一種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的引物、探針、方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的引物、探針、方法及試劑盒，采用Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR法，分別針對(duì)16S rDNA、vanA、vanB核酸保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記探針，3個(gè)基因探針5’端均標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端均標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。引物、探針配成PCR檢測(cè)混合液后，加入酶與樣本核酸，選用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)目的基因的檢測(cè)。本試劑盒具有準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠?qū)δ蛞簶颖局械哪c球菌和VRE進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】
一種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的引物、探針、方法及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的引 物、探針、方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 耐萬(wàn)古霉素腸球菌（Vancomycin-Resistant Enterococcus spp.，VRE)能引起尿 路、腹腔、盆腔、外科手術(shù)感染及心內(nèi)膜炎、腦膜炎等疾病，病死率達(dá)到21.0%~27.5%，是 全球范圍內(nèi)主要的醫(yī)院條件致病菌。其中，對(duì)人類致病的主要為奠腸球菌(Enterococcus faecal is)和屎腸球菌(Enterococcus faecium)，最常見(jiàn)的耐藥基因型為vanA和vanB。腸球 菌作為常見(jiàn)院內(nèi)感染多重耐藥菌，對(duì)頭孢菌素類、部分氟喹諾酮類、氨基糖苷類等多種抗菌 藥物天然耐藥。耐萬(wàn)古霉素腸球菌能將其耐藥基因轉(zhuǎn)移到其它病原微生物。因此，對(duì)人類構(gòu) 成嚴(yán)重威脅的不僅是VRE本身，還包括其耐藥基因轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的一些難以治療的新耐藥菌 株。因此，加強(qiáng)VRE檢測(cè)不僅有利于指導(dǎo)臨床用藥，而且有利于VRE抗性轉(zhuǎn)移的檢測(cè)和控制。
[0003] 目前臨床上VRE主要通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定加藥敏試驗(yàn)的方法檢測(cè)，這種檢測(cè)方法不 僅操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、靈敏度較低，重復(fù)性差，傳統(tǒng)方法難以區(qū)分不同的基因型，而且無(wú)法 了解抗性引起的分子生物學(xué)機(jī)制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的引物、探針、方法及試劑盒，解決現(xiàn) 有技術(shù)中VRE的檢測(cè)不僅操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、靈敏度較低，重復(fù)性差，傳統(tǒng)方法難以區(qū)分不 同的基因型，而且無(wú)法了解抗性引起的分子生物學(xué)機(jī)制的技術(shù)問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 一種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的引物和探針，檢測(cè)腸球菌基因 16S rDNA的引物 核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，檢測(cè)腸球菌基因 16S rDNA的Taqman探針的核苷酸序列如 SEQIDN0:4所示;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~ 7所不，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球囷特異性基因 vanA的Taqman探針的核甘酸序列如SEQIDN0:8所 示;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10~11所示，檢 測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示。
[0007] -種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的方法，包括：
[0008] 樣本核酸制備，以獲得核酸模板；
[0009] 分別針對(duì)腸球菌基因16S rDNA、耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA、耐萬(wàn)古霉素 腸球菌特異性基因 vanB設(shè)計(jì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針，其中，檢測(cè)腸球菌基因16S rDNA 的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，檢測(cè)腸球菌基因16S rDNA的Taqman探針的核苷酸 序列如SEQIDN0: 4所示；檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA的引物核苷酸序列如 SEQIDN0:6~7所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA的Taqman探針的核苷酸序列如 SEQIDN0:8所示;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10 ~11所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 12所示；
[0010]取尿液樣本、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品置于離心管中，分別加入核酸抽提液充分混 勻，并進(jìn)行加熱和離心處理，取上清液用于熒光PCR檢測(cè)；
