260的入口側(cè)。微管271將泵260的出口側(cè)連接到入口211上。細(xì)胞培養(yǎng)腔室210、212、213、214、氣體交換腔室250、流體路徑240和泵260形成系統(tǒng)200。該系統(tǒng)可以包括另外的細(xì)胞培養(yǎng)腔室。增加的一個(gè)常見(jiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)腔室是模擬腎的腔室。
圖3是本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。在圖3中，在芯片230上設(shè)置第一信號(hào)路徑310、第二信號(hào)路徑320和第三信號(hào)路徑330?？梢栽谛酒?30上的特定位置處從芯片230采集用于監(jiān)測(cè)每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)200的各個(gè)方面的信號(hào)，并且轉(zhuǎn)移到芯片230的輸出。一個(gè)例子，芯片230上的信號(hào)路徑310、320、330是集成的埋入的波導(dǎo)。在這種實(shí)施方案中，芯片230可以由硅、玻璃或聚合物制成。波導(dǎo)310、320、330將光線(xiàn)引導(dǎo)到芯片的邊緣，轉(zhuǎn)換器312、322、332位于該芯片的邊緣上，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。于是可以監(jiān)測(cè)系統(tǒng)200內(nèi)的細(xì)胞的熒光、發(fā)光或吸收或所有這些性質(zhì)，以探詢(xún)和監(jiān)測(cè)系統(tǒng)200內(nèi)的細(xì)胞。檢查熒光需要光源。光源用來(lái)探詢(xún)分子，而信號(hào)載體如波導(dǎo)310、320、330或纖維光學(xué)裝置捕獲信號(hào)并將其送出芯片230。信號(hào)載體310、320、330將光線(xiàn)引導(dǎo)至靠近芯片310、320、330的信號(hào)攜帶部分末端的光電探測(cè)器。
圖4是本發(fā)明的系統(tǒng)200的另一實(shí)施方案的示意圖。在該實(shí)施方案中，生物傳感器410、420、430、440、450和460設(shè)置在芯片上位于芯片230的每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔室的上游和下游。生物傳感器410、420、430、440、450、460監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的氧、二氧化碳和/或pH。這些傳感器允許監(jiān)測(cè)系統(tǒng)200并在需要時(shí)調(diào)節(jié)氣體水平，以保持健康的環(huán)境。另外，如果恰好位于每個(gè)細(xì)胞區(qū)室的上游和下游，生物傳感器提供關(guān)于細(xì)胞代謝和存活力的有用信息。
圖5A至5G顯示用來(lái)制造基于聚合物的一次性芯片230的步驟。硅片20旋轉(zhuǎn)涂覆一薄層光刻膠21(圖5A)。光刻膠21通過(guò)含有所需特征的光掩膜23暴露于紫外線(xiàn)22(圖5B)。暴露于紫外線(xiàn)的光刻膠21在適當(dāng)?shù)娜軇┲邢吹簦纱吮┞冻龉?0(圖5C)。使用感應(yīng)耦合等離子體蝕刻系統(tǒng)將硅20蝕刻為所需的深度(圖5D)。剩余的光刻膠用適當(dāng)?shù)娜軇┏?圖5E)。極薄的金(或Ti)鍍基底24沉積在硅基板20上，產(chǎn)生用于電鍍處理的模板，如圖5E所示。將樣品浸沒(méi)到氨基磺酸鎳型電鍍槽中，將鎳25電鍍到硅模板20上，直到鎳的厚度足夠，金作為導(dǎo)電層。鎳母版脫離金層，金成為鎳母版的一部分。這形成了Ni部件25，如圖5F所示。電鍍速度是電鍍電流、模板直徑和模板厚度的函數(shù)，校正為大約45nm/min。制造后，用顯微鏡檢查部件25，以證實(shí)該部件的尺寸。得到的鎳部件25必須是均勻的，并且具有所需的形狀。將鎳母版25和聚合物基板26加熱到正好高于該聚合物的玻璃轉(zhuǎn)化溫度。鎳母版25和聚合物26接觸，并且將鎳母版25的特征壓印到聚合物基板26內(nèi)。除去鎳母版25，由此產(chǎn)生含有原始硅片20的相同特征的聚合物26(圖5G)。
圖6是本發(fā)明的系統(tǒng)200的第三實(shí)施方案的示意圖。在該實(shí)施方案中，生物傳感器600、602、604位于芯片230的周?chē)Ｉ飩鞲衅?00、602、604用來(lái)進(jìn)一步監(jiān)測(cè)在芯片230上產(chǎn)生的系統(tǒng)200的細(xì)胞的狀態(tài)。有利地，通過(guò)將生物傳感器600、602、604定位在芯片230的周?chē)?，芯?30可以成為一次性的，具有最低的成本，換句話(huà)說(shuō)，生物傳感器600、602、604將不會(huì)與芯片230一起丟棄。應(yīng)當(dāng)指出，生物傳感器600、602、604也可以設(shè)置在一次性芯片230上。這一特定選擇不具有成本效益，因?yàn)樘幚硇酒?30也導(dǎo)致丟棄生物傳感器600、602、604。當(dāng)生物傳感器600、602、604位于芯片230以外時(shí)更具有成本效益，因?yàn)樯飩鞲衅?00、602、604可以再次使用而不是每次使用后處理掉。每個(gè)生物傳感器600、602、604與計(jì)算機(jī)620的輸入連接。
圖7是進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明計(jì)算機(jī)620的圖示。計(jì)算機(jī)620監(jiān)測(cè)并調(diào)節(jié)每個(gè)芯片230的系統(tǒng)200的運(yùn)轉(zhuǎn)。計(jì)算機(jī)620包括設(shè)有輸入/輸出界面700和內(nèi)部寄存器/高速緩沖存儲(chǔ)器702的微處理器。如圖所示，微處理器798通過(guò)連接器716與鍵盤(pán)704界面連接，通過(guò)連接器718與非易失性存儲(chǔ)器706、通用存儲(chǔ)器708和查閱表710界面連接，并且通過(guò)連接器720與打印機(jī)/繪圖儀記錄器和顯示器714界面連接。
非易失性存儲(chǔ)器706可以為CD可寫(xiě)入存儲(chǔ)器、磁帶存儲(chǔ)器、磁盤(pán)驅(qū)動(dòng)器等形式。查閱表710可以在物理上包含通用存儲(chǔ)器708的一部分，該部分留出用于存儲(chǔ)適合在系統(tǒng)中模擬的各種物質(zhì)的一組質(zhì)量平衡方程。這些方程代表系統(tǒng)中用于各種生物/化學(xué)物質(zhì)的基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)模型。內(nèi)部寄存器/高速緩沖存儲(chǔ)器702和通用存儲(chǔ)器708含有為多個(gè)程序指令和特定數(shù)據(jù)形式的系統(tǒng)程序，用于自動(dòng)控制每個(gè)芯片230的系統(tǒng)200中的實(shí)際上每個(gè)功能。該計(jì)算機(jī)也可以控制并調(diào)節(jié)與系統(tǒng)200連接的泵260。
也可以提供流體流動(dòng)作為從流量計(jì)通過(guò)輸入/輸出界面700到微處理器798的輸入。這允許通過(guò)調(diào)節(jié)程序命令精確控制系統(tǒng)內(nèi)的流體流速，該程序命令分別通過(guò)泵控制線(xiàn)傳送給泵260。例如，流速在導(dǎo)管58中可以設(shè)置為9.5μL/min，通過(guò)流量計(jì)66為2.5μL/min，通過(guò)流量計(jì)78為7μL/mm，在導(dǎo)管70中為2.5μL/mm。容器50中的培養(yǎng)基的溫度也可以用微處理器798調(diào)節(jié)，微處理器798通過(guò)輸入/輸出界面700和溫度指示器線(xiàn)728接收來(lái)自溫度探針792的溫度測(cè)量值。響應(yīng)于這些信號(hào)，微處理器798通過(guò)輸入/輸出界面700和加熱線(xiàn)圈控制線(xiàn)730打開(kāi)及關(guān)閉加熱線(xiàn)圈790。
細(xì)胞培養(yǎng)腔室210和212中的生物和毒理學(xué)反應(yīng)/變化分別用傳感器600、602和604檢測(cè)，并且通過(guò)控制線(xiàn)以及輸入/輸出界面700傳送至微處理器798。傳感器可以設(shè)計(jì)為顯示特定波長(zhǎng)值或范圍方面的試驗(yàn)結(jié)果。
微處理器798也非常容易適合包括程序，以使研究人員可通過(guò)鍵盤(pán)704交互控制。這允許，例如，引導(dǎo)計(jì)算機(jī)在任何給定時(shí)間具體檢查任何培養(yǎng)區(qū)室的條件。
本發(fā)明提供的另一個(gè)選擇是通過(guò)從CD/磁帶存儲(chǔ)器706中調(diào)出信息來(lái)調(diào)出以前存儲(chǔ)的類(lèi)似實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果的能力。因此，存儲(chǔ)器706可以編程以保存從公開(kāi)的信息獲得的歷史數(shù)據(jù)、從以前用本發(fā)明系統(tǒng)進(jìn)行的試驗(yàn)中收集的數(shù)據(jù)，或理論計(jì)算得出的數(shù)據(jù)。提供CD/磁帶存儲(chǔ)器也允許使用該系統(tǒng)作為信息研究工具。例如，基于通過(guò)鍵盤(pán)704輸入到微處理器798內(nèi)的選擇信息，可以獲得關(guān)于特定受試化學(xué)試劑或特定培養(yǎng)線(xiàn)的研究數(shù)據(jù)。通過(guò)在存儲(chǔ)器706中包含或開(kāi)發(fā)大的信息庫(kù)，研究人員能夠更合理地配置并且計(jì)劃試驗(yàn)。
圖8是顯示可以容納在一個(gè)外殼800內(nèi)的一個(gè)以上芯片230的圖示。外殼800可以是環(huán)境腔室，對(duì)于外殼內(nèi)的每個(gè)芯片230保持相同的條件。外殼800包括多個(gè)芯片位置810、812、814、816。從每個(gè)芯片230或芯片位置810、812、814、816的輸出是向計(jì)算機(jī)620的輸入。計(jì)算機(jī)620于是能通過(guò)多個(gè)芯片230實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)200。
圖9是顯示檢驗(yàn)可包括位于不同外殼800、900中的芯片230組的示意圖。對(duì)于環(huán)境的變化，例如當(dāng)溫度略微升高時(shí)等等，可以監(jiān)測(cè)每個(gè)芯片230的輸出。進(jìn)一步預(yù)期一個(gè)外殼中的每個(gè)芯片可以在其上具有相同的細(xì)胞培養(yǎng)物，或者外殼800中的芯片230可能具有彼此互相連接的芯片，以在外殼內(nèi)形成哺乳動(dòng)物的不同部分或相互依賴(lài)的器官。
圖2-4和6-9所示的芯片230使用兩維的細(xì)胞培養(yǎng)腔室210、212、213、214。由于三維組織培養(yǎng)結(jié)構(gòu)可能在它們的代謝中更可靠，另一種芯片1000包括三維結(jié)構(gòu)。下面描述了微型結(jié)構(gòu)培養(yǎng)模擬裝置(″CCA″)的產(chǎn)生，該裝置中以模塊形式引入了三維組織。CCA裝置或芯片1000引入了用于肺細(xì)胞腔室的流過(guò)(flow over)途徑和用于其他器官的流通(flow-through)途徑。下面進(jìn)一步描述了向CCA設(shè)計(jì)的流通途徑。
圖10顯示了芯片1000的示意性的流動(dòng)方式。芯片1000包括四個(gè)孔或組織模塊。芯片1000包括肺孔1010、肝孔1020、脂肪孔1030和慢灌注孔1040和快灌注孔1050。利用管使流體通過(guò)芯片1000循環(huán)。泵1060使流體通過(guò)管流動(dòng)。肺孔1010最先接收所有流動(dòng)。在肺1010之后，流體將分配到四個(gè)組織模塊中。肝模塊獲得25％的流動(dòng)，脂肪模塊為9％，慢灌注模塊為15％，快灌注模塊部分為51％。調(diào)節(jié)流動(dòng)通道的幾何學(xué)可以分配來(lái)自肺孔1010的流動(dòng)。通向每個(gè)模塊的通道將具有不同的長(zhǎng)度，以平衡壓降并平衡流動(dòng)。在流體離開(kāi)其他組織后，它通過(guò)泵1060再循環(huán)回肺區(qū)室中。每個(gè)孔或組織模塊1020、1030、1040、1050容納組織。該組織容納在孔1020、1030、1040、1050內(nèi)的微型管1022、1032、1042、1052中。如圖10所示，每個(gè)孔1020、1030、1040、1050只有一個(gè)微型管1022、1032、1042、1052。應(yīng)當(dāng)注意，在一個(gè)孔中可以放置多個(gè)微管。
在操作中，有兩種方法可以將三維組織引入CCA裝置或芯片1000中。這兩種方法都涉及接種后的培養(yǎng)基通過(guò)聚苯乙烯或玻璃微型管流動(dòng)。檢測(cè)的細(xì)胞附著到管的內(nèi)部，并且聚集為三維組織。收集所述管，捆扎起來(lái)，并且置于芯片1000的孔中。每個(gè)孔成為器官模塊，藥物水溶液將流過(guò)該模塊以接觸組織。
允許引入三維組織的第一種方法涉及流通反應(yīng)器策略。在硅片上形成開(kāi)口，形成通道，然后使培養(yǎng)基通過(guò)該開(kāi)口。位于開(kāi)口內(nèi)表面上的硅為細(xì)胞提供支架，細(xì)胞聚集為三維組織。為了將該技術(shù)應(yīng)用于聚合物CCA 1000，可以用粘附蛋白質(zhì)處理聚合物管，或者可以在添加血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。血清和粘附蛋白質(zhì)都允許細(xì)胞附著到管的內(nèi)表面上。
第二種方法涉及在HARV微重力反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)將管搭建在旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器的中心，或者通過(guò)將自由漂浮的管引入培養(yǎng)基中，細(xì)胞在一些管中形成三維聚集物。由于在微重力中生長(zhǎng)的細(xì)胞的活性提高，這些組織與二維組織或以上述方法形成的組織相比具有優(yōu)良的功能。在其內(nèi)部具有組織的管可以根據(jù)重量或密度分開(kāi)，并且置于該裝置上。
圖11是并入芯片1000的細(xì)胞培養(yǎng)模擬裝置1100的局部分解等距視圖。芯片1000包括肺細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)1010和與肺細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)1010連接的多個(gè)孔。這些孔包括肝組織孔1020、脂肪組織孔1030、慢灌注孔1040和快灌注孔1050。含有各種組織的微型管適配在孔1020、1030、1040和1050中。每個(gè)孔包括通向與芯片1000連接的彈性體底部1110的輸出。彈性體1110是泵的一部分。致動(dòng)器1120抵壓彈性體，產(chǎn)生泵作用，以移動(dòng)系統(tǒng)1100的流體，或使系統(tǒng)1100的流體通過(guò)返回線(xiàn)路1130從該孔循環(huán)回肺組織模塊1010。玻璃層置于芯片頂部，覆蓋肺組織模塊1010和各個(gè)孔1020、1030、1040和1050。應(yīng)當(dāng)注意，通道1021、1031、1041和1051的尺寸為通過(guò)各孔1020、1030、1040和1050產(chǎn)生一定的流速。并非調(diào)節(jié)各通道1021、1031、1041、1051的長(zhǎng)度和寬度，預(yù)期可以沿通道設(shè)置其他流動(dòng)限流器，從而為各孔1020、1030、1040和1050提供流速的變化性。玻璃頂1140可以用彎曲和伸展的膜代替，并且可以添加柱塞球型閥，以使通道1021、1031、1041和1051中的流動(dòng)可以通過(guò)通道尺寸以外的手段調(diào)節(jié)。
芯片1100可以由硅制成，但是更加節(jié)省成本的是用聚苯乙烯或其他一些合適的塑料制造芯片1000。首先通過(guò)常規(guī)手段用硅制成每個(gè)芯片。然后由硅制成鎳母版。換句話(huà)說(shuō)，通過(guò)在硅和鎳母版上復(fù)制模塑聚苯乙烯和硅氧烷彈性體制造芯片1000。當(dāng)然，制造聚合物芯片的第一步是在硅片上產(chǎn)生芯片。開(kāi)始時(shí)，光刻膠1210層置于硅片1200上。掩膜置于光刻膠1210上。掩膜含有肺組織培養(yǎng)區(qū)1010的圖案。掩膜允許紫外線(xiàn)通過(guò)到達(dá)光刻膠，恰好暴露對(duì)應(yīng)于肺區(qū)1010的部分。然后曝光光刻膠，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于肺組織培養(yǎng)區(qū)1010的開(kāi)口1211。然后蝕刻具有光刻膠的硅片，在硅片1200內(nèi)產(chǎn)生肺開(kāi)口1010。然后從硅片1200上除去光刻膠1210，得到具有肺孔1010的硅片。然后向晶片1200上設(shè)置另一層光刻膠1220。將掩膜設(shè)置在晶片上。該掩膜允許暴露各孔或用于連接肺孔1010與各孔1020、1030、1040和1050的流體通道，包括1021、1031、1041和1051。該掩膜暴露流體通道區(qū)域中的光刻膠。然后曝光光刻膠，除去對(duì)應(yīng)于流體流動(dòng)通道的暴露的光刻膠。然后將暴露的區(qū)域蝕刻為所需的深度。之后，除去剩余的光刻膠1220，得到具有肺孔1010和其他孔1020、1030、1040和1050的硅片1200。下一步是涂布第三層光刻膠1230。將掩膜置于光刻膠上，該掩膜具有對(duì)應(yīng)于各孔1020、1030、1040和1050的開(kāi)口。掩蔽光刻膠，并且暴露于紫外線(xiàn)，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于各孔的開(kāi)口。曝光光刻膠，得到孔1020、1030、1040和1050的暴露的硅區(qū)。然后蝕刻芯片和光刻膠1230，產(chǎn)生孔1020、1030、1040和1050。用等離子體將對(duì)應(yīng)于組織模塊1020、1030、1040、1050的開(kāi)口蝕刻為大約750微米的深度。然后用KOH再將所述開(kāi)口濕法蝕刻250微米，形成逐漸變細(xì)的端部。KOH將沿著晶面以54.7度的角度蝕刻硅。然后除去光刻膠，形成硅片，可以由該硅片制成鎳母版。
將鎳電鍍到硅芯片上，產(chǎn)生鎳母版1250。然后利用鎳母版鑄塑或壓印聚合物基板1000。對(duì)于復(fù)制模塑法，將聚合物熔化或者溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，并傾注到鎳母版1250上，固化為與用于壓印的初始硅芯片相同的形狀。關(guān)于壓印法，參見(jiàn)圖5。然后將聚合物芯片1000設(shè)置在硅彈性體溝槽1110上。聚合物和硅自封裝，使得這些層形成單一單元。氣動(dòng)致動(dòng)器1120設(shè)置在芯片之下，泵送從各個(gè)組織模塊1020、1030、1040、1050匯集的流體。溝槽每秒將填充0.032微升的流體。致動(dòng)器然后向硅上推動(dòng)，使流體通過(guò)微管流回肺區(qū)室1010。彈性體溝槽1110和致動(dòng)器1120形成泵260(圖12所示)。然后將涂覆彈性體的聚甲基丙烯酸甲酯(PLEXIGLASTM)1140密封到晶體或芯片1000的頂部。
