一種用于冬綠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于冬綠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物及方法，引物SSR引物為BOE353，所述BOE353的序列由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2組成，所述SEQ ID NO:1序列為：BOE353?F:5’?CGTCGGCTCATCTGCTA?3’；所述SEQ ID NO:2序列為：BOE353?R:5’?CCTCGCGACGCTTCTTCA?3’，同時公開一種鑒定方法。本發(fā)明的方法可將‘冬綠芥藍(lán)’雜交種子與其母本、父本種子區(qū)分開來，快速檢測出雜交種子的純度；具有快速、準(zhǔn)確、低成本，操作簡單等優(yōu)點，能夠替代傳統(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價值。
【專利說明】
-種用于冬綠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于冬綠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的 引物及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 種子質(zhì)量是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要元素，其質(zhì)量的優(yōu)劣程度直接影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和 產(chǎn)量。品種的純度和真?zhèn)舞b定是W形態(tài)學(xué)標(biāo)記為依據(jù)，運(yùn)種鑒定方法從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)角度具有 穩(wěn)定可靠的優(yōu)點，但從遺傳學(xué)角度看，品種的純度和真?zhèn)舞b定是實質(zhì)上是對品質(zhì)基因型的 鑒定，只有通過鑒定DNA分子本身才能準(zhǔn)確可靠的鑒定品種的基因型。DNA分子標(biāo)記技術(shù)是 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展而發(fā)展起來的一種新型的鑒定方法。它具有簡便、快速、準(zhǔn)確的特 點。目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)包括A化P，SRAP，SCAR，SSR等，SSR分子標(biāo)記分布廣泛，且具有 共顯性和高多態(tài)性等特征。加之甘藍(lán)(芥藍(lán)為甘藍(lán)的一個變種）已經(jīng)完成基因組測序，有足 夠的SSR標(biāo)記可W選擇。
[0003] 芥藍(lán)是起源于華南地區(qū)的一種特色葉菜，為甘藍(lán)的一個變種。有限的親本資源W 及雜交品種的不斷涌現(xiàn)，使得品種間尤其是雜交種子之間的遺傳差異越來越小，蔬菜種子 的真實性與品種純度鑒定也越來越難，加之冬綠芥藍(lán)是利用自交不親和配制而成的雜交一 代，在制種的過程中母本有少量的自交結(jié)實率，常常會出現(xiàn)假雜種，導(dǎo)致種子遺傳純度下 降，給生產(chǎn)造成巨大損失。
[0004] "冬綠芥藍(lán)"是W612罕為母本，61妨為父本育成的通過品種審定的雜交種。具有生 長勢強(qiáng)，產(chǎn)量高，抗病抗逆型強(qiáng)的特點。是華南地區(qū)推廣面積較多的品種。為了保證優(yōu)良品 種發(fā)產(chǎn)生最大的經(jīng)濟(jì)效益，因此一種快速、準(zhǔn)確、有效的品種鑒定方法非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于冬綠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物及方法，旨在 解決目前冬綠芥藍(lán)制種過程中，由于母本有少量的自交結(jié)實率，常常會出現(xiàn)假雜種，導(dǎo)致種 子遺傳純度下降，給生產(chǎn)造成巨大損失的問題。
[0006] 本發(fā)明是運(yùn)樣實現(xiàn)的，一種用于冬綠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物，該用于冬綠 芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物為SSR引物，所述SSR引物為B0E353,所述B0E353的序列由SEQ ID N0:1 和沈Q ID N0:2組成，所述沈Q ID N0:1 序列為：B0E353-F:5'-CGTCGGCTCATCTGCTA- 3'；所述SEQ ID N0:2序列為:B0E353-R:5'-CCTCGCGACGCTTCTTCA-3'。
[0007] 本發(fā)明另一目的在于提供一種冬綠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法，該冬綠芥藍(lán)雜 交種子純度的鑒定方法包括W下步驟：
[000引（1)提取芥藍(lán)幼苗基因組DNA;
[0009] (2似芥藍(lán)基因組DNA為模板，使用SSR引物B0E353進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0010] (3)對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；