[0011 ] 配置酶試劑，其中，所述酶由水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿啼啶-N-糖基化酶 (UNG酶)混合組成；
[0012] 將16S rDNA基因 PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勾，進(jìn)行離心處理；將vanA基因 PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理;將vanB基因 PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震 蕩混勻，進(jìn)行離心處理
[0013] 分別取加酶混勻后的PCR檢測(cè)混合液置于熒光PCR管中，取樣本核酸抽提上清液、 陰性對(duì)照品核酸抽提上清液、陽(yáng)性對(duì)照品核酸抽提上清液加入已有PCR檢測(cè)混合液的熒光 PCR管中，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:37°C X 2min，94°C X 2min，循環(huán)1次;93°C X 15s，60 °C X 60s，循環(huán)40次;單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60°C，并在此采集熒光信號(hào)。
[0014] 對(duì)于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò) 熒光定量PCR儀所收集數(shù)據(jù)確定檢測(cè)位點(diǎn)的基因型。
[0015] -種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的試劑盒，包括核酸抽提液、第一引物探針混合 液、第二引物探針混合液、第三引物探針混合液、PCR反應(yīng)酶系、陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品和 分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中，所述第一引物探針混合液由脫氧核糖核 苷三磷酸dN(U)TP、16S rDNA基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成;所述第二引物 探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanA基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針 組成;所述第三引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanB基因的上、下游引物 及一條熒光標(biāo)記探針組成；
[0016] 其中，檢測(cè)腸球菌基因 16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDN0: 2~3所示，檢測(cè)腸 球菌基因 16S rDNA的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌 特異性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基 因 vanA的Taqman探針的核甘酸序列如SEQIDN0:8所不;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球囷特異性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10~11所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的 Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示。
[0017]本發(fā)明的有益效果為:具有準(zhǔn)確率高，臨床試驗(yàn)結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果總符合率99 % 以上;特異性強(qiáng)，與尿液中常見(jiàn)致病菌大腸埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠 假單胞菌、變形桿菌、奇異變形桿菌、血鏈球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、 洋蔥伯克霍爾德菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、白喉?xiàng)U菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟 菌均無(wú)交叉反應(yīng);靈敏度高，按照質(zhì)粒拷貝數(shù)確定的最低檢測(cè)限為10 3copies/mL，按照菌培 養(yǎng)法確定的最低檢測(cè)限為103CFU/mL。本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)人尿液樣本中腸球菌基因 16S rDNA和耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA和vanB，為臨床確定腸球菌和VRE感染提供 輔助診斷方法，為臨床醫(yī)生用藥提供參考。
【附圖說(shuō)明】
[0018]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所 需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施 例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可根據(jù)這些附圖獲 得其他的附圖。
[0019] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例四的腸球菌感染樣本的熒光定量PCR曲線圖；
[0020] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例四的vanA型VRE感染樣本的熒光定量PCR曲線圖；
[0021 ]圖3為本發(fā)明實(shí)施例四的vanB型VRE感染樣本的熒光定量PCR曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實(shí) 施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0023] 實(shí)施例一