為了平衡當(dāng)硅氧烷填滿(mǎn)液體時(shí)產(chǎn)生的壓力，除去肺細(xì)胞區(qū)室1010上的聚甲基丙烯酸甲酯(PLEXIGLASTM)，并且將其替換為硅氧烷膜。該膜隨著硅氧烷泵的作用而升降，并保持該裝置中的壓力平衡。將各個(gè)微型管置于孔中，之后將涂覆彈性體的聚甲基丙烯酸甲酯(PLEXIGLASTM)置于芯片1000上。處理微管的機(jī)器包括降低并收集特定數(shù)量的充滿(mǎn)組織的管的粘附臂。該機(jī)器將管運(yùn)送到所述裝置，并且將管緊密包裝到相應(yīng)的模塊孔1020、1030、1040、1050中。緊密包裝允許摩擦力將管保持在合適的位置，而不受細(xì)胞培養(yǎng)模擬裝置的任何攪拌的影響。這使得在各孔1020、1030、1040、1050中的管周?chē)囊毫鳚B漏減至最小。通過(guò)緊密配合，大約5-10％的液流包圍住管，并且直接流到硅氧烷基底或彈性體溝槽1110。
圖13顯示彈性體溝槽。彈性體溝槽是一片硅氧烷彈性體，其中具有基本上為矩形的開(kāi)口。矩形開(kāi)口作為來(lái)自孔1020、1030、1040和1050的流體的流體儲(chǔ)存器。彈性體溝槽1110在一側(cè)具有用數(shù)字標(biāo)記1300標(biāo)出的開(kāi)口。返回線(xiàn)路1130的一個(gè)末端與彈性體溝槽1110中的開(kāi)口1300連接，另一個(gè)末端與芯片1000的肺孔1010連接。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用硅氧烷彈性體泵1400代替彈性體溝槽1110，如圖14所示。硅氧烷彈性體泵1400設(shè)計(jì)為在芯片1000上和在數(shù)字標(biāo)記1100所示的整個(gè)系統(tǒng)中更精確地再生循環(huán)系統(tǒng)流動(dòng)。泵1400包括第一肺腔室1410和第二系統(tǒng)腔室1412，它們由分別的致動(dòng)器1420和1422致動(dòng)。利用多個(gè)腔室1410和1412，產(chǎn)生了更具生理學(xué)現(xiàn)實(shí)的泵送模式，其在芯片1000底部上具有多溝槽彈性體基底。通過(guò)在硅氧烷彈性體溝槽1400中產(chǎn)生多個(gè)腔室1410和1412，并且具有以特定時(shí)間間隔向基底部分上推動(dòng)的致動(dòng)器，復(fù)制了心臟的泵送作用。
圖28A是顯示根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的用于控制微型培養(yǎng)裝置的系統(tǒng)的框圖。在該實(shí)施方案中，系統(tǒng)2800包括與控制設(shè)備2802連接的第一微型培養(yǎng)裝置2806。第一微型培養(yǎng)裝置2806包括多個(gè)微型腔室(2808、2810、2812和2814)和將腔室相互連接的微流通道，這些微型腔室的幾何學(xué)模擬與培養(yǎng)基的多種體內(nèi)相互作用，其中每個(gè)腔室包括用于培養(yǎng)基流動(dòng)的入口和出口?？刂圃O(shè)備2802包括從第一微型培養(yǎng)裝置2806獲得數(shù)據(jù)并且控制其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算機(jī)2804。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在計(jì)算機(jī)化芯片上形成第一微型培養(yǎng)裝置2806。第一微型培養(yǎng)裝置2806進(jìn)一步包括與控制設(shè)備2802連接的用于測(cè)量腔室中的生理學(xué)事件的一個(gè)或多個(gè)傳感器。該傳感器包括一個(gè)或多個(gè)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基的氧、二氧化碳或pH的生物傳感器。控制設(shè)備2802容納第一微型培養(yǎng)裝置2806，密封第一微型培養(yǎng)裝置2806的頂部，以建立微流通道。控制設(shè)備2802提供微流體相互連接，使得微流體流進(jìn)或流出該裝置。在另一實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)2804控制選自泵速、溫度、實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)度和第一微型培養(yǎng)裝置2806的數(shù)據(jù)獲取頻率的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)2804提供設(shè)置屏(set-up screen)，使得操作者也可以手工確定泵速、裝置溫度、實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)度和數(shù)據(jù)獲取頻率(例如每15分鐘)。在另一實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)2804控制選自流速、腔室?guī)缀涡螤詈偷谝晃⑿团囵B(yǎng)裝置2806中的細(xì)胞數(shù)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在該實(shí)施方式中，系統(tǒng)2800提供比完整動(dòng)物研究和傳統(tǒng)組織培養(yǎng)研究更快速、更靈敏的響應(yīng)。通過(guò)控制參數(shù)，系統(tǒng)2800不再是基于生理學(xué)的。在另一實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)2804進(jìn)一步控制第一微型培養(yǎng)裝置2806中的一個(gè)或多個(gè)泵，以在腔室(2808、2810、2812和2814)中產(chǎn)生與活體中相當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基停留時(shí)間。在另一實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)2804進(jìn)一步控制一個(gè)或多個(gè)沿微流通道分布的閥，其控制方式與被模擬的活體部分相關(guān)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值一致。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，系統(tǒng)2800進(jìn)一步包括具有多個(gè)微型腔室和將腔室相互連接的微流通道的第二微型培養(yǎng)裝置，該微型腔室的幾何形狀模擬大量與培養(yǎng)基的體內(nèi)相互作用，其中每個(gè)腔室包括用于培養(yǎng)基流動(dòng)的入口和出口?？刂圃O(shè)備2802與第二微型培養(yǎng)裝置連接。
圖28B是顯示用于控制微型培養(yǎng)裝置的系統(tǒng)的另一實(shí)施方案的框圖。在該實(shí)施方案中，系統(tǒng)2816包括與控制設(shè)備2818連接的第一微型培養(yǎng)裝置。控制設(shè)備2818包括計(jì)算機(jī)2804、控制微流體在第一微型培養(yǎng)裝置2806的微流通道中循環(huán)的泵2820、控制第一微型培養(yǎng)裝置2806的溫度的加熱元件2822、光源2824和檢測(cè)第一微型培養(yǎng)裝置2806內(nèi)細(xì)胞區(qū)室發(fā)出的熒光發(fā)射的光電探測(cè)器2826。在一個(gè)實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)2804使用測(cè)量?jī)x器記錄熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，該測(cè)量?jī)x器的類(lèi)型選自比色、熒光、發(fā)光和放射測(cè)量類(lèi)型。在另一實(shí)施方式中，加熱元件2822將第一微型培養(yǎng)裝置2806保持在37℃的溫度。
圖29是說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案用于動(dòng)態(tài)控制微型培養(yǎng)裝置的計(jì)算機(jī)化方法的流程圖。在該實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)化方法2900包括程序塊2902、2904、2906和2908。程序塊2902包括分析來(lái)自多個(gè)傳感器的數(shù)據(jù)，以測(cè)定微型培養(yǎng)裝置的多個(gè)腔室中的生理學(xué)事件。程序塊2904包括調(diào)節(jié)微型培養(yǎng)裝置的腔室中的培養(yǎng)基的流速。程序塊2906包括檢測(cè)微型培養(yǎng)裝置的腔室中的生理學(xué)或毒理學(xué)反應(yīng)。在這種檢測(cè)后，程序塊2908包括改變微型培養(yǎng)裝置的一個(gè)或多個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，程序塊2906(即檢測(cè))包括檢測(cè)微型培養(yǎng)裝置的細(xì)胞區(qū)室尺寸的變化。在一個(gè)實(shí)施方式中，程序塊2908(即改變)包括改變選自微型培養(yǎng)裝置中的細(xì)胞間相互作用、液體停留時(shí)間、液體∶細(xì)胞比、細(xì)胞的代謝和剪應(yīng)力的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，程序塊2908包括改變選自微型培養(yǎng)裝置中的流速、腔室?guī)缀涡螤詈图?xì)胞數(shù)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)化的方法2900進(jìn)一步包括優(yōu)化微型培養(yǎng)裝置內(nèi)的腔室的幾何形狀，其中這種優(yōu)化包括選擇一些腔室，選擇提供適當(dāng)組織或器官大小比的腔室的幾何形狀，選擇提供適當(dāng)液體停留時(shí)間的最佳流體流速，以及計(jì)算細(xì)胞剪應(yīng)力。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)化方法2900進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的溫度。在另一實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)化方法2900進(jìn)一步包括檢測(cè)來(lái)自微型培養(yǎng)裝置的細(xì)胞區(qū)室的熒光發(fā)射。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括存儲(chǔ)在上面的計(jì)算機(jī)可執(zhí)行的指令，用于運(yùn)行上述計(jì)算機(jī)化方法的各種實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括存儲(chǔ)器或存儲(chǔ)裝置。在另一個(gè)實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括嵌入載波中的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)信號(hào)。
圖30是說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案用于控制微型培養(yǎng)裝置的計(jì)算機(jī)的框圖。在該實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)3000包括微處理器3002、通用存儲(chǔ)器3004、非易失性存儲(chǔ)元件3006、包括與具有一個(gè)或多個(gè)傳感器的微型培養(yǎng)裝置之間的界面的輸入/輸出界面3008，和計(jì)算機(jī)軟件。該計(jì)算機(jī)軟件可在微處理器3002上執(zhí)行，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基在微型培養(yǎng)裝置的多個(gè)腔室中的流體流速，檢測(cè)在微型培養(yǎng)裝置的腔室中的生物學(xué)或毒理學(xué)反應(yīng)，并且在檢測(cè)后改變?cè)撐⑿团囵B(yǎng)裝置的一個(gè)或多個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，非易失性存儲(chǔ)元件3006包括從公開(kāi)的信息中獲得的歷史數(shù)據(jù)、從以前進(jìn)行的試驗(yàn)中收集的數(shù)據(jù)、或理論計(jì)算得出的數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)軟件通過(guò)將命令經(jīng)泵控制線(xiàn)路傳遞給微型培養(yǎng)裝置的一個(gè)或多個(gè)泵來(lái)調(diào)節(jié)流體的流速。在一個(gè)實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)一步可在微處理器3002上執(zhí)行，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的溫度。計(jì)算機(jī)軟件通過(guò)將命令通過(guò)加熱器線(xiàn)圈控制線(xiàn)路傳送給微型培養(yǎng)裝置的加熱器線(xiàn)圈來(lái)調(diào)節(jié)溫度。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)3000進(jìn)一步包括與通用存儲(chǔ)器3004相連的查表存儲(chǔ)器，其用于存儲(chǔ)代表該系統(tǒng)中各種生物學(xué)或化學(xué)物質(zhì)的基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)模型的一組質(zhì)量平衡方程，以及與微處理器3002連接的用于存儲(chǔ)計(jì)算機(jī)軟件的高速緩沖存儲(chǔ)器。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，輸入/輸出界面3008進(jìn)一步包括鍵盤(pán)界面、顯示界面和打印機(jī)/繪圖儀記錄儀界面。在一個(gè)實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)3000使用這些輸入/輸出界面連接至鍵盤(pán)、顯示器和打印機(jī)/繪圖儀記錄儀外圍設(shè)備。
實(shí)驗(yàn) 以下實(shí)施例是為了給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供如何進(jìn)行和使用本發(fā)明的完整公開(kāi)內(nèi)容和說(shuō)明，并非意在限制本發(fā)明的范圍。
已經(jīng)努力確保所使用的數(shù)量(例如含量、溫度、濃度)的精確性，但是存在一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另外說(shuō)明，份數(shù)是重量份，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度；壓力是大氣壓或接近大氣壓。
方法 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用以下方法 細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，Va.)獲得，并且在組織培養(yǎng)箱(95％ O2/5％ CO2)中在推薦的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中繁殖。對(duì)于HepG2和HepG2/C3A細(xì)胞，推薦的培養(yǎng)基是Eagle極限必需培養(yǎng)基(含有Earle平衡鹽溶液、2mM L-谷氨酰胺、1.0mM丙酮酸鈉、0.1mM非必需氨基酸、1.5g/L碳酸氫鈉和10％胎牛血清)(EMEM)。對(duì)于HCT116推薦使用含有1.5mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉和10％胎牛血清的McCoy′s 5a培養(yǎng)基。
生長(zhǎng)曲線(xiàn)。生長(zhǎng)曲線(xiàn)如下確定將細(xì)胞以初始低密度涂布到35mm培養(yǎng)皿中。每天，用胰蛋白酶-EDTA使細(xì)胞脫壁，并且通過(guò)使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀目視計(jì)數(shù)細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞數(shù)。該測(cè)定一式三份進(jìn)行。
逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。細(xì)胞在用膠原MATRIGELTM或適當(dāng)時(shí)用聚賴(lài)氨酸處理的蓋玻片上培養(yǎng)。用胰蛋白酶-EDTA使生長(zhǎng)至大約90％匯合單層的HepG2/C3A脫壁，并且于大約500g離心沉淀5分鐘。分離RNA并使用RNEASYTM試劑盒(Qiagen)按照生產(chǎn)商手冊(cè)純化。成人肝臟總RNA購(gòu)自Ambion。分離的RNA的量和純度(260/280nm比)用BIOPHOTOMETERTM分光光度計(jì)(Eppendorf)測(cè)定。分離的RNA然后與2UDNase I在37℃下孵育25分鐘，隨后用DNase滅活試劑(Ambion)滅活。
RT反應(yīng)使用5μg RNA、10μM oligo dT引物的混合物進(jìn)行，該混合物于72℃加熱2分鐘，然后在冰上2分鐘。接下來(lái)，在逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液中混合5mM DTT、600μM dNTP混合物、40U rRNasin、200USUPERSCRIPT IITM，在42℃下孵育1小時(shí)。
在使用細(xì)胞色素P450同工型特異性引物的50μl PCR反應(yīng)中使用2.0μl第一鏈cDNA(Rodriguez-Antona，C，Jover，R.，Gomez-Lechon，M.-J.，和Castell，J.V.(2000).Quantitative RT-PCR measurementof human cytochrome P-450sapplication to drug inductionstudies.Arch.Biochem.Biophys.，376109-116)。PCR條件為94℃ 4分鐘，然后94℃ 40秒，60℃ 45秒，72℃ 50秒的28個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸4分鐘。
PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上通過(guò)電泳分離，通過(guò)用SYBR Gold染色進(jìn)行顯示，并與適當(dāng)?shù)姆肿恿繕?biāo)準(zhǔn)比較以確定其真實(shí)性。為了對(duì)擴(kuò)增的cDNA進(jìn)行定量，各15μl PCR反應(yīng)液用0.1×Tris-EDTA緩沖液稀釋?zhuān)⒂媒K濃度為1∶400的PICOGREENTM(Molecular Probes)染色。在480nm激發(fā)和520nm發(fā)射下測(cè)量熒光。將結(jié)果對(duì)β-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化，從至少兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中一式三份進(jìn)行。