[0011] (4)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，只有同時具有親本特異性條帶的單株才為真正的雜交 種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種，計算種子純度，計算方法為：
[001^ SSR鑒定雜交種比率（％ )=(雜交種帶數(shù)/總帶數(shù)）X 100%，
[0013] 其中，SSR引物B0E353產(chǎn)生208bp的母本特異標(biāo)記，產(chǎn)生218bp的父本特異標(biāo)記。
[0014] 進(jìn)一步，PCR擴(kuò)增的20μ1 反應(yīng)體系為：基因組DNA 5ng，Mg2+0.15mmol · L-i，dNTP 0.2mmol · L-i，SSR引物0.25mmol · L-i，Taq酶0.2U。
[001日]進(jìn)一步，PCR擴(kuò)增的程序為:94°C預(yù)變性5min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C 延伸40s，35個循環(huán)后，72°C保持7min，然后置于4°C保存待檢測。
[0016] 進(jìn)一步，冬綠芥藍(lán)DNA的提取方法為：
[0017] ①用液氮在2ml的離屯、管內(nèi)用研巧研磨，在液氮快蒸發(fā)干時迅速加入1000μ12% CTAB提取緩沖液，混勻后置于65°C水浴中溫浴50min，每隔5min搖動一次；
[0018] ②靜置至室溫后在4°C下，12000巧m離屯、lOmin，將上清80化1轉(zhuǎn)移到新的2ml離屯、 管；
[0019] ③加入等體積的酪:氯仿：異戊醇= 25:24:1，顛倒混勻，靜置3分鐘-5分鐘，在4Γ 下，12000巧m離屯、lOmin，上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml離屯、管中；
[0020] ④加2Λ體積％〇μ1預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，緩慢顛倒20次，置于一20°C下培養(yǎng) 30min;
[0021 ] ⑤在4°C下，13000rpm離屯、lOmin，棄上清，加入200μ1-300μ1預(yù)冷的70 %乙醇洗涂 DNA沉淀，洗涂兩次，微干；
[0022] ⑥加入100μΙ無菌水溶解。
[0023] 進(jìn)一步，所述凝膠電泳為:擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直非變性濃度為8%的聚丙締酷胺凝膠 上電泳，120V穩(wěn)壓1.5個小時，電泳結(jié)束后進(jìn)行0.1%AgM)3銀染15min;銀染后用2%化0Η、 0.4%甲醒、0.04%Na2〇)3顯色，顯色后在燈箱上拍照分析。
[0024] 本發(fā)明可將'冬綠芥藍(lán)'雜交種子與其母本、父本種子區(qū)分開來，快速檢測出雜交 種子的純度。本方法具有快速、準(zhǔn)確、低成本，操作簡單等優(yōu)點，能夠替代傳統(tǒng)雜交種子純度 鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明實施例提供的冬綠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法流程圖；
[0026] 圖2是本發(fā)明實施例提供的為引物B0E353'冬綠芥藍(lán)'種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙 締酷胺凝膠電泳圖譜；
[0027] 圖中：P1:為母本A-2; P2:為父本C-8 :F1為雜交一代種子；
[0028] 圖3是本發(fā)明實施例提供的提取單株DNA進(jìn)行檢測圖。
【具體實施方式】
[0029] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，W下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0030] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0031] 本發(fā)明實施例額用于冬綠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物，該用于冬綠芥藍(lán)雜交種 子純度鑒定的引物為SSR引物，所述SSR引物為B0E353,所述B0E353的序列由SEQ ID N0:1和 569 10^:2組成，所述569 10^:1序列為：806353斗：5'-〔61'〔66(：1^41'圳6(：了4-3'；所述 沈Q ID N0:2序列為：B0E353-R:5'-CCTCGCGACGCTTCTTCA-3'。
[0032] (B0E353)母本沈Q ID備:3序列為：
[00；33] CATTATCAGAGCAGAGAGAGAGAAGAAGAAGAAGATTCCGATTTGTTGTAGCCATGTCTCTGAGACCCA ACGCCAGGACCGAGGTTCGCCGTAACCGCTACAAAGTGGCGGTGGACGCAGAGGAAGGACGCAGGAGGAGAGAAGAC AACATGGTGGAGATCCGCAAGACCAAGCGTGAAGAGAGCTTGCTGAAGAAGCGTCGCGAGGA
[0034] (B0E353)父本沈Q ID備:4序列為：