[0024]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的引物和探針，檢測(cè)腸球菌 基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，檢測(cè)腸球菌基因16S rDNA的Taqman 探針的核昔酸序列如SEQIDN0:4所不;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA的引物核昔 酸序列如SEQIDN0:6~7所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA的Taqman探針的核苷 酸序列如SEQIDN0:8所示；檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的引物核苷酸序列如 SEQIDN0:10~11所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的Taqman探針的核苷酸序列 如 SEQIDN0:12所示；
[0025]其中，16S rDNA基因設(shè)計(jì)的特異性引物的序列如下：
[0026] 上游引物P-16S rDNA-F:5'-CGCTAGACCGCGAGGTCAT-3'
[0027] 下游引物P-16S rDNA-R:5'-ACTAGCGATTCCGGCTTCAT-3'
[0028] 針對(duì)16S rDNA基因的TaqMan熒光標(biāo)記探針序列如下：
[0029] T-16SrDNA:5 '-FAM-CAAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCG-TAMRA-3 '
[0030] 針對(duì)vanA基因設(shè)計(jì)的特異性引物的序列如下：
[0031 ]上游引物 P-VanA-F: 5 ' -AGTGCCGCGTTAGCTGTTG-3 '
[0032] 下游引物P-VanA-R: 5 ' -GCGTTTTCAGAGCCTTTTTCC-3 '
[0033] 針對(duì)vanA基因的TaqMan焚光標(biāo)記探針序列如下：
[0034] T-vanA:5 '-FAM-ATCAGGCTGCAGTACGGAATCTTTCGTA-TAMRA-3 '
[0035] vanB基因設(shè)計(jì)的特異性引物的序列如下：
[0036] 上游引物 P-VanB-F: 5 ' -CGTTTAGTTCTTCCGTACT-3 '
[0037] 下游引物P-VanB-R: 5 ' -GAGGACGCTTACCTACCCT-3 '
[0038] 針對(duì)vanB基因的TaqMan焚光標(biāo)記探針序列如下：
[0039] T-vanB:5 '-FAM-TTACGCCAAAGGACGAACCTGACCGT-TAMRA-3 '
[0040] 16S rDNA、vanA、vanB基因探針的核苷酸序列5 '端均標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM， 3 '端均標(biāo)記的淬滅基團(tuán)為T(mén)AMRA。
[0041 ] 實(shí)施例二
[0042] 本發(fā)明實(shí)施例中又提供了一種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的方法，包括：
[0043] 步驟101、樣本核酸制備，以獲得核酸模板；
[0044] 步驟102、分別針對(duì)腸球菌基因16S rDNA、耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA、耐 萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB設(shè)計(jì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針；
[0045] 其中，檢測(cè)腸球菌基因 16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，檢測(cè)腸 球菌基因 16S rDNA的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌 特異性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基 因 vanA的Taqman探針的核甘酸序列如SEQIDN0:8所不;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球囷特異性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10~11所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的 Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示；
[0046] 步驟103、取陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品置于離心管中，分別加入核酸抽提液充分混 勻，并進(jìn)行加熱和離心處理，取上清液用于熒光PCR檢測(cè)；
[0047] 步驟104、配置酶試劑；
[0048] 其中，所述酶由水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合 組成；
[0049] 步驟105、將16S rDNA基因 PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理；將 vanA基因 PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理;將vanB基因 PCR檢測(cè)混合液與 酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理；
[0050]步驟106、分別取加酶混勻后的PCR檢測(cè)混合液置于熒光PCR管中，取樣本核酸抽提 上清液、陰性對(duì)照品核酸抽提上清液、陽(yáng)性對(duì)照品核酸抽提上清液加入已有PCR檢測(cè)混合液 的熒光PCR管中，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增；
[0051 ]其中，反應(yīng)條件為：37°C X 2min，94°C X 2min，循環(huán) 1 次；93 °C X 15s，60°C X 60s，循 環(huán)40次;單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60°C，并在此采集熒光信號(hào)；
[0052] 步驟107、對(duì)于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò) 增，通過(guò)熒光定量PCR儀所收集數(shù)據(jù)確定檢測(cè)位點(diǎn)的基因型。