細(xì)胞生存、死亡和凋亡試驗(yàn)。細(xì)胞生存和死亡使用臺(tái)盼藍(lán)排除法或LIVE/DEAD染色(Molecular Probes)進(jìn)行確定。臺(tái)盼藍(lán)(GIBCO)正常情況下從細(xì)胞質(zhì)中排除，通過(guò)可見(jiàn)地將死亡或?yàn)l臨死亡的細(xì)胞染色為藍(lán)色而鑒定細(xì)胞膜受損的細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)向芯片裝置的再循環(huán)培養(yǎng)基中加入1∶1稀釋的0.4％(w/v)臺(tái)盼藍(lán)溶液。在室溫下將該溶液通過(guò)芯片泵送至廢液中30分鐘。從泵上除去外殼，在反射顯微鏡(Micromaster，F(xiàn)isher)下觀(guān)察。
LIVE/DEAD染料是由鈣熒光素AM和乙錠同型二聚體組成的雙組分染料?；罴?xì)胞活躍地水解鈣熒光素AM的乙酰氧甲酯(AM)部分，產(chǎn)生亮綠色的鈣熒光素?zé)晒?。相反，膜完整性受損的細(xì)胞允許正常的非膜透性乙錠同型二聚體將死亡或?yàn)l臨死亡的細(xì)胞的核染色為熒光紅色。細(xì)胞滲透核染液，Hoechst 33342，作為所有細(xì)胞的通用染液。使用的適當(dāng)?shù)臑V光片組，活細(xì)胞發(fā)綠色熒光，死亡或?yàn)l臨死亡的細(xì)胞發(fā)紅色熒光，所有細(xì)胞都根據(jù)藍(lán)色核熒光進(jìn)行定量。對(duì)于本文所述的實(shí)驗(yàn)，使用0.2％(w/v)的臺(tái)盼藍(lán)、1∶20,000的鈣熒光素AM、1∶5,000的碘化丙啶、和10μg/ml的Hoechst 33342。細(xì)胞用M2Bio立體熒光顯微鏡(Zeiss)觀(guān)察。所有實(shí)驗(yàn)都至少重復(fù)三次，并一式三份進(jìn)行測(cè)定。
細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡可以用大量方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)(Smyth，P.G.，Berman，S.A.和Bursztajn，S.(2000).Markers of apoptosismethods for elucidating the mechanism of apoptotic cell deathfrom the nervous system.Biotechniques，32648-665)。為了區(qū)別細(xì)胞凋亡和壞死，至少需要兩種單獨(dú)的指示劑(Wronslri，R.，Golob，N.和Gryger，E.，(2002).Two-color，fluorescence-basedmicroplate assay for apoptosis detection.Biotechniques，32666-668)。一種方法，膜聯(lián)蛋白V-FITC結(jié)合，依賴(lài)于在二價(jià)鈣存在下膜聯(lián)蛋白V與磷脂酰絲氨酸緊密結(jié)合的發(fā)現(xiàn)(Williamson，P.，Eijnde，S.v.d.和Schlegel，R.A.(2001).Phosphatidylserineexposure and phagocytosis of apoptotic cells.In Apoptosis，L.M.Schwartz和J.D.Ashwell，eds.(San Diego，Academic Press)，pp.339-364)。在正常情況下，磷脂酰絲氨酸存在于細(xì)胞膜的內(nèi)小葉上，但是在凋亡早期轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上。暴露于熒光團(tuán)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白的凋亡細(xì)胞顯示出不同的膜染色。使用微型芯片，直接在芯片上顯示膜聯(lián)蛋白V-FITC標(biāo)記，包括首先用PBS沖洗該系統(tǒng)，然后再循環(huán)膜聯(lián)蛋白V-FITC(10μg/ml，在膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液中，Clontech)30分鐘。然后用FITC濾光片組直接顯示細(xì)胞。
與膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記不同，APOPTAGTM試劑盒(Intergen Co.，MA)使用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記在凋亡DNA降解過(guò)程中暴露的游離的3′-OH DNA末端，并使用免疫熒光顯示(Li，X.，Traganos，F(xiàn).，Melamed，M.R.和Darzynkiewicz，Z.(1995).Single-step procedure forlabeling DNA strand breaks with flourescein-orBODPY-conjugated deoxynucleotidesdetection of apoptosis andbromodeoxyuridine incorporation.Cytometry 20，172-180)。盡管該方法對(duì)于細(xì)胞凋亡是高度特異性的，但是由于固定和孵育步驟，該程序不能在芯片上進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，微型芯片在特定實(shí)驗(yàn)條件下運(yùn)行，將細(xì)胞芯片從它們的外殼單元中取出，在1％多聚甲醛中固定，并用APOPTAGTM試劑盒按照生產(chǎn)商的方案處理。
微型芯片制造和實(shí)驗(yàn)方法。微型芯片如下制造使用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD)軟件(Cadence)設(shè)計(jì)一種模式，并且使用GCA/Mann 3600F光學(xué)圖形發(fā)生器產(chǎn)生鉻光掩膜。然后通過(guò)使用Karl Suss MA6接觸光刻機(jī)通過(guò)光掩膜將晶片暴露于紫外線(xiàn)，將這種高分辨率的圖形轉(zhuǎn)移到含有正性光刻膠(Shipley 1813)薄涂層(大約1μm)的硅片上。在暴露后，曝光光刻膠，由此以定義的圖案通過(guò)光刻膠層暴露了硅。使用PlasmaTherm SLR 770 ICP Deep硅蝕刻系統(tǒng)將暴露的硅蝕刻為特定深度(20至100μm)。使用丙酮從晶片上剝?nèi)ス饪棠z。由晶片切割各22mm2的微型芯片，在Nanostrip(Cyantek)中洗滌，用蒸餾水漂洗，在170℃烘箱中干燥。
器官區(qū)室中的硅表面用膠原處理，以促進(jìn)細(xì)胞附著。大約10μl 1mg/ml的I型膠原溶液沉積在微型芯片的表面上，并且在室溫下孵育30分鐘。除去膠原溶液，器官區(qū)室用細(xì)胞培養(yǎng)基漂洗。將細(xì)胞從組織培養(yǎng)皿上分離，確定細(xì)胞數(shù)，并且調(diào)節(jié)濃度使得每個(gè)細(xì)胞區(qū)室中有匯合的細(xì)胞單層。例如，對(duì)于圖2所示的微型芯片(見(jiàn)上文)，10μl 2,400細(xì)胞/μl的L2細(xì)胞懸浮液沉積在細(xì)胞芯片的肺腔室上，15μl 3,400個(gè)細(xì)胞/μl的H4IIE細(xì)胞懸浮液沉積在肝腔室上。使細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中附著過(guò)夜。一旦細(xì)胞附著，即將芯片裝配在丙烯酸芯片外殼中。外殼的頂部含有流體相互連接，以給芯片提供細(xì)胞培養(yǎng)基。不銹鋼管與微口徑泵管連接，并且插入微量離心管頂部的小孔中，該微量離心管含有含或不含受試化合物的培養(yǎng)基。泵管與蠕動(dòng)泵連接，用該溶液預(yù)處理，并且連接到芯片外殼的入口。不銹鋼管與末端連接的泵管的一小部分連接到出口，并且該管插入到微管頂部的小孔中，從而實(shí)現(xiàn)再循環(huán)流體回路。將整個(gè)設(shè)備置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中。該裝置的示意圖見(jiàn)圖22。實(shí)施例1 對(duì)于復(fù)制大鼠系統(tǒng)的計(jì)算 在設(shè)計(jì)芯片1000時(shí)，所有必要的腔室配合到不大于2cm×2cm的硅芯片上。這種芯片大小易于制造，并且與連接管和用于引導(dǎo)液流的泵裝置的大小匹配。也有幾種其他的重要因素限制以下所列裝置的設(shè)計(jì)，以及每個(gè)變量的可接受的值。該裝置的這樣一種實(shí)施方案由兩區(qū)室系統(tǒng)組成，一個(gè)區(qū)室代表大鼠的肝臟，一個(gè)區(qū)室代表大鼠的肺。芯片的總大小為2cm×2cm，并且由相互連接的用作“肺”腔室的20個(gè)寬40μm、深10μm、長(zhǎng)5mm的平行通道和用作“肝”腔室的100μm寬、20μm深、10cm長(zhǎng)的兩個(gè)蛇形平行通道的陣列組成。兩個(gè)器官區(qū)室通過(guò)100μm寬、20μm深的通道連接。存在許多其他可能的腔室?guī)缀涡螤?、尺寸、?shù)量等。選擇這種設(shè)計(jì)作為一個(gè)實(shí)例。
表1 樣品計(jì)算 通道或腔室計(jì)算 這些計(jì)算假定我們已經(jīng)通過(guò)上述用于系統(tǒng)1100的芯片1000的方法從以前的迭代中獲得了流速。
這時(shí)，Q＝8.05×105μm3/溝槽-秒。
然后通過(guò)以下公式計(jì)算液體在溝槽中的停留時(shí)間
然后，計(jì)算“細(xì)胞-長(zhǎng)度”中的細(xì)胞數(shù) vR＝2.48sec

N長(zhǎng)度＝7個(gè)細(xì)胞(每項(xiàng)分別四舍五入) 然后，計(jì)算通道/腔室細(xì)胞-長(zhǎng)度體積 VTCL＝(細(xì)胞直徑)·(溝槽橫截面面積) VTCL＝(7.41μm)·(7.41μm2) VTCL＝2960μm3 也確定了細(xì)胞-長(zhǎng)度體積。


VCCL＝1120μm3 液體細(xì)胞-長(zhǎng)度體積只是從通道/腔室細(xì)胞-長(zhǎng)度體積中減去細(xì)胞的細(xì)胞-長(zhǎng)度體積。細(xì)胞的細(xì)胞-長(zhǎng)度體積與液體細(xì)胞-長(zhǎng)度體積的比 值得到該系統(tǒng)的液體∶細(xì)胞體積比

比值＝1.65 確定與給定流速有關(guān)的對(duì)個(gè)體細(xì)胞的剪應(yīng)力。基于液體細(xì)胞-長(zhǎng)度體積和細(xì)胞直徑，計(jì)算液體可以流過(guò)的平均表面積。

ALS＝249μm2 然后計(jì)算通道中流體的平均線(xiàn)速度。



假定為層流，用斯托克斯定律計(jì)算球體上的阻力(drag)，以估計(jì)單個(gè)細(xì)胞經(jīng)歷的總剪應(yīng)力，

然后，證實(shí)液體在通道/腔室中的實(shí)際停留時(shí)間，并計(jì)算通道/腔室中的細(xì)胞總數(shù)，

N細(xì)胞＝9.45×104個(gè)細(xì)胞 I.B.膜充氧計(jì)算 用于充氧的硅氧烷膜的面積按照下列方式確定 首先，大概估計(jì)細(xì)胞的氧吸收率(OUR)
然后計(jì)算膜內(nèi)部的氧分壓，以確定其是否足以給液體培養(yǎng)基再充氧。這使用氣體通過(guò)多孔膜的流通量的方程式進(jìn)行，其中Q是膜通透性。J表示氣體向細(xì)胞內(nèi)的流通量，z是膜的厚度


該壓力足以在接觸膜200秒內(nèi)使液體培養(yǎng)基成為氧飽和的。用迭代法確定膜面積，以使內(nèi)部氧分壓達(dá)到最大。
斯托克斯定律3πηDU＝FD(涂布面積是通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定的L2和H4IIE細(xì)胞的飽和密度的倒數(shù)) 實(shí)施例2四器官區(qū)室芯片 芯片設(shè)計(jì)為由四個(gè)器官區(qū)室組成-代表負(fù)責(zé)生物異源物質(zhì)代謝的器官的“肝”區(qū)室，代表靶組織的“肺”區(qū)室，提供疏水化合物的生物積累部位的“脂肪”區(qū)室，以及輔助模擬非代謝、非積累組織中的循環(huán)模式的“其他組織”區(qū)室(圖15)。這些和其他器官區(qū)室(例如腎臟、心臟、結(jié)腸或肌肉)可以完全模塊化為CAD文件，并且可以以任何構(gòu)造或組合制造。裝置本身可以在任意數(shù)量的基板(例如硅、玻璃或塑料)中產(chǎn)生。
一旦細(xì)胞接種到適當(dāng)?shù)膮^(qū)室中，芯片將裝配在Lucite集合體(manifold)中。這種集合體容納有4個(gè)芯片，并且含有透明頂部，因此能夠在原處觀(guān)察細(xì)胞。頂部含有流體相互連接，以給芯片提供細(xì)胞培養(yǎng)基。使用蠕動(dòng)泵以0.5μl/min的流速泵送培養(yǎng)基通過(guò)芯片。培養(yǎng)基在由流體儲(chǔ)存器(大約15至50μL總體積)、微口徑管和芯片的區(qū)室和通道組成的密閉環(huán)路中再循環(huán)。
使用在肝區(qū)室中具有人HepG2-C3A細(xì)胞、在靶組織區(qū)室中具有HT29結(jié)腸癌細(xì)胞的三區(qū)室系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在連續(xù)操作大于144小時(shí)后仍然存活。HepG2-C3A細(xì)胞是一種良好表征的人肝細(xì)胞系，已知以相當(dāng)于新鮮原代人肝細(xì)胞的水平表達(dá)各種肝臟代謝酶。在這些實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞接種在適當(dāng)?shù)膮^(qū)室中，特別配制的細(xì)胞培養(yǎng)基通過(guò)該系統(tǒng)再循環(huán)可達(dá)144小時(shí)。在不同時(shí)間點(diǎn)，將培養(yǎng)基更換為含有LIVE/DEAD熒光試劑(雙熒光染料，[Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oreg.，USA])的PBS，保持30分鐘。細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀(guān)察，使用適當(dāng)?shù)臑V光片組獲得相同視野的熒光圖像?；罴?xì)胞發(fā)綠色熒光，而死細(xì)胞為紅色(數(shù)據(jù)未示出)。
實(shí)施例3 芯片中的藥物代謝 使用含有肝臟、靶組織和其他組織三個(gè)區(qū)室的微型芯片研究?jī)煞N廣泛應(yīng)用的前藥替加氟(tegafur)和舒林酸亞砜的代謝。兩種前藥都需要被肝臟中的酶轉(zhuǎn)化為活性代謝物，并且對(duì)靶器官具有細(xì)胞毒性作用。對(duì)于前藥舒林酸亞砜，它的抗炎性和化學(xué)防癌性質(zhì)來(lái)自于它的硫化物和砜代謝物，由肝臟酶亞砜還原酶催化。硫化物代謝物(和第二種砜代謝物)已經(jīng)證明在某些癌細(xì)胞(例如結(jié)腸癌)中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
一種適當(dāng)?shù)闹委煼桨感枰┯闷淝八幪婕臃鶾5-氟-1-(2-四氫呋喃基)-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮]，因?yàn)?-FU本身對(duì)正常細(xì)胞毒性極強(qiáng)。然而，與舒林酸不同，替加氟在肝臟中主要被細(xì)胞色素P450 2A6轉(zhuǎn)化為5-FU。
為了檢驗(yàn)舒林酸的效力，微型芯片在肝區(qū)室中接種HepG2-C3A細(xì)胞，在靶組織區(qū)室中接種HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞。將100微摩爾舒林酸(來(lái)自生產(chǎn)商)加入再循環(huán)培養(yǎng)基中，保持24小時(shí)，并且如上所述處理芯片-活細(xì)胞發(fā)綠色熒光，死細(xì)胞發(fā)紅色熒光(數(shù)據(jù)未示出)。在不存在HepG2-C3A肝細(xì)胞的情況下，觀(guān)察到最低水平的細(xì)胞死亡(類(lèi)似于載體對(duì)照)。這些結(jié)果證實(shí)藥物在肝區(qū)室中可以被代謝，然后循環(huán)到靶標(biāo)中，在該靶標(biāo)中其代謝物誘導(dǎo)生物效應(yīng)，幾乎如同在活動(dòng)物或人體中一樣。
在微型芯片系統(tǒng)中檢測(cè)癌癥治療前藥替加氟。替加氟需要被肝臟中存在的細(xì)胞色素P450酶代謝活化為其活性形式，5-氟尿嘧啶(5-FU)，才能具有效力(Ikeda，K.，Yoshisue，K.，Matsushima，E.，Nagayama，S.，Kobayashi，K.，Tyson，C.A.，Chiba，K.和Kawaguchi，Y.(2000).Bioactivation of tegafur to 5-fluorouracil iscatalyzed by cytochrome P-450 2A6 in human liver microsomes invitro.Clin.Cancer Res.，6，4409-4415；Komatsu，T.，Yamazaki，H.，Shimada，N.，Nakajima，M.和Yokoi，T.(2000).Roles ofcytochromes P450 1A2，2A6，and 2C8 in 5-fluorouracil formationfrom tegafur，an anticancer prodrug，in human liver microsomes.Drug Met.Disp.，28，1457-1463；Yamazaki，H.，Komatsu，T.，Takemoto，K.，Shimada，N.，Nakajima，M.和Yokoi，T.(2001).Ratcytochrome P450 1A and 3A enzymes involved in bioactivation oftegafur to 5-fluorouracil and autoinduced by tegafur livermicrosomes.Drug Met.Disp.，29，794-797)。一種適當(dāng)?shù)闹委煼桨感枰┯闷淝八幪婕臃?，因?yàn)?-FU本身對(duì)正常細(xì)胞毒性很強(qiáng)。5-FU是當(dāng)前最有效的結(jié)腸癌患者的輔助治療劑(Hwang，P.M.，Bunz，F(xiàn).，Yu，J.，Rago，C，Chan，T.A.，Murphy，M.P.，Kelso，G.F.，Smith，R.A.J.，Kinzler，K.W.和Vogelstein，B.(2001).Ferredoxinreductase affects p53-dependent，5-fluorouracil-inducedapoptosis in colorectal cancer cells.Nat.Med.，7，1111-1117)。象大多數(shù)化療劑一樣，5-FU在敏感的細(xì)胞中通過(guò)產(chǎn)生活性氧誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞凋亡(Hwang，P.M.，Bunz，F(xiàn).，Yu，J.，Rago，C，Chan，T.A.，Murphy，M.P.，Kelso，G.F.，Smith，R.A.J.，Kinzler，K.W.和Vogelstein，B.(2001).Ferredoxin reductase affectsp53-dependent，5-fluorouracil-induced in colorectal cancercells.Nat.Med.，7，1111-1117)。