[0035] TATCGACTCGAGCAGAGAGAGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGATTCCGATTTGTTGTAGCCATGTCTCTGAGACC CAACGCCAGGACCGAGGTTCGCCGTAACCGCTACAAAGTGGCGGTGGACGCAGAGGAAGGACGCAGGAGGAGAGAAG ACAACATGGTGGAGATCCGCAAGACCAAGCGTGAAGAGAGCTTGCTGAAGAAGCGTCGCGAGGAo
[0036] 如圖1所示:一種冬綠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法，該冬綠芥藍(lán)雜交種子純度的 鑒定方法包括W下步驟：
[0037] S101:提取芥藍(lán)幼苗基因組DNA;
[0038] S102: W芥藍(lán)基因組DNA為模板，使用SSR引物B0E353進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0039] S103:對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；
[0040] S104:對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，只有同時具有親本特異性條帶的單株才為真正的雜 交種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種，計算種子純度，其中，SSR引物B0E353產(chǎn)生208bp 的母本特異標(biāo)記，產(chǎn)生218bp的父本特異標(biāo)記，種子純度計算方法為：SSR鑒定雜交種比率 (%)=(雜交種帶數(shù)/總帶數(shù)）X 100%。
[0041] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0042] 實施例1
[0043] '冬綠芥藍(lán)'雜交種子純度檢測方法的建立。
[0044] 1、篩選純度鑒定的SSR引物。
[0045] 從所公布的甘藍(lán)SSR引物及EST-SSR引物在雙親間進(jìn)行篩選，選出共顯性差異標(biāo)記 條帶的1對引物序列如下所示：
[0046] B0E353-F:5'-CGTCGGCTCATCTGCTA-3'（沈Q ID N0:1)
[0047] B0E353-R:5'-CCTCGCGACGCTTCTTCA-3'（沈Q ID N0:2)
[004引標(biāo)記帶型清晰、重復(fù)性好。引物能產(chǎn)生的母本特異性標(biāo)記和的父本特異性標(biāo)記。
[0049] 2、利用上述特異性引物對'冬綠芥藍(lán)'雜交種子進(jìn)行純度鑒定。
[0050] (1)芥藍(lán)DNA的提取
[0051] 實驗材料為'冬綠芥藍(lán)'商品種及其母本、父本苗期幼葉DNA。步驟如下：
[0052] ①用液氮在2ml的離屯、管內(nèi)用研巧研磨，在液氮快蒸發(fā)干時迅速加入1000μ12% CTAB提取緩沖液，混勻后置于65°C水浴中溫浴50min(每隔5min搖動一次）。
[0化3] ②靜置至室溫后在4°C下1200化pm離屯、lOmin，將上清（約80化1)轉(zhuǎn)移到新的2ml離 屯、管。
[0054]③加入等體積的酪：氯仿：異戊醇（25 :24:1 )，顛倒混勻，靜置3-5分鐘，在4°C下 12000巧m離屯、lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml離屯、管中。
[0055]④加2Λ體積340μ1預(yù)冷的異丙醇，緩慢纔勻（緩慢顛倒20次），置于一2(TC下培養(yǎng) 30min〇
[0056] ⑤在4°C下13000rpm離屯、lOmin，棄上清，加入200-300μ1預(yù)冷的70 %乙醇洗涂DNA 沉淀(兩次），微干。
[0化7] ⑥加入10化1無菌水溶解。
[0化引（2)SSR-PCR 擴(kuò)增：
[0化9] PCR 體系（20μ1)
[0060] DM 模板：5ng
[0061] 引物-F:0.25mmol · L-i
[0062] 引物-R:〇.25mmol · L-i
[0063] dNTP:0.2mmol · 1^-1
[0064] Mg2+:0.15mmol · [1
[00化]l〇XP〇?buffe:2.0yl
[0066] Taq酶:0.2U
[0067] dd 出 0 補(bǔ)足至 20μ1
[006引 PCR擴(kuò)增程序
[0069] 94°C 預(yù)變性 5min 后，94°C 變性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 4〇3,35個循環(huán)后，721： 保持7min，然后置于4°C保存待檢測。
[0070] (3)凝膠電泳
[0071] 擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直非變性濃度為8%的聚丙締酷胺凝膠上電泳，120V穩(wěn)壓1.5個小 時，電泳結(jié)束后進(jìn)行0.1 %AgN〇3銀染15min;銀染后用2%化0H、0.4%甲醒、0.04%化2C〇3顯 色，顯色后在燈箱上拍照分析。
[0072] (4)擴(kuò)增結(jié)果
[0073] 兩種引物在'冬綠芥藍(lán)'父母本及雜交一代種子分別能擴(kuò)增出兩條特異帶；其中 BOE353引物母本pi擴(kuò)增出的a條帶，母本p2號擴(kuò)增出b的條帶，見圖2;
[0074] 回收特異條帶，送上海生物工程有限公司測序。條帶的序列如SEQ ID NO: 1-2所 示，雜交種子中與父本、母本擴(kuò)增產(chǎn)物的序列相符。