[0053] 其中，檢測(cè)結(jié)果根據(jù)Ct值進(jìn)行判定，儀器Ct欄顯示Undet. (ABI StepOnePlus)或不 顯示Ct值(Eppendorf Mastercycler ep realplex焚光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)），表示檢測(cè)樣品 低于檢測(cè)限，報(bào)告為陰性;待檢樣品CT<35,檢測(cè)結(jié)果報(bào)告為陽(yáng)性;待檢樣品C T顯示在35~40 之間，需重復(fù)測(cè)定，CT顯示仍在35~40之間，且擴(kuò)增曲線呈S型，則判斷為陽(yáng)性;若擴(kuò)增結(jié)果 為一直線，則判斷為陰性。
[0054] 本發(fā)明采用Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR法，在同源性比對(duì)腸球菌屬16S rDNA、耐萬(wàn)古 霉素 vanA和vanB基因序列的基礎(chǔ)上，選取保守片段分別設(shè)計(jì)針對(duì)這3個(gè)基因的特異性引物 和特異性的熒光標(biāo)記探針。探針5'端標(biāo)記FAM熒光素為熒光報(bào)告基團(tuán)（用R表示），3'端標(biāo)記 TAMRA熒光素為熒光淬滅基團(tuán)（用Q表示），它在近距離內(nèi)能吸收5 '端熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒 光信號(hào)。PCR反應(yīng)進(jìn)入退火階段時(shí)，探針先與模板上的目的基因結(jié)合，隨后引物與目的基因 結(jié)合，此時(shí)探針上R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行 到延伸階段時(shí)，Taq DNA聚合酶的5'-3'的外切核酸酶功能將探針降解。這樣探針上的R基 團(tuán)游離出來(lái)，所發(fā)出的的熒光信號(hào)沒(méi)被Q基團(tuán)吸收，檢測(cè)器能檢測(cè)到熒光信號(hào)。隨著PCR反應(yīng) 的進(jìn)行，PCR產(chǎn)物與熒光信號(hào)的增長(zhǎng)呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系。通過(guò)熒光信號(hào)增長(zhǎng)曲線，實(shí)現(xiàn)目的基因 的檢測(cè)。
[0055] 實(shí)施例三
[0056]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的試劑盒，包括核酸抽提 液、第一引物探針混合液、第二引物探針混合液、第三引物探針混合液、PCR反應(yīng)酶系、陰性 對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品和分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中，所述第一引物探針 混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、16S rDNA基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針 組成;所述第二引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanA基因的上、下游引物 及一條熒光標(biāo)記探針組成;所述第三引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanB 基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成；
[0057] 其中，檢測(cè)腸球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，檢測(cè)腸 球菌基因16S rDNA的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌 特異性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基 因 vanA的Taqman探針的核甘酸序列如SEQIDN0:8所不;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球囷特異性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10~11所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的 Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示。
[0058] 所述核酸抽提液由3%(M/V)Chelex-100、0.5%(V/V)Tris-HCl，lM，pH9.0 和0.5% (V/V)TritonX-100 組成。
[0059] 所述第一引物探針混合液由4yL 10XPCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN(U)TP、2.4yL ΙΟμ mol/L引物、0.4yL ΙΟμ mol/L探針和 18.2yL滅菌純化水組 成；第二引物探針混合液由4yL 10XPCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN (U)TP、1.2yL ΙΟμ mol/L引物、0.2yL ΙΟμ mol/L探針和20.9yL滅菌純化水組成;第三引物探 針混合液由4yL 10XPCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN(U)TP、1.2yL ΙΟμ mol/L引物、0.6yL ΙΟμ mol/L探針和20.4yL滅菌純化水組成。
[0060] PCR反應(yīng)酶系由5U/yL Taq DNA聚合酶和2U/yL UNG酶按體積比3:1比例混合組成。
[0061] PCR擴(kuò)增的條件為：37°C X2min，94°C X2min，循環(huán) 1 次；93°C X 15s，60°C X60s，循 環(huán)40次;單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60°C，對(duì)于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用熒光PCR儀上的FAM 通道進(jìn)行擴(kuò)增。