為了測(cè)定替加氟對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)，準(zhǔn)備在肝區(qū)室中具有HepG2-C3A細(xì)胞、在靶組織區(qū)室中具有HCT-116人結(jié)腸癌細(xì)胞的微型芯片。將不同濃度的替加氟加到再循環(huán)培養(yǎng)基中保持24小時(shí)，并用膜通透性DNA染料Hoechst 33342和膜不透性DNA染料乙錠同型二聚體標(biāo)記細(xì)胞(見(jiàn)方法部分)。所有細(xì)胞都發(fā)藍(lán)色熒光，但是死細(xì)胞被熒光紅色乙錠同型二聚體標(biāo)記(數(shù)據(jù)未示出)。在這種微型芯片系統(tǒng)中，替加氟以劑量依賴(lài)的方式對(duì)HCT-116細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，而在傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中無(wú)效(圖16A和16B)。另外，5-FU在傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中引發(fā)細(xì)胞死亡，直到暴露48小時(shí)后才觀(guān)察到細(xì)胞毒性，而與之相比，使用微型芯片在暴露于替加氟24小時(shí)后觀(guān)察到細(xì)胞毒性。
為了證實(shí)肝區(qū)室負(fù)責(zé)替加氟的生物活化，向微型芯片上只接種HCT-116細(xì)胞。在肝區(qū)室中沒(méi)有細(xì)胞。向再循環(huán)培養(yǎng)基中添加替加氟或5-FU，保持24小時(shí)，并且如上所述處理芯片(數(shù)據(jù)未示出)。在不存在肝區(qū)室的情況下替加氟不引起HCT-116細(xì)胞的明顯的細(xì)胞死亡，而活性代謝物5-FU引起實(shí)質(zhì)性的細(xì)胞死亡。此外，當(dāng)用HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞代替HCT-116時(shí)，替加氟無(wú)效(數(shù)據(jù)未示出)。這可能是由于在HT-29細(xì)胞中存在突變p53，這是5-FU細(xì)胞毒性所必需的?？傊@些實(shí)驗(yàn)證明了替加氟象舒林酸一樣在肝區(qū)室中被代謝為活性藥物，在其中它被循環(huán)到另一個(gè)器官區(qū)室，清除癌細(xì)胞。使用芯片可以機(jī)械地區(qū)分這些效果-舒林酸甚至在不存在活性p53的情況下仍然有效，而替加氟無(wú)效。實(shí)施例4 單器官區(qū)室中的多細(xì)胞培養(yǎng)物 也可能在單器官區(qū)室中使用多細(xì)胞型的培養(yǎng)物。在一項(xiàng)研究中，在肝區(qū)室中使用肝細(xì)胞細(xì)胞系HepG2/C3A(來(lái)自ATCC)。該細(xì)胞在含有1.5mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉和10％胎牛血清的McCoy′s 5A培養(yǎng)基中繁殖。為了更接近地模擬體內(nèi)器官，與巨噬細(xì)胞(枯否細(xì)胞)一起，以1∶2的比例使用原代肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的混合物。
在另一個(gè)實(shí)施例中，使用來(lái)源于肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞或細(xì)胞系的混合物更接近地模擬肺組織。這包括I型上皮細(xì)胞、II型上皮細(xì)胞(肺顆粒狀細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞的混合物。
實(shí)施例5 基于芯片的系統(tǒng)中組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化 發(fā)展了與兩種不同大鼠細(xì)胞培養(yǎng)系H4IIE(大鼠肝細(xì)胞系)和L2(大鼠肺細(xì)胞系)相容的組織培養(yǎng)基。初步實(shí)驗(yàn)表明，在微型芯片中，DMEM和含有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉和10％胎牛血清(FBS)的Hams F12K培養(yǎng)基的1∶1混合物使H4IIE細(xì)胞和L2細(xì)胞在高達(dá)20小時(shí)的連續(xù)運(yùn)行中保持存活力。該培養(yǎng)基制劑用于所有基于大鼠的微型芯片研究。
選擇實(shí)際模擬人類(lèi)肝功能的適當(dāng)?shù)娜烁渭?xì)胞系。另外，確定用于在微型芯片上保持人細(xì)胞系的最佳細(xì)胞培養(yǎng)基制劑。確定了三種關(guān)鍵細(xì)胞色素P450(CYP)同工型(1A2、3A4和2D6)在HepG2和HepG2/C3A(HepG2亞克隆)細(xì)胞系中的基礎(chǔ)表達(dá)水平。檢查了CYP-1A2、2D6和3A4，因?yàn)樗鼈冋妓幸阎幬锏拇x的80-90％(Hodgson，J.，(2001).ADMET-turning chemicals into drugs.Nat.Biotech.，19，722-726)。檢查了HepG2肝細(xì)胞系的C3A亞克隆，因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道了該細(xì)胞系是比親代細(xì)胞系表現(xiàn)更多“肝樣”特性、特別是更高的CYP表達(dá)的高度選擇的細(xì)胞系(Kelly，J.H.(1994).Permanent humanhepatocyte cell line and its use in a liver assist device(LAD).美國(guó)專(zhuān)利No.5,290,684)。RT-PCR分析證實(shí)HepG2/C3A細(xì)胞中的基礎(chǔ)CYP水平顯著高于HepG2親本并且與成人肝臟相當(dāng)(圖23)。
在所有后面的實(shí)驗(yàn)中使用HepG2/C3A細(xì)胞作為肝臟替代物。為了選擇在微型芯片實(shí)驗(yàn)中使用的通用培養(yǎng)基，比較了許多培養(yǎng)基的成分(DMEM、McCoy′s 5a、RPMI1640、MEM、F12、F12K、Waymouth′s、CMRL、MEM和Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基)。對(duì)無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖、氨基酸組合物和維生素含量的分析提示EMEM、DMEM、McCoy′s 5a和RPMI是所檢查的培養(yǎng)基中最合適的“通用”培養(yǎng)基。在幾次傳代后，分開(kāi)細(xì)胞，并在以下培養(yǎng)基中亞培養(yǎng) 含有Earle平衡鹽溶液、2mM L-谷氨酰胺、1.0mM丙酮酸鈉、0.1mM非必需氨基酸、1.5g/L碳酸氫鈉和10％胎牛血清的Eagle極限必需培養(yǎng)基(EMEM)。
含有4mM L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氫鈉和10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)。
含有1.5mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氫鈉和10％胎牛血清的McCoy′s 5a培養(yǎng)基(McCoy′s)。
含有2mM L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖、1.0mM丙酮酸鈉、1.5g/L碳酸氫鈉的RPMI1640培養(yǎng)基(RPMI)。
然后如方法部分所述確定兩種細(xì)胞系在每種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)(圖24)。發(fā)現(xiàn)DMEM不適合HepG2/C3A細(xì)胞，因?yàn)樵诖蠹s5代后觀(guān)察到細(xì)胞形態(tài)學(xué)和粘附的顯著變化(未顯示)。類(lèi)似地，在RPMI中3天后注意到HepG2/C3A和HCT1116的存活力和生長(zhǎng)顯著降低。與它們優(yōu)選的培養(yǎng)基相比，兩種細(xì)胞系在McCoy′s和EMEM中生長(zhǎng)良好。
然后，利用RT-PCR研究(見(jiàn)方法部分)了在生長(zhǎng)于EMEM或McCoy′s中的HepG2/C3A細(xì)胞中這些CYP同工型的表達(dá)水平(圖25)。結(jié)果表明在保持CYP表達(dá)方面EMEM優(yōu)于McCoy′s和HepG2/C3A優(yōu)選的培養(yǎng)基。研究了不同生長(zhǎng)基底對(duì)CYP表達(dá)的影響(圖26)。用聚-D-賴(lài)氨酸或膠原處理的硅作為附著基底與在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)物處理的聚苯乙烯上生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了比較?？傊Y(jié)果表明EMEM支持HepG2/C3A和HCT116細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且根據(jù)RT-PCR CYP表達(dá)分析，膠原是優(yōu)選的基底。
使用這些條件，在微型芯片系統(tǒng)中在連續(xù)運(yùn)行下研究了細(xì)胞HepG2/C3A和HCT116的長(zhǎng)期細(xì)胞存活力。使用在肝區(qū)室中具有HepG2/C3A細(xì)胞和在靶組織區(qū)室中具有HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的三區(qū)室系統(tǒng)，證明在連續(xù)運(yùn)行長(zhǎng)于144小時(shí)下細(xì)胞仍然存活。在這些實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞接種到適當(dāng)?shù)膮^(qū)室中，EMEM通過(guò)該系統(tǒng)再循環(huán)可達(dá)144小時(shí)。在不同時(shí)間點(diǎn)(6、24、48、72、96、120和144小時(shí))，總的活細(xì)胞或死細(xì)胞用LIVE/DEAD染料顯示(數(shù)據(jù)未示出)。細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀(guān)察，使用適當(dāng)?shù)臑V光片組獲得相同視野的熒光圖像?；罴?xì)胞發(fā)綠色熒光，而死細(xì)胞為紅色(數(shù)據(jù)未顯示)。 實(shí)施例6在微型芯片上檢測(cè)細(xì)胞毒性的試驗(yàn) 臺(tái)盼藍(lán)是用來(lái)區(qū)分活細(xì)胞和非活細(xì)胞的最常用的染料；只有非活細(xì)胞吸收該染料并且顯示為藍(lán)色。相反，活的、健康的細(xì)胞顯示為圓形和可折射的，而不吸收藍(lán)色染料。使用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定微型芯片中的細(xì)胞存活力。盡管臺(tái)盼藍(lán)(見(jiàn)方法部分)易于使用并且只需要光學(xué)顯微鏡來(lái)觀(guān)察，但是活細(xì)胞隨著時(shí)間延長(zhǎng)將吸收臺(tái)盼藍(lán)，這可能影響結(jié)果。另外，臺(tái)盼藍(lán)對(duì)血清蛋白質(zhì)比對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)具有更高的親和力，因此當(dāng)使用含血清基質(zhì)時(shí)背景較暗。因此，研究了區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞的替代方法。
使用在蓋玻片上生長(zhǎng)的細(xì)胞優(yōu)化了LIVE/DEAD試驗(yàn)(見(jiàn)方法部分)。簡(jiǎn)言之，將HepG2/C3A細(xì)胞接種到聚-D-賴(lài)氨酸處理的蓋玻片上，并用1μM星形孢菌素處理以及不用其處理，保持24小時(shí)。星形孢菌素是一種廣譜蛋白質(zhì)激酶抑制劑，已知其可在許多細(xì)胞型中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Smyth，P.G.，Berman，S.A.和Bursztajn，S.(2002).Markersof apoptosismethods for elucidating the mechanism ofapoptotic cell death from the nervous system.Biotechniques，32，648-665)。蓋玻片用磷酸緩沖液(PBS)洗滌，加入LIVE/DEAD試劑，并且在室溫下孵育30分鐘。取出蓋玻片，進(jìn)行顯示(數(shù)據(jù)未顯示)。發(fā)現(xiàn)星形孢菌素明顯導(dǎo)致HepG2/C3A細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
然后優(yōu)化用于在微型芯片系統(tǒng)上檢測(cè)細(xì)胞毒性的試驗(yàn)。如方法部分所述，微型芯片細(xì)胞芯片在肝區(qū)室中接種HepG2/C3A細(xì)胞，在靶組織區(qū)室中接種HCT116細(xì)胞。將細(xì)胞芯片加到微型芯片系統(tǒng)上，如上所述用1μM星形孢菌素處理以及不處理。孵育24小時(shí)后，將再循環(huán)培養(yǎng)基更換為PBS，使其通過(guò)該系統(tǒng)流向廢物30分鐘，然后更換為含有LIVE/DEAD試劑的PBS，再流過(guò)該系統(tǒng)30分鐘。從系統(tǒng)中取出含有細(xì)胞芯片的丙烯酸外殼，置于立體熒光顯微鏡下，通過(guò)外殼的透明頂部觀(guān)察(數(shù)據(jù)未顯示)。在熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞，使用適當(dāng)?shù)臑V光片組獲得相同視野的熒光圖像?；罴?xì)胞發(fā)綠色熒光，而死細(xì)胞為紅色(數(shù)據(jù)未顯示)。與未處理的對(duì)照細(xì)胞芯片相比，1μM星形孢菌素處理24小時(shí)后導(dǎo)致明顯的HCT116細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例7 檢測(cè)細(xì)胞死亡發(fā)生和區(qū)分細(xì)胞凋亡或壞死的基于芯片的試驗(yàn) 研究了用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡的兩種不同的試驗(yàn)。第一種試驗(yàn)是可以作為APOPTAG(Intergen Co.，MA)以試劑盒形式獲得的基于免疫熒光的末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶BrdU缺口末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)(見(jiàn)方法部分)。該試驗(yàn)首先利用在蓋玻片上生長(zhǎng)的細(xì)胞優(yōu)化。簡(jiǎn)言之，將HepG2/C3A細(xì)胞接種到聚-D-賴(lài)氨酸處理的蓋玻片上，并用星形孢菌素處理以及不處理。蓋玻片如上所述處理(見(jiàn)方法部分)。測(cè)試了不同的星形孢菌素濃度和處理時(shí)間，結(jié)果表明與未處理的對(duì)照相比，1μM星形孢菌素在24小時(shí)孵育后引起顯著的細(xì)胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。然后，優(yōu)化用于在微型芯片系統(tǒng)上檢測(cè)細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)，并進(jìn)行APOPTAG法和LIVE/DEAD染色技術(shù)的比較。如方法部分所述，微型細(xì)胞芯片在肝區(qū)室中接種HepG2/C3A細(xì)胞，在靶組織區(qū)室中接種HCT116細(xì)胞。如上所述，將細(xì)胞芯片加到微型芯片系統(tǒng)上，并用1μM星形孢菌素處理以及不處理。24小時(shí)孵育后，將再循環(huán)培養(yǎng)基更換為PBS保持30分鐘。從外殼中取出一半細(xì)胞芯片，并且如上所述進(jìn)行APOPTAGTM試驗(yàn)。其余的細(xì)胞芯片保留在微型芯片系統(tǒng)中，如前所述進(jìn)行LIVE/DEAD染色技術(shù)。細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀(guān)察，使用適當(dāng)?shù)臑V光片組獲得相同視野的熒光圖像?；罴?xì)胞發(fā)綠色熒光，而死細(xì)胞為紅色(數(shù)據(jù)未顯示)。兩種技術(shù)產(chǎn)生極其相似的結(jié)果，即，與未處理的對(duì)照相比，暴露于1μM星形孢菌素24小時(shí)誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞的顯著的細(xì)胞凋亡(或細(xì)胞毒性)(數(shù)據(jù)未顯示)。
如方法部分所述利用膜聯(lián)蛋白V-FITC在微型芯片系統(tǒng)中檢測(cè)細(xì)胞凋亡。簡(jiǎn)言之，微型芯片細(xì)胞芯片在肝區(qū)室中接種HepG2/C3A細(xì)胞，在靶組織區(qū)室中接種HCT116細(xì)胞。如上所述將細(xì)胞芯片加到微型芯片系統(tǒng)上，并用1μM星形孢菌素處理以及不處理。6小時(shí)孵育后，將再循環(huán)培養(yǎng)基更換為含有膜聯(lián)蛋白V-FITC和Hoechst 33342的PBS，使其通過(guò)該系統(tǒng)流動(dòng)30分鐘。從丙烯酸外殼中取出細(xì)胞芯片，在熒光顯微鏡下觀(guān)察。在熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞，使用適當(dāng)?shù)臑V光片組獲得相同視野的熒光圖像?；罴?xì)胞發(fā)綠色熒光，而死細(xì)胞為紅色(數(shù)據(jù)未顯示)。與未處理的對(duì)照細(xì)胞芯片相比，1μM星形孢菌素在6小時(shí)處理后引起顯著的細(xì)胞凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例8 萘作為模型毒物的應(yīng)用 利用萘研究了毒理學(xué)，因?yàn)榉味拘孕枰诟闻K中進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化。因此，研究了萘對(duì)大鼠肺細(xì)胞系的影響。這些實(shí)驗(yàn)使用基于大鼠的三區(qū)室(肝、肺和其他組織)微型芯片，在肝區(qū)室中具有H4IIE細(xì)胞，在肺區(qū)室中具有大鼠L2細(xì)胞。如方法部分所述制造并準(zhǔn)備微型芯片用于實(shí)驗(yàn)。
微型芯片系統(tǒng)在存在或不存在250μg/ml萘的條件下運(yùn)行20小時(shí)，之后更換為含有臺(tái)盼藍(lán)的PBS。該溶液通過(guò)細(xì)胞芯片再循環(huán)30分鐘，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察芯片(參見(jiàn)方法部分)。萘導(dǎo)致細(xì)胞芯片的肺區(qū)室中大鼠L2細(xì)胞的顯著的細(xì)胞死亡，而在不存在萘的情況下未觀(guān)察到細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未顯示)。在含有或不含萘的H4IIE細(xì)胞區(qū)室中或者在不含H4IIE細(xì)胞的L2細(xì)胞區(qū)室中未觀(guān)察到細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
這些結(jié)果證明萘在“肝”區(qū)室中被活化，毒性代謝物循環(huán)到“肺”中，并且導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這些結(jié)果與使用臺(tái)式CCA裝置獲得的以及從PBPK模型預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)一致(Sweeney，L.M.，Shuler，M.L.，Babish，J.G.和Ghanem，A.(1995).A cell culture analogue of rodentphysiologyapplication of napthalene toxicology.Toxicol.inVitro，9，307-316)。