[00巧]實施例2
[0076] 采用實施例1的方法對從白云基地的種子純度鑒定田取的50株'冬綠芥藍(lán)'，對其 單株編號，提取單株DNA進(jìn)行檢測（見圖3)，檢測結(jié)果兩個引物檢測結(jié)果一致，種子純度為 98%，與田間調(diào)查結(jié)果一致，準(zhǔn)確率為100%。
[0077] 圖3中：42株冬綠芥藍(lán)DNA，第一孔是Marker，a母本，b父本，1-42為1-42個單株，其 中41為假雜種。
[0078] W上實施例表明，本發(fā)明的方法可將'冬綠芥藍(lán)'雜交種子與其父母本種子進(jìn)行有 效區(qū)分，快速、準(zhǔn)確檢測出種子純度。并且選取任何一個引物均能準(zhǔn)確鑒別。
[0079] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0080]
【主權(quán)項】
1. 一種用于冬綠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物，其特征在于，該用于冬綠芥藍(lán)雜交種 子純度鑒定的引物為SSR引物，所述SSR引物為B0E353,所述B0E353的序列由SEQ ID N0:1和 SEQIDN0:2組成； 所述SEQIDN0:1序列為：B0E353-F:5'-CGTCGGCTCATCTGCTA-3'；所述SEQIDN0:2序 列為：B0E353-R: 5 ' -CCTCGCGACGCTTCTTCA-3 '。2. -種利用權(quán)利要求1所述用于冬綠芥藍(lán)雜交種子純度鑒定的引物進(jìn)行冬綠芥藍(lán)雜交 種子純度的鑒定方法，其特征在于，所述進(jìn)行冬綠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法包括以下 步驟： (1) 提取冬綠芥藍(lán)幼苗基因組DNA; (2) 以冬綠芥藍(lán)基因組DNA為模板，使用SSR引物B0E353進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3) 對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳； (4) 對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，只有同時具有親本特異性條帶的單株才為真正的雜交種，缺 少任意一條帶記為假雜種，計算種子純度，其中，SSR引物B0E353產(chǎn)生208bp的母本特異標(biāo) 記，產(chǎn)生218bp的父本特異標(biāo)記。3. 如根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增的20μ1反應(yīng)體系為：基因組DNA 5ng，Mg2+0.15mmol · L-SdNTP 0.2mmol · L-'SSR引物0.25mmol · L-^Taq酶0.2U。4. 如權(quán)利要求2所述的冬綠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增的程 序為:94°C預(yù)變性5min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，35個循環(huán)后，72°C保持 7min，然后置于4°C保存待檢測。5. 如權(quán)利要求2所述的冬綠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法，其特征在于，冬綠芥藍(lán)DNA 的提取方法為： ① 用液氮在2ml的離心管內(nèi)用研杵研磨，在液氮快蒸發(fā)干時迅速加入1000yl2%CTAB提 取緩沖液，混勻后置于65 °C水浴中溫浴50min，每隔5min搖動一次； ② 靜置至室溫后在4°C下，12000rpm離心10min，將上清800μ1轉(zhuǎn)移到新的2ml離心管； ③ 加入等體積的酚:氯仿：異戊醇= 25: 24:1，顛倒混勻，靜置3分鐘-5分鐘，在4°C下， 12000rpm離心10min，上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中； ④ 加2/3體積340μ1預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，緩慢顛倒20次，置于一 20°C下培養(yǎng)30min; ?在4<€下，13000印111離心10111；[11，棄上清，加入20(^1-30(^1預(yù)冷的70%乙醇洗滌0嫩沉 淀，洗滌兩次，微干； ⑥加入100μΙ無菌水溶解。6. 如權(quán)利要求2所述的冬綠芥藍(lán)雜交種子純度的鑒定方法，其特征在于，所述凝膠電泳 為:擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直非變性濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，120V穩(wěn)壓1.5個小時，電 泳結(jié)束后進(jìn)行0.1%AgN0 3銀染15min;銀染后用2%Na0H、0.4%甲醛、0.04%Na2C03顯色，顯 色后在燈箱上拍照分析。
【文檔編號】C12N15/11GK106011283SQ201610579940
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月21日
【發(fā)明人】李桂花, 陳漢才, 王亭亭, 黎庭耀, 張艷
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所