[0062] 所述陽(yáng)性對(duì)照品為含有滅活的E-16S rDNA菌、E-vanA菌和E-vanB菌的混合液，菌 濃度為106CFU/mL;陰性對(duì)照品為含有滅活的大腸桿菌溶液，菌濃度為106CFU/mL，其中，E-16S rDNA菌為含有16S rDNA基因片段的工程菌，E-vanA菌為含有vanA基因片段的工程菌， E-vanB菌為含有vanB基因片段的工程菌。
[0063]本試劑盒具有準(zhǔn)確率高，臨床試驗(yàn)結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果總符合率99%以上;特異性 強(qiáng)，與尿液中常見(jiàn)致病菌大腸埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、變 形桿菌、奇異變形桿菌、血鏈球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、洋蔥伯克霍 爾德菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、白喉?xiàng)U菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌均無(wú)交叉 反應(yīng);靈敏度高，按照質(zhì)?？截悢?shù)確定的最低檢測(cè)限為1 〇3cop i e s/mL，按照菌培養(yǎng)法確定的 最低檢測(cè)限為103CFU/mL。本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)人尿液樣本中腸球菌基因16S rDNA和 耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA和vanB，為臨床確定腸球菌和VRE感染提供輔助診斷方 法，為臨床醫(yī)生用藥提供參考。
[0064] 實(shí)施例四
[0065]本實(shí)施例結(jié)合具體檢測(cè)案例說(shuō)明本發(fā)明的具體應(yīng)用方式，首先收集臨床樣本，經(jīng) 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定與藥敏試驗(yàn)法結(jié)合DNA測(cè)序確定為腸球菌感染、vanA型VRE感染、vanB型VRE感 染及VRE陰性樣本各3例，采用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果符合率。
[0066] 1、樣本核酸制備
[0067] 尿液:取樣本3mL，12，OOOrpm 2min;棄上清，沉淀中直接加入50yL核酸抽提液，充 分混勾，98°C lOmin(誤差不超過(guò)lminhl^jOOrpm 5min，取上清5μΙ^ι^ΡΟ?反應(yīng)。
[0068] 2、對(duì)照品準(zhǔn)備
[0069] 取陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品各100yL分別置于1.5mL(或0.5mL)離心管中（凍存試劑 融解后震蕩混勻10 S)，分別加入核酸抽提液5 OyL充分混勻，9 8 °C 1 Om i η，然后12，0 0 Or pm 5min，取上清5yL做PCR反應(yīng)。
[0070] 3、酶試劑配制
[0071] 分別取nX35yL腸球菌16S核糖體DNA(16S rDNA)PCR檢測(cè)混合液，耐萬(wàn)古霉素腸球 菌A基因（vanA) PCR檢測(cè)混合液，耐萬(wàn)古霉素腸球菌B基因（vanB) PCR檢測(cè)混合液與η X 0.4yL 酶(Taq+UNG)混合，震蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心混勻數(shù)秒。
[0072] 4、加樣
[0073]分別取上述混合液35yL置于PCR管中，然后將陰性對(duì)照品、樣本和陽(yáng)性對(duì)照品的處 理上清液各5yL分別加入各個(gè)已有混合液的PCR管中，蓋好管蓋，立即進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反 應(yīng)。
[0074] 5、PCR 擴(kuò)增
[0075] 反應(yīng)管置于熒光PCR儀上，推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
[0076] 37°C X2min，94°C X2min，循環(huán) 1 次；93°C X15sec，60°C X60s，循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光 檢測(cè)在60°C，反應(yīng)體系為40yL。
[0077] 熒光通道檢測(cè)選擇:選用FAM通道。
[0078] 6、結(jié)果判定
[0079] 檢測(cè)結(jié)束后，基線調(diào)整取6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超 過(guò)陰性對(duì)照品檢測(cè)熒光曲線的最高點(diǎn)。儀器C T欄顯示Undet.(ABI StepOnePlus)或不顯示CT 值(Eppendorf Mastercycler ep realplex)焚光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)），表示檢測(cè)樣品低于檢 測(cè)限，報(bào)告為陰性;待檢樣品CT<35,檢測(cè)結(jié)果報(bào)告為陽(yáng)性;待檢樣品C T顯示在35~40之間， 需重復(fù)測(cè)定，CT顯示仍在35~40之間，且擴(kuò)增曲線呈S型，則判斷為陽(yáng)性;若擴(kuò)增結(jié)果為一直 線，則判斷為陰性。
[0080] 7、檢測(cè)結(jié)果檢驗(yàn)
[0081]本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)鑒定與藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，熒光PCR檢測(cè)結(jié)果如圖 1-3所示，圖1為腸球菌感染樣本的熒光定量PCR曲線圖，可見(jiàn)隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，16S rDNA 基因?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物與熒光信號(hào)的增長(zhǎng)呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，可判斷16S rDNA基因?yàn)殛?yáng)性，vanB基 因和vanA基因?yàn)殛幮?。圖2為vanA型VRE感染樣本的熒光定量PCR曲線圖，可判斷16S rDNA基 因和vanA基因均為陽(yáng)性。圖3為vanB型VRE感染樣本的熒光定量PCR曲線圖，可判斷16S rDNA 基因和vanB基因均為陽(yáng)性。