實(shí)施例9 人類(lèi)微型芯片原型 制造含有肺、靶組織和其他組織的區(qū)室的人類(lèi)生物芯片原型。區(qū)室和通道的尺寸如下 入口1mm×1mm 肝3.2mm寬，4mm長(zhǎng) 靶組織2mm×2mm 其他組織340μm寬，110mm長(zhǎng) 出口1mm×1mm 連接肝與Y連接的通道440μm寬 從Y連接到靶組織的通道100μm寬 人類(lèi)生物芯片原型如前所述制造。器官區(qū)室的布置旨在模擬與已經(jīng)口服的化合物(藥物)的接觸。當(dāng)化合物口服時(shí)，它被從小腸或大腸吸收到血液中。由此通過(guò)肝門(mén)靜脈直接循環(huán)到肝臟中，然后分布到全身(圖27)。因此，對(duì)于這種設(shè)計(jì)，肝臟是第一器官區(qū)室，然后分流到其他組織區(qū)室和靶組織腔室。其他組織區(qū)室代表體內(nèi)血液的分布和保留，靶組織區(qū)室代表目標(biāo)治療靶標(biāo)(例如代表結(jié)腸腫瘤的結(jié)腸癌細(xì)胞)。結(jié)論 本發(fā)明提供了一種基于藥代動(dòng)力學(xué)的培養(yǎng)裝置和系統(tǒng)，通常包括具有接收端和出口端的第一細(xì)胞培養(yǎng)腔室，和具有接收端和出口端的第二細(xì)胞培養(yǎng)腔室，和連接第一細(xì)胞培養(yǎng)腔室的出口端與第二細(xì)胞培養(yǎng)腔室的接收端的導(dǎo)管。優(yōu)選地，該裝置是基于芯片的，即，它在尺寸上是微型的。培養(yǎng)基可以通過(guò)第一細(xì)胞培養(yǎng)腔室、通過(guò)導(dǎo)管以及通過(guò)第二培養(yǎng)腔室循環(huán)。也可以在再循環(huán)環(huán)路中的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)給培養(yǎng)基充氧。
該裝置可以包括從該裝置的部分向芯片外的位置傳送信號(hào)的機(jī)構(gòu)，例如從該裝置的部分向芯片外的位置傳送信號(hào)的波導(dǎo)?？梢源嬖诙鄠€(gè)波導(dǎo)，例如第一波導(dǎo)傳送來(lái)自第一腔室的信號(hào)，第二波導(dǎo)傳送來(lái)自第二腔室的信號(hào)，等等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第一細(xì)胞培養(yǎng)腔室和第二細(xì)胞培養(yǎng)腔室中的至少一個(gè)是三維的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一細(xì)胞培養(yǎng)腔室和第二細(xì)胞培養(yǎng)腔室都是三維的。
用于保持存活狀態(tài)的細(xì)胞的裝置也包括流體循環(huán)機(jī)構(gòu)，可以是流通型流體循環(huán)機(jī)構(gòu)或再循環(huán)流體的流體循環(huán)機(jī)構(gòu)。用于保持存活狀態(tài)的細(xì)胞的裝置也包括至少連接第一區(qū)室和第二區(qū)室的流體路徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，除泡劑除去流動(dòng)路徑中的氣泡。該裝置可進(jìn)一步包括泵機(jī)構(gòu)。泵機(jī)構(gòu)可以位于基板上。
提供了一種改變基板大小以使至少兩種存活狀態(tài)的細(xì)胞類(lèi)型保持在至少兩個(gè)細(xì)胞腔室中的方法。該方法包括確定在基板上保持的細(xì)胞型的步驟，以及應(yīng)用來(lái)自基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)模型的限制以確定基板的物理特性的步驟。應(yīng)用來(lái)自基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)模型的限制的步驟包括確定將在基板上形成的腔室的類(lèi)型，還可包括確定至少一個(gè)細(xì)胞腔室的幾何形狀，以及確定將兩個(gè)細(xì)胞腔室互相連接的流動(dòng)路徑的幾何形狀。應(yīng)用來(lái)自基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)模型的限制的步驟還可包括確定流動(dòng)路徑的流動(dòng)基質(zhì)組成。
本說(shuō)明書(shū)中引用的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)都引入本文作為參考，如同每個(gè)一單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)具體且分別地引入作為參考。
應(yīng)當(dāng)理解，上述描述的目的在于說(shuō)明，而并非限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀以上描述后將會(huì)明白許多其他實(shí)施方案。本發(fā)明的范圍因此由附加的權(quán)利要求書(shū)以及這些權(quán)利要求所述的等同方案的全部范圍來(lái)確定。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及微型通透性材料。本發(fā)明的某些實(shí)施方案描述了作為與微型裝置結(jié)合的生物屏障的通透性材料，應(yīng)當(dāng)理解，微型通透性材料可以存在于多種環(huán)境和裝置中。
合適的微型裝置的一個(gè)例子包括一個(gè)或多個(gè)微型部件，這些部件的尺寸設(shè)置為在如下條件下保持生物材料在體外提供與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值相當(dāng)?shù)闹辽僖粋€(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值。關(guān)于微型部件的各種實(shí)施方案的形成和操作的細(xì)節(jié)在上面已經(jīng)披露。下面為了說(shuō)明，“微型”可以表示范圍為大約0.1μm到大約500μm的尺寸。因此，微型部件的尺寸可以為其至少一個(gè)維度落入微型范圍內(nèi)。還應(yīng)當(dāng)理解，本申請(qǐng)公開(kāi)的各種實(shí)施方案可以用大于上述微型水平的規(guī)模來(lái)實(shí)現(xiàn)。下面為了說(shuō)明，“毫米規(guī)?！笨梢员硎痉秶鸀榇蠹s0.1mm到大約100mm的尺寸。因此，本申請(qǐng)公開(kāi)的一個(gè)或多個(gè)部件可以為毫米規(guī)模的部件，其中其至少一個(gè)維度落入毫米規(guī)模范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解，某些部件可以具有一個(gè)為微型而另一個(gè)為毫米規(guī)模的尺寸組合。這些部件可以表征為兩種規(guī)模中的任一種。而且，本申請(qǐng)公開(kāi)內(nèi)容的各種部件可以用上述范圍之外的尺寸實(shí)現(xiàn)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，微型部件可以具有小于0.1μm或大于500μm的尺寸。同樣，在一個(gè)實(shí)施方案中，毫米規(guī)模的部件可以具有小于0.1mm或大于100mm的尺寸。
在其他實(shí)施方案中，微型通透性材料有利于不同流體系統(tǒng)之間的相互作用。例如，口服藥物進(jìn)入胃腸(GI)系統(tǒng)。一種或多種與藥物有關(guān)的化合物可以通過(guò)小腸內(nèi)層從GI系統(tǒng)通往循環(huán)系統(tǒng)的血液。血液中的藥物化合物可以到達(dá)并影響各個(gè)器官和/或系統(tǒng)。例如，藥物化合物可以從血液通往腦流體系統(tǒng)，由此影響大腦。
在一個(gè)實(shí)施例中，藥物化合物可以從血液通往肝臟中的膽道系統(tǒng)，并且進(jìn)入腸肝循環(huán)。藥物化合物可以長(zhǎng)時(shí)間保持在腸肝循環(huán)中，并且在肝臟中產(chǎn)生高濃度，因此可能意料之外地成為肝毒性的。
因此，人們可以理解，說(shuō)明藥物化合物或其代謝物在不同系統(tǒng)之間的通過(guò)可以更好地理解有關(guān)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)。
圖31顯示了在一個(gè)實(shí)施方案中，可以提供在第一和第二流體系統(tǒng)3102、3140之間的相互作用3100，并且在體外保持在生理參數(shù)值類(lèi)似于體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的值的條件下。為了說(shuō)明，第一流體系統(tǒng)3102包括一個(gè)或多個(gè)微型部件，第二流體系統(tǒng)3104也包括一個(gè)或多個(gè)微型部件。
如圖31進(jìn)一步所示，第一和第二流體系統(tǒng)3102、3140之間的相互作用3100可以涉及一種或多種化合物從第一系統(tǒng)3102向第二系統(tǒng)3104的通過(guò)(用3106箭頭表示)，和/或一種或多種化合物從第二系統(tǒng)3104向第一系統(tǒng)3102的通過(guò)(用3108箭頭表示)。
圖32顯示具有可以用微型部件構(gòu)成的一些實(shí)例流體系統(tǒng)的實(shí)例生物系統(tǒng)3110的框圖。血液循環(huán)系統(tǒng)3112、GI系統(tǒng)3114、膽道系統(tǒng)3116和腦流體系統(tǒng)3118是可以用微型部件模擬的一些非限制性實(shí)例。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在基于微型部件的系統(tǒng)之間提供至少一個(gè)系統(tǒng)間相互作用。各種系統(tǒng)間相互作用在下面更詳細(xì)地描述。
圖33A-33D顯示可以為兩個(gè)或多個(gè)流體系統(tǒng)排列的各種相互作用結(jié)構(gòu)的非限制性實(shí)例。在一個(gè)實(shí)施方案中，如圖33A所示，雙系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3120可以包括兩個(gè)系統(tǒng)“A”和“B”(3162和3164)之間的相互作用3172。圖33B顯示在一個(gè)實(shí)施方案中，三系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3130可包括A和B(3162和3164)之間的相互作用3174，以及B和“C”(3164和3166)之間的相互作用3176。圖33C顯示在一個(gè)實(shí)施方案中，四系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3140除了類(lèi)似于圖33B的相互作用3174和3176的相互作用3178和3180之外，還可以包括B和“D”(3164和3168)之間的相互作用3182。
在一個(gè)實(shí)施方案中，與相互作用3178和3180有關(guān)的藥代動(dòng)力學(xué)(圖33C)可能基本與相互作用3174和3176(圖33B)相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與相互作用3174和3176(圖33B)相比，附加的相互作用3182(圖33C)的存在可以顯著改變與相互作用3178和3180有關(guān)的藥代動(dòng)力學(xué)。
圖33D顯示在一個(gè)實(shí)施方案3150中，多個(gè)系統(tǒng)(例如，三個(gè))可以構(gòu)造為提供并模擬再循環(huán)功能。在所示的實(shí)例中，系統(tǒng)A和B(3162和3164)顯示通過(guò)相互作用3184相互作用；系統(tǒng)B和C(3164和3166)通過(guò)相互作用3186相互作用；系統(tǒng)C和A(3166和3162)通過(guò)相互作用3188相互作用。
圖33A-33D所示結(jié)構(gòu)的特定實(shí)例在下面更詳細(xì)地描述。其他結(jié)構(gòu)也是可能的。
圖34A-34C顯示了雙流體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3200的一個(gè)實(shí)施方案的各種視圖。圖34A顯示圖34B的裝配圖的局部分解圖，圖34C顯示俯視圖。第一系統(tǒng)顯示包括限定了一個(gè)或多個(gè)區(qū)室(示為區(qū)室3222)的層3220。如圖所示，可以經(jīng)輸入流動(dòng)(用箭頭3250表示)通過(guò)輸入途徑3212(通過(guò)蓋層3210限定)和輸入通道3260給區(qū)室3222提供流體，用于藥代動(dòng)力學(xué)研究。來(lái)自區(qū)室3222的流體可以通過(guò)輸出通道3262和輸出途徑3214(通過(guò)蓋層3210限定)作為輸出流(用箭頭3252表示)流出。
第二系統(tǒng)顯示包括限定了一個(gè)或多個(gè)區(qū)室(示為區(qū)室3232、3234、3236)的層3230。如圖所示，可以經(jīng)輸入流動(dòng)(用箭頭3254表示)通過(guò)輸入途徑3242(通過(guò)蓋層3240限定)和與區(qū)室3232連接的輸入通道3270給區(qū)室3232、3234和3236提供流體，用于藥代動(dòng)力學(xué)研究。來(lái)自區(qū)室3232的流體可以通過(guò)通道3272、3274和3278供應(yīng)給其他區(qū)室3234和3236。來(lái)自區(qū)室3234和3236的流體可以通過(guò)輸出通道3276和3280并通過(guò)輸出途徑3244(通過(guò)蓋層3240限定)作為輸出流(用箭頭3256表示)流出。
在一個(gè)實(shí)施方案中，區(qū)室、輸入和輸出途徑、和第一和第二系統(tǒng)的各個(gè)通道可以用以上公開(kāi)的各種技術(shù)形成。兩個(gè)流體系統(tǒng)的流體的循環(huán)可以用以上公開(kāi)的各種技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
如圖34A-34C所示，雙流體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3200包括位于第一系統(tǒng)3220的至少一個(gè)區(qū)室和第二系統(tǒng)3230的至少一個(gè)區(qū)室之間的通透性材料3224。在所示實(shí)例中，通透性材料3224被顯示為位于區(qū)室3222和3232之間，由此允許在第一和第二系統(tǒng)3220和3230之間的流體相互作用。通透性材料3224在下面更詳細(xì)地描述。
在圖34A-34C中，區(qū)室3222和3232和通透性材料3224顯示為具有不同的尺寸。這只是為了清楚地說(shuō)明。通透性材料3224的尺寸可以小于、大于或通常等于區(qū)室3222和3232中的一個(gè)或兩個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3224可以部分或基本上位于這些區(qū)室任一個(gè)的內(nèi)部，或區(qū)室3222和3232之間。
圖34D顯示圖34A所示實(shí)例結(jié)構(gòu)的變化的一個(gè)實(shí)施方案3200的局部分解圖。如圖所示，雙流體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3200可以包括第一模塊3902，第一模塊3902具有包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)室(示為區(qū)室3914)和/或一個(gè)或多個(gè)生物屏障(示為屏障3916)的第一培養(yǎng)系統(tǒng)。
如圖所示，雙流體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3200可以包括第二模塊3904，第二模塊3904具有包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)室(示為區(qū)室3918和3920)的第二培養(yǎng)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二模塊3904也可以包括一個(gè)或多個(gè)生物屏障(未示出)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，如圖所示，雙流體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3200可以包括促進(jìn)第一培養(yǎng)系統(tǒng)3902的流體流動(dòng)的流體相互連接3910。在一個(gè)實(shí)施方案中，外殼頂部3900可以位于第一模塊3902之上，并且限定流體相互連接3910的流體途徑。
類(lèi)似地，流體相互連接3922促進(jìn)第二培養(yǎng)系統(tǒng)3904的流體流動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，外殼底部3906可以位于第二模塊3904之下并且限定流體相互連接3922的流體途徑。
本文為了說(shuō)明，“通透性”材料包括允許一種或多種材料以在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的或模擬生物系統(tǒng)的選擇性方式通過(guò)的任何生物或非生物材料。因此，本文使用的通透性材料可以包括半透性材料。
上述雙系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3200可以為藥代動(dòng)力學(xué)研究提供組合的體外環(huán)境，例如，但不限于GI-血液、血液-膽汁、血液-腦、血液-組織、和血液-尿。
圖35A和35B顯示了三流體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3290的一個(gè)實(shí)施方案的局部分解圖和裝配圖。第一系統(tǒng)顯示包括限定了一個(gè)或多個(gè)區(qū)室(示為區(qū)室3304)的層3300。第二系統(tǒng)顯示包括限定了一個(gè)或多個(gè)區(qū)室(示為區(qū)室3322、3324和3328)的層3320。第三系統(tǒng)顯示包括限定了一個(gè)或多個(gè)區(qū)室(示為區(qū)室3342)的層3340。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)途徑3302a和3302b給第一系統(tǒng)3300供應(yīng)流體(箭頭3350和3352)。也可以通過(guò)途徑3344a和3344b給第三系統(tǒng)3340供應(yīng)流體(箭頭3354和3356)。第二系統(tǒng)3320可以具有提供第一和第二系統(tǒng)3300和3340之間的連接的循環(huán)。與第一系統(tǒng)3300相互作用的區(qū)室3322可以通過(guò)通道(未示出)和途徑3326a和3326b與區(qū)室3328相互連接，區(qū)室3328與第三系統(tǒng)3340相互作用。
如圖35A和35B所示，三流體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)3290包括兩個(gè)通透性材料裝配體3310和3330。第一通透性材料裝配體3310顯示構(gòu)造為使得通透性材料3312位于第一和第二系統(tǒng)3300和3320的區(qū)室3304和3322之間。第二通透性材料裝配體3330顯示構(gòu)造為使得通透性材料3332位于第二和第三系統(tǒng)3320和3340的區(qū)室3328和3342之間。
在圖35A和35B所示的實(shí)例結(jié)構(gòu)3290中，通透性材料3312和3332顯示為分開(kāi)的層3310和3330的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3312和3332可以形成為它們的一個(gè)相鄰層的一部分。例如，通透性材料3312可以形成為層3300和3320中任一個(gè)的一部分，使得通透性材料3312將區(qū)室3304和3322分開(kāi)。類(lèi)似地，通透性材料3322可以形成為層3320和3340中任一個(gè)的一部分，使得通透性材料3322將區(qū)室3328和3342分開(kāi)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3312和3322可以構(gòu)造為促進(jìn)它們各自的系統(tǒng)間相互作用。通透性材料3312和3322在下面更詳細(xì)地描述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，三系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可以按照以上關(guān)于圖35A和35B所述的方式實(shí)施。圖36顯示這種三流體系統(tǒng)的實(shí)例3360的框圖。藥物遞送系統(tǒng)3362可以代表第一系統(tǒng)3300(圖35A和35B)；器官系統(tǒng)3364可以代表第二系統(tǒng)3320；腦3366可以代表第三系統(tǒng)3340。藥物遞送系統(tǒng)3362和器官系統(tǒng)3364之間的相互作用3370可以代表通透性材料裝配體3310；器官系統(tǒng)3364和腦3366之間的相互作用3372可以代表通透性材料裝配體3330。
在三系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的應(yīng)用實(shí)例3360中，藥物遞送系統(tǒng)3362可以包括GI系統(tǒng)，器官系統(tǒng)可以包括各種器官(除腦以外)和血液循環(huán)系統(tǒng)。因此，相互作用3372可以包括與藥物有關(guān)的一種或多種化合物從GI系統(tǒng)向血液中轉(zhuǎn)移；相互作用3372可以包括與藥物有關(guān)的一種或多種化合物從血液向腦的流體系統(tǒng)轉(zhuǎn)移。
應(yīng)當(dāng)理解，其他三系統(tǒng)結(jié)構(gòu)也是可能的。
圖37顯示涉及肝3384的實(shí)例結(jié)構(gòu)3380的框圖。肝3384顯示通過(guò)腸肝循環(huán)(顯示為箭頭3390和3392)與GI道3382相互作用。肝3384也顯示與泌尿系統(tǒng)3388(顯示為箭頭3396)和組織3386(顯示為箭頭3394)相互作用。介于中間的血液循環(huán)系統(tǒng)可以促進(jìn)肝3384和泌尿系統(tǒng)3388之間的相互作用3396。類(lèi)似地，血液循環(huán)系統(tǒng)可以促進(jìn)肝3384和組織3386之間的相互作用3394。
圖38顯示血液循環(huán)系統(tǒng)3406也可以促進(jìn)與肝3384和GI道3382有關(guān)的腸肝循環(huán)過(guò)程。如圖所示，(肝3384的)膽道系統(tǒng)3402與GI系統(tǒng)3404相互作用(箭頭3410)，GI系統(tǒng)3404又與循環(huán)系統(tǒng)3406相互作用(箭頭3412)。循環(huán)系統(tǒng)3406與膽道系統(tǒng)3402相互作用(箭頭3414)，由此形成再循環(huán)過(guò)程。
如通常所知的，肝臟產(chǎn)生膽汁酸，膽汁酸遞送給小腸幫助消化。在消化道中，膽汁酸被轉(zhuǎn)化為結(jié)合的膽汁鹽(原發(fā)的或繼發(fā)的)，這些鹽被主動(dòng)或被動(dòng)地吸收到肝門(mén)循環(huán)中，被肝臟再循環(huán)。每個(gè)膽汁鹽分子在腸肝循環(huán)中一般再利用大約20次。
上述再循環(huán)過(guò)程的一個(gè)后果是藥物或其成分可以在腸肝循環(huán)中保留延長(zhǎng)的一段時(shí)間。因此，一些沒(méi)有毒性的分子可能在肝臟中積累，并且成為毒性的。因此，與腸肝循環(huán)過(guò)程有關(guān)的藥代動(dòng)力學(xué)可以提供對(duì)測(cè)試藥物的毒性(或非毒性)的重要理解。
如上所述，一種或多種類(lèi)型的通透性材料可以促進(jìn)上述不同流體系統(tǒng)之間的相互作用的各種特征。在一些實(shí)施方案中，這些通透性材料可以是微型透性裝置的一部分。
如以下更詳細(xì)描述的，本申請(qǐng)公開(kāi)內(nèi)容的一個(gè)或多個(gè)特征可以單獨(dú)地或以組合形式提供各種系統(tǒng)和方法。例如，一種裝置可以具有至少一個(gè)部件和通透性材料，該部件的尺寸設(shè)置為將生物材料保持在一定的條件下，該條件在體外提供與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值相當(dāng)?shù)闹辽僖粋€(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值。通透性材料在下面更詳細(xì)地描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)部件包括微型部件。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)部件可以構(gòu)造為至少代表一個(gè)或多個(gè)以下的非限定性實(shí)例系統(tǒng)中樞神經(jīng)、循環(huán)、消化、膽道、肺、泌尿、眼、嗅覺(jué)、上皮和淋巴系統(tǒng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述，所述裝置可進(jìn)一步包括至少一個(gè)與通透性材料連接的微流通道。這種通道可以促進(jìn)流體在通透性材料之中、穿過(guò)通透性材料、或在其附近的流動(dòng)，以提供至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種流體流動(dòng)的特性基于一種數(shù)學(xué)模型，如基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(″PBPK″)模型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)部件和/或通透性材料可以集成為芯片格式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料可以位于所述裝置之中或其外部。在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料可以包括至少部分涂覆有機(jī)材料的微孔材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞可以位于通透性材料之中、之上或靠近其兩側(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有這種細(xì)胞的裝置可以促進(jìn)諸如吸收特性、代謝酶活性和/或表達(dá)水平等參數(shù)的確定或評(píng)估。在一個(gè)實(shí)施方案中，位于通透性材料任一側(cè)上的細(xì)胞可以是相同的類(lèi)型或不同的類(lèi)型。
圖39顯示微型通透性裝置3420的一個(gè)實(shí)施方案，其具有促進(jìn)兩個(gè)流體系統(tǒng)之間的一個(gè)或多個(gè)相互作用的通透性材料3430。通透性材料3430的一些非限制性實(shí)例可以包括以下物質(zhì)膜、多孔膜、多孔硅、微孔硅、半透膜、微孔聚合物、多孔聚碳酸酯膜、藻酸鹽、膠原、MATRIGEL、細(xì)胞、細(xì)胞材料、組織和組織片。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3430可以在通透性材料3430的微孔表面之中、之上或附近包含有機(jī)或無(wú)機(jī)材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3430包括微孔材料。微孔材料的一些非限制性實(shí)例可以包括以下物質(zhì)在微孔材料的微孔表面之中、之上或附近培養(yǎng)、沉積或插入的有機(jī)或無(wú)機(jī)材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3430可以構(gòu)造為模擬生物屏障、物質(zhì)通過(guò)或穿過(guò)生物屏障、或者物質(zhì)在生物屏障中、通過(guò)生物屏障或被生物屏障吸收的至少一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物屏障可以包括以下至少一種胃腸屏障、血腦屏障、肺屏障、胎盤(pán)屏障、表皮屏障、眼屏障、嗅覺(jué)屏障、胃食管屏障、粘膜、血-尿屏障、空氣-組織屏障、血-膽汁屏障、口屏障、肛門(mén)直腸屏障、陰道屏障和尿道屏障。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3430可以促進(jìn)各種藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定，而說(shuō)明一個(gè)或多個(gè)系統(tǒng)間相互作用。這些藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以包括下列至少一個(gè)組織大小、組織大小比、組織∶血液體積比、藥物停留時(shí)間、細(xì)胞間相互作用、液體停留時(shí)間、液體∶細(xì)胞比、細(xì)胞的代謝、剪應(yīng)力、流速、幾何形狀、循環(huán)通過(guò)時(shí)間、液體分布、組織和/或器官間相互作用和細(xì)胞的分子轉(zhuǎn)運(yùn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3430可以促進(jìn)物質(zhì)在通透性材料中、通過(guò)通透性材料或被通透性材料的吸收、代謝或分布。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3430可以形成于、包含于、插入、裝配、制造或構(gòu)建于一個(gè)裝置中，該裝置包括代表兩個(gè)或多個(gè)流體系統(tǒng)的多個(gè)微型部件。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3430的任一側(cè)或兩側(cè)可以構(gòu)造為允許細(xì)胞或細(xì)胞材料培養(yǎng)、附著或定位。這種構(gòu)造可以允許確定諸如吸收特性、代謝酶活性和/或表達(dá)水平等參數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3430可以包括能夠形成匯合單層并極化的細(xì)胞系。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性裝配體3430可以包括微型通透性材料3432。在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性材料3432可以包括具有多個(gè)孔的微孔基板。在一些實(shí)施方案中，孔通常具有小于大約10μm的尺寸。在一些實(shí)施方案中，微孔基板阻止尺寸大于大約10μm的顆粒通過(guò)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微孔基板可以由具有尺寸為大約0.1至10μm的孔的多孔硅形成。這種基板的厚度“T”的范圍可以為大約5至100μm。在一個(gè)實(shí)施方案中，微孔基板可以由具有尺寸為大約0.4μm的孔的多孔聚碳酸酯膜形成。這種基板的厚度“T”可以為大約100μm。在一個(gè)實(shí)施方案中，微孔基板可以由具有尺寸為大約0.2至1μm的孔的多孔低應(yīng)力氮化硅材料形成。這種基板的厚度“T”的范圍可以為大約2-5μm。
在一個(gè)實(shí)施方案中，側(cè)向尺寸“L”(與確定厚度的方向垂直)可以具有相對(duì)于區(qū)室438的側(cè)向尺寸的任何值。對(duì)于給定的厚度，較大的表面積(因此較大的側(cè)向尺寸)可能提供較大量的兩個(gè)流體系統(tǒng)之間的相互作用。因此，兩個(gè)系統(tǒng)之間材料的通過(guò)量可以通過(guò)提供不同側(cè)向大小的表面積來(lái)控制。因此，側(cè)向尺寸L可以小于、基本上等于(如圖39的實(shí)例所示)或者大于區(qū)室3438的相應(yīng)的側(cè)向尺寸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微孔基板具有范圍為大約0.1至10mm的側(cè)向尺寸。在實(shí)施方案中，側(cè)向尺寸大約為3.4mm×4mm。
如圖39進(jìn)一步所示，通透性裝配體3430可以進(jìn)一步包括一種或多種位于微型通透性材料3432之上、之內(nèi)和/或附近的功能特異性細(xì)胞3434。下面以血液和膽道系統(tǒng)之間的相互作用為例更詳細(xì)地描述功能特異性細(xì)胞3434。然而應(yīng)當(dāng)理解，不同的功能特異性細(xì)胞可以相對(duì)于微型通透性材料3432定位，以對(duì)不同的系統(tǒng)間相互作用提供所需的功能。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性裝配體3430可以進(jìn)一步包括一種或多種促進(jìn)細(xì)胞3434結(jié)合到微型通透性材料3432表面上的粘合劑3445。粘合劑3445的例子在下面更詳細(xì)地描述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性裝配體3430可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)提供類(lèi)似于成纖維細(xì)胞的功能的部件3436。在一個(gè)實(shí)施方案中，功能特異性細(xì)胞3434可以分布在微型通透性材料3432的表面上，并且成纖維細(xì)胞3436可以填充微型通透性材料3432表面上未被細(xì)胞3434占據(jù)的區(qū)域。在這種結(jié)構(gòu)中，成纖維細(xì)胞可以提供密封功能，使得材料通過(guò)通透性裝配體3430主要經(jīng)由細(xì)胞3434發(fā)生。
在一個(gè)實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞3436可以提供有利于生長(zhǎng)和維持細(xì)胞3434的環(huán)境。在一個(gè)實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞3436可以提供兩種功能—細(xì)胞生長(zhǎng)和維持，以及通透性材料3430的密封。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性裝配體3430可以形成為層3422的一部分，以在通透性裝配體3430的至少一例上限定區(qū)室3438。在其他實(shí)施方案中，通透性裝配體3430的兩側(cè)可以限定各自的區(qū)室。對(duì)于這種結(jié)構(gòu)，通透性裝配體3430可以在通透性裝配體3430的任一側(cè)或兩側(cè)上具有細(xì)胞3434和粘合劑3434。
圖40A和40B顯示各種實(shí)例情形，其中可以提供通透性裝配體以允許不同流體系統(tǒng)之間的相互作用。實(shí)例系統(tǒng)間的相互作用基于腸肝循環(huán)過(guò)程。然而，其他系統(tǒng)間相互作用可以以類(lèi)似的方式促進(jìn)。
圖40A顯示血流系統(tǒng)和膽汁流系統(tǒng)之間的相互作用結(jié)構(gòu)3440的一個(gè)實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性裝配體3442可以介于血流和膽汁流之間，并且可以包括微型通透性材料3444。在一些實(shí)施方案中，微型通透性材料3444可以以與以上關(guān)于圖39所述類(lèi)似的方式形成并且設(shè)置尺寸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性裝配體3442可以進(jìn)一步包括一種或多種功能特異性細(xì)胞3446。對(duì)于血液-膽汁相互作用，細(xì)胞3446可以包括肝細(xì)胞。
肝臟的肝細(xì)胞可以是極化的細(xì)胞；分化的肝細(xì)胞的不同表面可以具有獨(dú)特的功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，肝臟中底外側(cè)表面的竇狀膜和頂表面的膽小管膜可以用以下方式模擬。分離的肝細(xì)胞通常不被極化。當(dāng)物理接觸相鄰的肝細(xì)胞時(shí)，肝細(xì)胞通常成為極化的。膽小管可以在兩個(gè)或多個(gè)這樣并列的細(xì)胞之間形成。
外部信號(hào)對(duì)于上皮細(xì)胞極化可能是重要的，兩個(gè)相鄰肝細(xì)胞之間的物理接觸看來(lái)是這種肝細(xì)胞極化的信號(hào)。肝細(xì)胞可以與相鄰的肝細(xì)胞通過(guò)連接或粘附蛋白質(zhì)的結(jié)合形成連接，這些蛋白質(zhì)的相互作用看來(lái)是膽小管形態(tài)發(fā)生的重要的信號(hào)。
如圖40A所示，這些蛋白質(zhì)可以作為粘合劑3445促進(jìn)肝細(xì)胞3446與微型基板3444的結(jié)合和肝細(xì)胞的極化。在一些實(shí)施方案中，這些蛋白質(zhì)可以包括縫隙連接蛋白質(zhì)(例如聯(lián)接蛋白32)、緊密連接蛋白質(zhì)(例如閉合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2)、粘著連接蛋白質(zhì)(例如E-鈣粘蛋白和β-聯(lián)蛋白)、和細(xì)胞粘附分子(例如桑椹粘著蛋白)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，附著到微型通透性基板3444上的一種或多種這樣的蛋白質(zhì)可以有效地模擬相鄰肝細(xì)胞的血漿膜表面。當(dāng)分離的肝細(xì)胞與該表面結(jié)合時(shí)，肝細(xì)胞可以被誘導(dǎo)極化，使得頂表面或膽小管(3449b)可以在微型通透性基板3444的表面上形成，底外側(cè)或竇狀表面(3449a)可以在相對(duì)的表面上形成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，肝細(xì)胞3446可以以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N，以抑制細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。一旦肝細(xì)胞3446附著到微型通透性基板3444上，就可以在表面上培養(yǎng)成纖維細(xì)胞3448或其他合適的細(xì)胞，以基本上密封微型通透性表面未被肝細(xì)胞3446占據(jù)的區(qū)域，由此形成“血液-膽汁”屏障，和/或提供有利于肝細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以導(dǎo)入選擇的一種或多種目標(biāo)化合物，以在肝細(xì)胞3446上流過(guò)。這種化合物可以通過(guò)肝細(xì)胞3446穿過(guò)微型通透性表面轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入裝置3440的膽汁替代物流?？梢詼y(cè)定膽汁替代物流中該化合物或其代謝物的存在，以確定膽汁分泌。
一旦將膽汁轉(zhuǎn)移到GI系統(tǒng)中并且重吸收到血液系統(tǒng)中，GI系統(tǒng)中的“膽汁”可以包括以下化合物膽汁鹽類(lèi)(鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸、膽酸、α-鼠膽酸和β-鼠膽酸)；磷脂類(lèi)(磷脂酰膽堿(大約82％)、痕量的磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸和鞘磷脂)；膽汁醇類(lèi)(5β-膽固醇-3α，7α，12α，26-四醇)；和氨基酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，膽汁流可以與GI流連接，以進(jìn)一步模擬腸肝循環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，膽汁可以與GI液混合。這些混合可以(例如)以下面更詳細(xì)描述的方式實(shí)現(xiàn)。
在如圖40B所示的一個(gè)實(shí)施方案3460中，GI流可以與血流連接，以進(jìn)一步模擬腸肝循環(huán)。相互作用3460可以包括通透性裝配體3462，通透性裝配體3462具有微型通透性基板3464以及由一個(gè)或多個(gè)功能特異性細(xì)胞3466限定的表面。在一個(gè)實(shí)施方案中，功能特異性細(xì)胞3466可以包括腸上皮細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，Caco-2細(xì)胞3468可以設(shè)置在細(xì)胞3466附近，以促進(jìn)化合物從GI流向血流的體內(nèi)吸收。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性材料3462可以包括在微型通透性基板3464上培養(yǎng)的胃腸腸細(xì)胞層。在一個(gè)實(shí)施方案中，胃腸腸細(xì)胞層的至少一部分可以位于裝置3460中，使得流體可以沿該層的任一側(cè)流動(dòng)而不通過(guò)該層。在一個(gè)實(shí)施方案中，位于胃腸腸細(xì)胞層的第一側(cè)南上的至少第一微型部件可以代表胃腸道，位于該單層的第二側(cè)上的至少第二微型部件可以代表循環(huán)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以提供第三微型部件并且構(gòu)造為含有相同或不同類(lèi)型的生物材料。
圖41A和41B顯示裝置3700的實(shí)例實(shí)施方案的局部分解圖和裝配圖，其可以提供對(duì)以上所述腸肝再循環(huán)過(guò)程的藥代動(dòng)力學(xué)模擬。裝置3700可以包括GI替代模塊3720，GI替代模塊3720可以提供與以上圖40B所述類(lèi)似的GI-血液相互作用功能。裝置3700還可以包括器官系統(tǒng)模塊3730，器官系統(tǒng)模塊3730可以提供與以上圖40A所示類(lèi)似的血液-膽汁相互作用功能。機(jī)罩3710和3760可以為裝置3700提供外殼，并且也可以為各種液流提供途徑。
如圖所示，流入(箭頭3770)和流出(箭頭3772)GI替代模塊3720的G I流可以由相應(yīng)的途徑3712和3714提供。類(lèi)似地，流入(箭頭3774)和流出(箭頭3776)器官系統(tǒng)模塊3730的血液側(cè)的血流可以由相應(yīng)的途徑3762、3750和3752、3768提供。類(lèi)似地，流入(箭頭3778)和流出(箭頭3780)器官系統(tǒng)模塊3730的膽汁側(cè)的膽汁流可以由相應(yīng)的途徑3764和3766提供。
如圖所示，GI替代模塊3720可以包括區(qū)室3722，區(qū)室3722包括具有微型通透性基底3724的通透性裝配體。微型通透性基底3724可以由以上對(duì)于圖39所述的任意一種或組合的材料形成。通透性裝配體也可以包括在微型通透性基底3724上形成的腸上皮細(xì)胞3726。在一個(gè)實(shí)施方案中，區(qū)室3722的GI側(cè)可以包括與細(xì)胞3726相鄰的Caco-2細(xì)胞3728。如通常所知，Caco-2細(xì)胞可以促進(jìn)化合物從腸到血液的體外吸收。
通過(guò)GI替代模塊3720的通透性裝配體吸收的化合物可以在器官系統(tǒng)模塊3730的區(qū)室3732處進(jìn)入血液系統(tǒng)。血液可以在區(qū)室3732和一個(gè)或多個(gè)其他區(qū)室之間循環(huán)。為了說(shuō)明，顯示了具有用于血液-膽汁相互作用的通透性裝配體的區(qū)室3734和模擬靶器官的區(qū)室3744(通過(guò)靶細(xì)胞3746)。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶器官3744可以包括可被藥物活性影響的器官或組織。例如，當(dāng)檢測(cè)心臟藥物時(shí)，靶器官3744可以是心臟。在另一實(shí)施例中，當(dāng)檢測(cè)藥物毒性時(shí)，靶器官可以是胰。
區(qū)室3734的通透性裝配體顯示包括微型通透性基底3736。微型通透性基底3736可以由以上關(guān)于圖39所述的任意一種或組合的材料形成。通透性裝配體也可以包括在微型通透性基底3736上形成的肝細(xì)胞3738。在一個(gè)實(shí)施方案中，肝細(xì)胞3738可以通過(guò)粘合劑以上述圖40A的方式結(jié)合到微型通透性基底3736上。在一個(gè)實(shí)施方案中，通透性裝配體可以進(jìn)一步包括成纖維細(xì)胞3740，以提供以上關(guān)于圖40A所述的功能性。
器官系統(tǒng)模塊3730的通透性裝配體可以促進(jìn)血流(在區(qū)室3734的空間3742中)與膽汁流(在通透性裝配體的另一側(cè))之間的血液-膽汁相互作用。膽汁流然后可以通過(guò)途徑3764和3766循環(huán)，膽汁可以再引入(未示出)GI流中。
圖41C顯示了與圖41A所示相似的器官系統(tǒng)模塊3730的局部分解圖。在圖41C中，通過(guò)局部放大更詳細(xì)地顯示了具有用于血液-膽汁相互作用的通透性裝配體的區(qū)室3734。在一個(gè)實(shí)施方案中，區(qū)室3734的通透性裝配體可能類(lèi)似于以上關(guān)于圖39所述。因此，通透性裝配體3430可以包括通透性材料3432和在通透性材料3432的任一側(cè)或兩側(cè)上形成的細(xì)胞或細(xì)胞材料3434。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞3434可以是如本文所述結(jié)合的肝細(xì)胞。在一個(gè)使用肝細(xì)胞的實(shí)施方案中，通透性裝配體3430可以進(jìn)一步包括成纖維細(xì)胞3436。
圖42顯示了可以在圖41A和41B的實(shí)例腸肝再循環(huán)裝置中實(shí)現(xiàn)的不同液流的示意性實(shí)例3800。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以提供GI液流3802(以虛線(xiàn)顯示)以流經(jīng)具有如本文所述的胃腸-血液屏障3812的胃腸道區(qū)室3810。GI液流3802可以從GI液存儲(chǔ)器3850流向另一個(gè)存儲(chǔ)器(未示出)。在一個(gè)實(shí)施方案中，GI液流3802不再循環(huán)。
如圖42所示，GI-血液屏障3812可以促進(jìn)GI-膽汁相互作用。血流3804以實(shí)線(xiàn)表示。標(biāo)示為3804a的血流與胃腸道區(qū)室3810中的GI流3802通過(guò)屏障3812相互作用，并且導(dǎo)向肝區(qū)室3820。血液-膽汁屏障3822(如本文所述)可以促進(jìn)血流3804a與膽汁流3806的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，流向肝區(qū)室3820的膽汁流3806可以從膽汁流體存儲(chǔ)器3860中提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自肝區(qū)室3820的膽汁流3806可以與GI流3802在胃腸道區(qū)室3810上游的位置處混合，由此提供來(lái)自肝區(qū)室3820的膽汁的再循環(huán)功能。
在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自肝區(qū)室3820的血流3804a可以被引導(dǎo)到一個(gè)或多個(gè)其他區(qū)室中。例如，血流3804c(通過(guò)3804b)顯示將血液提供給靶組織區(qū)室3830，血流3804e(通過(guò)3804b)顯示給其他組織區(qū)室3840提供血液。來(lái)自區(qū)室3830和3840的血流3804d和3804f可以在胃腸道區(qū)室3810上游的位置處重新混合為血流3804g，它可以成為血流3804a的一部分。
圖43A至43E顯示了上述微型通透性裝置的一個(gè)實(shí)施方案的各個(gè)制造階段。圖44顯示了可以制造圖43A至43E的裝置的方法3520的一個(gè)實(shí)施方案。
如圖43A所示，可以在基板3500上形成開(kāi)口3502。開(kāi)口的形成可以在程序塊3522中實(shí)現(xiàn)。
如圖43B所示，微型通透性基板3504可以在開(kāi)口3502中形成。微型通透性基板3504的形成可以在程序塊3524中實(shí)現(xiàn)。
如圖43C所示，可以將一種或多種粘合劑3506設(shè)置在微型通透性基板3504上。粘合劑3506的提供可以在程序塊3526中實(shí)現(xiàn)。
如圖43D所示，一種或多種功能特異性細(xì)胞3508可以與微型通透性基板3504通過(guò)粘合劑3506結(jié)合。功能特異性細(xì)胞3508的這種結(jié)合可以在程序塊3528中實(shí)現(xiàn)。
如圖43E所示，可以在功能特異性細(xì)胞3508之間引入一種或多種成纖維細(xì)胞3510，以提供密封和/或促進(jìn)細(xì)胞3508的生長(zhǎng)和維持。成纖維細(xì)胞3510的這種引入可以在程序塊3530中實(shí)現(xiàn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性基板3504可以通過(guò)以下非限制性實(shí)施例來(lái)形成。在施加偏性的條件下通過(guò)用HF(氫氟酸)蝕刻由硅形成微孔表面。也可以應(yīng)用用于直徑大于大約0.4微米的孔徑的標(biāo)準(zhǔn)光刻法和蝕刻技術(shù)，或者應(yīng)用用于直徑小于大約0.4微米的孔徑的電子束光刻法和蝕刻法，由低應(yīng)力氮化硅薄膜形成微孔表面。
在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，可以應(yīng)用微接觸印刷技術(shù)將粘合蛋白質(zhì)在微孔表面上形成顯微圖案。硅氧烷彈性體“橡皮圖章”可以用復(fù)制模塑技術(shù)產(chǎn)生。橡皮圖章可以浸沒(méi)在粘合蛋白質(zhì)的溶液中，這些粘合蛋白質(zhì)然后可以沉積在微孔材料的表面上，由此產(chǎn)生粘合劑蛋白質(zhì)的顯微圖案。該方法通常被稱(chēng)為微接觸印刷。
在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，可以使肝細(xì)胞連接到粘合蛋白質(zhì)上，一旦連接，就可以將成纖維細(xì)胞就導(dǎo)入表面內(nèi)，并且允許附著到微孔表面上未被肝細(xì)胞占據(jù)的基本上所有區(qū)域。
也可以采用其他制造技術(shù)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，微型通透性材料(如圖39中的3432)和至少一種粘合劑(如圖43C中的3506)可以確定一種裝置。至少一種粘合劑可以設(shè)置為極化一種物質(zhì)，該物質(zhì)表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)可以是一種或多種肝細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)可以是遺傳工程生物材料。
在一個(gè)實(shí)施方案中，粘合劑可以將肝細(xì)胞結(jié)合并極化到微型通透性材料上。
在一個(gè)實(shí)施方案中，裝置可以包括微型通透性材料(如圖39中的3432)和至少一種表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性的物質(zhì)，其中該物質(zhì)處理的分子可以被引導(dǎo)通過(guò)微型通透性材料的至少一部分。
圖45顯示了可以使用本公開(kāi)內(nèi)容的一種或多種技術(shù)連接的系統(tǒng)的各個(gè)組合的非限制性實(shí)例。微型通透性裝置3540允許血液和膽汁系統(tǒng)之間的相互作用。微型通透性裝置3542允許血液和胃腸系統(tǒng)之間的相互作用。選擇的連接(以箭頭3544顯示)允許膽汁和胃腸系統(tǒng)之間的相互作用(例如，通過(guò)在選定的位置混合)。微型通透性裝置3546允許血液和腦系統(tǒng)之間的相互作用。微型通透性裝置3548允許血液和泌尿系統(tǒng)之間的相互作用。
應(yīng)當(dāng)理解，通過(guò)微型通透性裝置，其他系統(tǒng)間相互作用是可能的。因此通常，如圖46所示，微型通透性裝置3550允許第一流體系統(tǒng)和第二流體系統(tǒng)之間的相互作用。
在上述描述中，微型通透性裝置的各種實(shí)施方案被描述為層的一部分，而該層是系統(tǒng)層或是分開(kāi)的層的一部分。對(duì)于這種結(jié)構(gòu)，與不同系統(tǒng)有關(guān)的區(qū)室被描述為是在不同層上形成的。
在一些實(shí)施方案中，這不一定是必需的。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在層的一側(cè)上形成器官系統(tǒng)模塊(圖41A和41B中的3730)，并且可以在同一層的另一側(cè)上形成胃腸替代模塊(圖41A和41B中的3720)。
在另一個(gè)實(shí)例實(shí)施方案中，微型通透性裝置可以在給定的層上形成，以限定兩個(gè)區(qū)室，每個(gè)區(qū)室代表單獨(dú)的系統(tǒng)。因此，如圖47的實(shí)例實(shí)施方案3560所示，微型通透性裝置3562可以在層上形成，以限定并且分隔兩個(gè)區(qū)室3564和3566。因此，第一區(qū)室3564可以代表第一流體系統(tǒng)，第二區(qū)室3566可以代表第二流體系統(tǒng)。微型通透性裝置3562可以提供第一和第二流體系統(tǒng)之間的相互作用。因此可以形成更復(fù)雜的系統(tǒng)，如圖41A和41B所示。
盡管以上公開(kāi)的實(shí)施方案已經(jīng)展示、描述、指出了應(yīng)用于以上公開(kāi)的實(shí)施方案的本發(fā)明的基本新特征，但是應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明范圍的情況下可以進(jìn)行所示裝置、系統(tǒng)和/或方法的細(xì)節(jié)形式的各種省略、替代和改變。因此，本發(fā)明的范圍不應(yīng)限于上述描述，而應(yīng)由附加的權(quán)利要求書(shū)來(lái)限定。
權(quán)利要求
1.一種裝置，包括
至少一個(gè)微型部件，該部件的尺寸設(shè)置為在如下條件下保持生物材料在體外提供與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值相當(dāng)?shù)闹辽僖粋€(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值；和
通透性材料。
2.權(quán)利要求1的裝置，其中所述通透性材料選自膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸鹽、膠原、MATRIGEL、細(xì)胞、細(xì)胞材料、組織和組織片中的至少一種。
3.權(quán)利要求1的裝置，其中所述通透性材料進(jìn)一步在微孔表面之中、之上或附近包括有機(jī)或無(wú)機(jī)材料。
4.權(quán)利要求1的裝置，其中所述通透性材料構(gòu)造為模擬以下至少一種生物屏障，物質(zhì)在生物屏障中的通過(guò)或穿過(guò)，或者物質(zhì)在生物屏障中的、通過(guò)生物屏障的或被生物屏障的吸收。
5.權(quán)利要求4的裝置，其中所述生物屏障選自以下至少一種胃腸屏障、血腦屏障、肺屏障、胎盤(pán)屏障、表皮屏障、眼屏障、嗅覺(jué)屏障、胃食管屏障、粘膜、血-尿屏障、空氣-組織屏障、血-膽汁屏障、口屏障、肛門(mén)直腸屏障、陰道屏障和尿道屏障。
6.權(quán)利要求1的裝置，其中至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)選自下列至少一個(gè)組織大小、組織大小比、組織∶血液體積比、藥物停留時(shí)間、細(xì)胞間相互作用、液體停留時(shí)間、液體∶細(xì)胞比、細(xì)胞的代謝、剪應(yīng)力、流速、幾何形狀、循環(huán)通過(guò)時(shí)間、液體分布、組織和/或器官間相互作用和細(xì)胞的分子轉(zhuǎn)運(yùn)。
7.權(quán)利要求1的裝置，其中該裝置測(cè)定物質(zhì)在通透性材料中的、通過(guò)通透性材料的或被通透性材料的吸收、代謝或分布。
8.權(quán)利要求1的裝置，其中所述部件構(gòu)造為代表下列至少一個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、膽道系統(tǒng)、肺系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、眼系統(tǒng)、嗅覺(jué)系統(tǒng)、表皮系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)的至少一部分。
9.權(quán)利要求1的裝置，其中所述通透性材料位于該裝置的內(nèi)部或外部。
10.權(quán)利要求1的裝置，其進(jìn)一步包括至少一個(gè)與所述通透性材料連接的微流通道。
11.權(quán)利要求1的裝置，其中流體在通透性材料中的、通過(guò)通透性材料的或靠近通透性材料的流動(dòng)提供了所述至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
12.權(quán)利要求11的裝置，其中流體通過(guò)該裝置流動(dòng)的特性基于一種數(shù)學(xué)模型。
13.權(quán)利要求12的裝置，其中所述數(shù)學(xué)模型是基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(″PBPK″)模型。
14.權(quán)利要求1的裝置，其中所述部件或通透性材料集成為芯片格式。
15.權(quán)利要求1的裝置，其中所述通透性材料包括在微孔材料上培養(yǎng)的胃腸腸細(xì)胞層。
16.權(quán)利要求15的裝置，其中所述胃腸腸細(xì)胞層的至少一部分位于所述裝置中，使得流體可以沿該層的任一側(cè)流動(dòng)，但是不通過(guò)該層。
17.權(quán)利要求16的裝置，其中位于胃腸腸細(xì)胞層的第一側(cè)面上的至少第一微型部件代表胃腸道，位于該單層的第二側(cè)面的至少第二微型部件代表循環(huán)系統(tǒng)。
18.權(quán)利要求17的裝置，進(jìn)一步包括構(gòu)造為含有相同或不同類(lèi)型的生物材料的第三微型部件。
19.權(quán)利要求1的裝置，其中所述通透性材料包括至少部分包覆有機(jī)材料的微孔材料。
20.權(quán)利要求1的裝置，進(jìn)一步包括位于通透性材料之中、之上或靠近其兩側(cè)的細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的裝置，其中該裝置提供吸收特性、代謝酶活性和/或表達(dá)水平。
22.權(quán)利要求20的裝置，其中位于通透性材料任一側(cè)上的細(xì)胞為相同的類(lèi)型或不同的類(lèi)型。
23.權(quán)利要求1的裝置，進(jìn)一步在通透性材料的微孔表面之中、之上或附近包含肝細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的裝置，其中所述微孔表面的至少一部分包含使肝細(xì)胞極化的蛋白質(zhì)。
25.權(quán)利要求1的裝置，其中所述通透性材料包含能夠形成匯合單層的細(xì)胞系。
26.權(quán)利要求1的裝置，進(jìn)一步包含將肝細(xì)胞與通透性材料結(jié)合的粘合劑。
27.權(quán)利要求26的裝置，其中所述粘合劑使肝細(xì)胞極化。
28.權(quán)利要求26的裝置，其中所述粘合劑包括選自下組的至少一種蛋白質(zhì)、連接蛋白32、緊密連接蛋白、閉合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘著連接蛋白、E-鈣粘蛋白、β-聯(lián)蛋白、細(xì)胞粘附分子和桑椹粘著蛋白。
29.權(quán)利要求1的裝置，進(jìn)一步在通透性材料之中、之上或附近包括第二種類(lèi)型的生物材料。
30.權(quán)利要求1的裝置，進(jìn)一步在通透性材料之中、之上或附近包括成纖維細(xì)胞。
31.權(quán)利要求1的裝置，進(jìn)一步包括靠近通透性材料的第一側(cè)面的血液替代物流動(dòng)。
32.權(quán)利要求31的裝置，進(jìn)一步包括靠近通透性材料的第二側(cè)面的膽汁替代物流動(dòng)。
33.一種方法，包括
在如下條件下保持生物材料在體外提供與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值相當(dāng)?shù)闹辽僖粋€(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值；和
使物質(zhì)通過(guò)通透性材料的至少一部分。
34.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括將生物材料保持在微型部件之內(nèi)或附近。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述通透性材料選自膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸鹽、膠原、MATRIGEL、細(xì)胞、細(xì)胞材料、組織和組織片中的至少一種。
36.權(quán)利要求33的方法，其中所述通透性材料進(jìn)一步在微孔表面之中、之上或附近包含有機(jī)或無(wú)機(jī)材料。
37.權(quán)利要求33的方法，其中所述通透性材料構(gòu)造為模擬以下至少一種生物屏障，物質(zhì)在生物屏障中的通過(guò)或穿過(guò)，或者物質(zhì)在生物屏障中的、通過(guò)生物屏障的或被生物屏障的吸收。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述生物屏障選自以下至少一種胃腸屏障、血腦屏障、血-膽汁屏障、肺屏障、胎盤(pán)屏障、表皮屏障、眼屏障、嗅覺(jué)屏障、胃食管屏障、粘膜、血-尿屏障、空氣-組織屏障、口屏障、肛門(mén)直腸屏障、陰道屏障和尿道屏障。
39.權(quán)利要求33的方法，其中至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)選自下列至少一個(gè)組織大小、組織大小比、組織∶血液體積比、藥物停留時(shí)間、細(xì)胞間相互作用、液體停留時(shí)間、液體∶細(xì)胞比、細(xì)胞的代謝、剪應(yīng)力、流速、幾何形狀、循環(huán)通過(guò)時(shí)間、液體分布、組織和/或器官間相互作用和細(xì)胞的分子轉(zhuǎn)運(yùn)。
40.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括測(cè)定物質(zhì)在通透性材料中的、通過(guò)通透性材料的或被通透性材料的吸收、代謝或分布。
41.權(quán)利要求34的方法，其中所述部件構(gòu)造為代表下列至少一個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、膽道系統(tǒng)、肺系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、眼系統(tǒng)、嗅覺(jué)系統(tǒng)、表皮系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)的至少一部分。
42.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括將通透性材料定位于微型裝置的內(nèi)部或外部。
43.權(quán)利要求33的方法，其進(jìn)一步包括使流體通過(guò)至少一個(gè)與通透性材料連接的微流通道流動(dòng)。
44.權(quán)利要求33的方法，其中流體在通透性材料中的、通過(guò)通透性材料的或靠近通透性材料的流動(dòng)提供了至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
45.權(quán)利要求44的方法，其中流體通過(guò)該裝置流動(dòng)的特性基于一種數(shù)學(xué)模型。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述數(shù)學(xué)模型是基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(″PBPK″)模型。
47.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括將微型部件或通透性材料集成為芯片格式。
48.權(quán)利要求33的方法，其中所述通透性材料包括在多孔材料上培養(yǎng)的胃腸腸細(xì)胞層。
49.權(quán)利要求48的方法，進(jìn)一步包括定位胃腸腸細(xì)胞層的至少一部分，使得流體可以沿該層的任一側(cè)流動(dòng)，但是不通過(guò)該層。
50.權(quán)利要求49的方法，其中位于胃腸腸細(xì)胞層的第一側(cè)面上的至少第一微型部件代表胃腸道，位于該單層的第二側(cè)面上的至少第二微型部件代表循環(huán)系統(tǒng)。
51.權(quán)利要求50的方法，進(jìn)一步包括構(gòu)造為含有相同或不同類(lèi)型的生物材料的第三微型部件。
52.權(quán)利要求33的方法，其中所述通透性材料包括至少部分包覆有機(jī)材料的微孔材料。
53.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括將細(xì)胞定位于通透性材料之中、之上或靠近其兩側(cè)。
54.權(quán)利要求53的方法，進(jìn)一步包括提供吸收特性、代謝酶活性和/或表達(dá)水平。
55.權(quán)利要求53的方法，其中位于通透性材料任一側(cè)上的細(xì)胞為相同的類(lèi)型或不同的類(lèi)型。
56.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括將肝細(xì)胞定位于通透性材料的微孔表面之中、之上或附近。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述微孔表面的至少一部分包含使肝細(xì)胞極化的蛋白質(zhì)。
58.權(quán)利要求53的方法，其中所述通透性材料包含能夠形成匯合單層并極化的細(xì)胞系。
59.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括將肝細(xì)胞結(jié)合在通透性材料上。
60.權(quán)利要求59的方法，進(jìn)一步包括使肝細(xì)胞極化。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述結(jié)合包括使用粘合劑，該粘合劑是選自下組的至少一種蛋白質(zhì)、連接蛋白32、緊密連接蛋白、閉合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘著連接蛋白、E-鈣粘蛋白、β-聯(lián)蛋白、細(xì)胞粘附分子和桑椹粘著蛋白。
62.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括將將第二種類(lèi)型的生物材料定位在通透性材料之中、之上或附近。
63.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括將成纖維細(xì)胞定位在通透性材料之中、之上或附近。
64.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括使血液替代物靠近通透性材料的第一側(cè)面流動(dòng)。
65.權(quán)利要求64的方法，進(jìn)一步包括使膽汁替代物靠近通透性材料的第二側(cè)面流動(dòng)。
66.一種形成裝置的方法，包括
形成一個(gè)部件，該部件構(gòu)造為在如下條件下保持生物材料在體外提供與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值相當(dāng)?shù)闹辽僖粋€(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值；和
添加、形成或提供通透性材料，其中該通透性材料構(gòu)造為使物質(zhì)通過(guò)該通透性材料的至少一部分。
67.一種裝置，包括
在如下條件下保持生物材料的裝置在體外提供與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值相當(dāng)?shù)闹辽僖粋€(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值；和
提供通透性屏障的裝置。
68.一種裝置，包括
微型通透性材料；和
至少一種構(gòu)造為將物質(zhì)極化的粘合劑，其中該物質(zhì)表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性。
69.權(quán)利要求68的裝置，其中所述物質(zhì)是一種或多種肝細(xì)胞。
70.權(quán)利要求68的裝置，其中所述物質(zhì)是遺傳工程生物材料。
71.權(quán)利要求68的裝置，其中所述粘合劑將肝細(xì)胞結(jié)合并且極化到微型通透性材料上。
72.權(quán)利要求68的裝置，進(jìn)一步包括第二種物質(zhì)類(lèi)型。
73.權(quán)利要求1的裝置，進(jìn)一步包含位于微型通透性材料的至少一個(gè)表面附近的一種或多種成纖維細(xì)胞。
74.權(quán)利要求68的裝置，其中所述微型通透性材料選自有機(jī)材料、無(wú)機(jī)材料、膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸鹽、膠原、MATRIGEL、細(xì)胞、細(xì)胞材料、組織和組織片中的至少一種。
75.權(quán)利要求68的裝置，其中所述微型通透性材料位于微孔表面之中、之上或附近。
76.權(quán)利要求68的裝置，其中所述微型通透性材料構(gòu)造為模擬以下至少一種生物屏障，物質(zhì)在生物屏障中的通過(guò)或穿過(guò)，或者物質(zhì)在生物屏障中的、通過(guò)生物屏障的或被生物屏障的吸收。
77.權(quán)利要求68的裝置，其中所述裝置由微型通透性材料或通過(guò)微型通透性材料處理物質(zhì)。
78.權(quán)利要求77的裝置，其中所述處理進(jìn)一步包括以下至少一種分子的吸收、提取、排泄、代謝和分配。
79.權(quán)利要求68的裝置，其中所述微型通透性材料位于所述裝置的內(nèi)部或外部。
80.權(quán)利要求68的裝置，進(jìn)一步包括至少一個(gè)與微型通透性材料連接的微流通道。
81.權(quán)利要求68的裝置，其中流體通過(guò)所述裝置流動(dòng)的特性基于一種數(shù)學(xué)模型。
82.權(quán)利要求81的裝置，其中所述數(shù)學(xué)模型是一種基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(″PBPK″)模型。
83.權(quán)利要求68的裝置，其中所述部件或微型通透性材料集成為芯片格式。
84.權(quán)利要求68的裝置，其中所述裝置提供吸收特性、代謝酶活性和/或表達(dá)水平。
85.權(quán)利要求68的裝置，進(jìn)一步包括位于微型通透性材料之中、之上或靠近其兩側(cè)的生物材料。
86.權(quán)利要求85的裝置，其中位于微型通透性材料任一側(cè)上的生物材料為相同的類(lèi)型或不同的類(lèi)型。
87.權(quán)利要求68的裝置，其中微型通透性材料包含能夠形成匯合單層的細(xì)胞系。
88.權(quán)利要求68的裝置，其中所述粘合劑包括選自下組的至少一種蛋白質(zhì)、連接蛋白32、緊密連接蛋白、閉合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘著連接蛋白、E-鈣粘蛋白、β-聯(lián)蛋白、細(xì)胞粘附分子和桑椹粘著蛋白。
89.權(quán)利要求68的裝置，進(jìn)一步包括靠近微型通透性材料的第一側(cè)面的血液替代物流動(dòng)。
90.權(quán)利要求89的裝置，進(jìn)一步包括靠近微型通透性材料的第二側(cè)面的膽汁替代物流動(dòng)。
91.一種方法，包括將表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性的物質(zhì)以使該物質(zhì)極化的方式結(jié)合到微型通透性材料上。
92.權(quán)利要求91的方法，其中所述物質(zhì)是一種或多種肝細(xì)胞。
93.權(quán)利要求91的方法，其中所述物質(zhì)是遺傳工程生物材料。
94.權(quán)利要求91的方法，進(jìn)一步包括提供第二種物質(zhì)類(lèi)型。
95.權(quán)利要求91的方法，進(jìn)一步包括將一種或多種成纖維細(xì)胞定位于微型通透性材料的至少一個(gè)表面附近。
96.權(quán)利要求91的方法，其中所述微型通透性材料選自有機(jī)材料、無(wú)機(jī)材料、膜、多孔膜、微孔硅、半透膜、微孔材料、微孔聚合物、藻酸鹽、膠原、MATRIGEL、細(xì)胞、細(xì)胞材料、組織和組織片中的至少一種。
97.權(quán)利要求91的方法，進(jìn)一步包括將微型通透性材料定位于微孔表面之中、之上或附近。
98.權(quán)利要求91的方法，其中所述微型通透性材料模擬以下至少一種生物屏障，物質(zhì)在生物屏障中的通過(guò)或穿過(guò)，或者物質(zhì)在生物屏障中的、通過(guò)生物屏障的或被生物屏障的吸收。
99.權(quán)利要求91的方法，進(jìn)一步包括在微型通透性材料中、通過(guò)微型通透性材料或由微型通透性材料處理物質(zhì)。
100.權(quán)利要求99的方法，其中所述處理進(jìn)一步包括以下至少一種分子的吸收、提取、排泄、代謝和分配。
101.權(quán)利要求91的方法，進(jìn)一步包括將微型通透性材料定位于裝置的內(nèi)部或外部。
102.權(quán)利要求91的方法，進(jìn)一步包括提供至少一個(gè)與微型通透性材料連接的微流通道。
103.權(quán)利要求91的方法，其中與肝功能的至少一個(gè)特性有關(guān)的流體流動(dòng)的特性基于一種數(shù)學(xué)模型。
104.權(quán)利要求103的方法，其中所述數(shù)學(xué)模型是一種基于生理學(xué)的藥代動(dòng)力學(xué)(″PBPK″)模型。
105.權(quán)利要求91的方法，進(jìn)一步包括將微型通透性材料集成為芯片格式。
106.權(quán)利要求91的方法，進(jìn)一步包括提供吸收特性、代謝酶活性和/或表達(dá)水平。
107.權(quán)利要求91的方法，進(jìn)一步包括將生物材料定位于微型通透性材料之中、之上或靠近其兩側(cè)。
108.權(quán)利要求107的方法，其中位于微型通透性材料任一側(cè)上的生物材料為相同的類(lèi)型或不同的類(lèi)型。
109.權(quán)利要求91的方法，其中所述微型通透性材料包含能夠形成匯合單層的細(xì)胞系。
110.權(quán)利要求91的方法，其中所述結(jié)合包括提供選自下列至少一種的粘合劑蛋白質(zhì)、連接蛋白32、緊密連接蛋白、閉合蛋白、密蛋白-1、ZO-1、ZO-2、粘著連接蛋白、E-鈣粘蛋白、β-聯(lián)蛋白、細(xì)胞粘附分子和桑椹粘著蛋白。
111.權(quán)利要求91的方法，進(jìn)一步包括提供靠近微型通透性材料的第一側(cè)面的血液替代物流動(dòng)。
112.權(quán)利要求91的方法，進(jìn)一步包括提供靠近微型通透性材料的第二側(cè)面的膽汁替代物流動(dòng)。
113.一種形成裝置的方法，包括形成一種微型通透性材料，該微型通透性材料構(gòu)造為結(jié)合并且極化表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性的物質(zhì)。
114.一種微型設(shè)備，包括
將表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性的物質(zhì)以使該物質(zhì)極化的方式與微型通透性材料結(jié)合的設(shè)置。
115.一種裝置，包括
微型通透性材料；和
至少一種構(gòu)造為表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性的物質(zhì)，其中該物質(zhì)處理的分子被引導(dǎo)通過(guò)微型通透性材料的至少一部分。
116.一種方法，包括將物質(zhì)處理的分子引導(dǎo)通過(guò)微型通透性材料的至少一部分，其中該物質(zhì)設(shè)置為表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性。
117.一種形成裝置的方法，包括形成微型通透性材料，該微型通透性材料構(gòu)造為將物質(zhì)處理的分子引導(dǎo)通過(guò)微型通透性材料的至少一部分，其中該物質(zhì)設(shè)置為表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性。
118.一種裝置，包括將物質(zhì)處理的分子引導(dǎo)通過(guò)微型通透性材料的至少一部分的裝置，其中該物質(zhì)設(shè)置為表現(xiàn)出肝功能的至少一個(gè)特性。
全文摘要
公開(kāi)了用于微型藥代動(dòng)力學(xué)的系統(tǒng)和方法。各種器官和它們與藥物化合物的相互作用可以在體外用可通過(guò)微型通道相互連接的微型區(qū)室(3722、3734、3744)模擬。與這些器官有關(guān)的細(xì)胞或細(xì)胞材料可以在這些區(qū)室中培養(yǎng)，以允許它們與在一個(gè)或多個(gè)流體流中的藥物化合物相互作用。這樣的流體系統(tǒng)可以包括，例如，胃腸流、血流、膽汁流、尿流和腦液流。流體系統(tǒng)之間的相互作用可以用微型透性膜(3430)模擬。在一個(gè)實(shí)例中，血液-膽汁相互作用可以用具有通過(guò)粘合劑與通透性基板(3432)結(jié)合的肝細(xì)胞(3434)的微型通透性材料模擬。
文檔編號(hào)C12M3/06GK101223268SQ200680025975
公開(kāi)日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2006年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日
發(fā)明者G·T·巴克斯特, R·弗里德曼, A·辛, M·舒勒, S·邁耶斯, A·哈里森 申請(qǐng)人:康奈爾研究基金會(huì)(有限公司)