[0082]以上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方 式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì) 于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在【具體實(shí)施方式】及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變 之處，綜上所述，本說(shuō)明書(shū)內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的引物和探針，其特征在于，檢測(cè)腸球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示，檢測(cè)腸球菌基因16S rDNA的Taqman探針的核 苷酸序列如SEQIDNO: 4所示;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA的引物核苷酸序列如 SEQIDNO: 6~7所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA的Taqman探針的核苷酸序列如 SEQIDN0:8所示;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDN0:10 ~11所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 VanB的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0: 12所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的引物和探針，其特征在于，16S rDNA、vanA、vanB基因探針的核苷酸序列5 '端均標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3 '端均標(biāo)記的 淬滅基團(tuán)為T(mén)AMRA。3. -種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的方法，其特征在于，包括： 樣本核酸制備，以獲得核酸模板； 分別針對(duì)腸球菌基因16S rDNA、耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA、耐萬(wàn)古霉素腸球 菌特異性基因 vanB設(shè)計(jì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針，其中，檢測(cè)腸球菌基因16S rDNA的引 物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，檢測(cè)腸球菌基因16S rDNA的Taqman探針的核苷酸序列 如SEQIDNO: 4所示;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 6 ~7所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 8 所示;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 10~11所示， 檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球囷特異性基因 vanB的Taqman探針的核甘酸序列如SEQIDNO: 12所不； 取陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品置于離心管中，分別加入核酸抽提液充分混勻，并進(jìn)行加熱 和離心處理，取上清液用于熒光PCR檢測(cè)； 配置酶試劑，其中，所述酶由水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG 酶)混合組成； 將16S rDNA基因 PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理;將vanA基因 PCR檢 測(cè)混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理;將vanB基因 PCR檢測(cè)混合液與酶試劑震蕩混 勻，進(jìn)行離心處理； 分別取加酶混勻后的PCR檢測(cè)混合液置于熒光PCR管中，取樣本核酸抽提上清液、陰性 對(duì)照品核酸抽提上清液、陽(yáng)性對(duì)照品核酸抽提上清液加入已有PCR檢測(cè)混合液的熒光PCR管 中，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：37 °C X 2min，94°C X 2min，循環(huán)1次;93 °C X 15s，60 °C X 60s，循環(huán)40次;單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60 °C，并在此采集熒光信號(hào)； 對(duì)于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)熒光 定量PCR儀所收集數(shù)據(jù)確定檢測(cè)位點(diǎn)的基因型。4. 一種檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的試劑盒，其特征在于，包括核酸抽提液、第一引物 探針混合液、第二引物探針混合液、第三引物探針混合液、PCR反應(yīng)酶系、陰性對(duì)照品、陽(yáng)性 對(duì)照品和分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中，所述第一引物探針混合液由脫 氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、16S rDNA基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成;所述 第二引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanA基因的上、下游引物及一條熒光 標(biāo)記探針組成;所述第三引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、vanB基因的上、 下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成； 其中，檢測(cè)腸球菌基因16S rDNA的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示，檢測(cè)腸球菌 基因16S rDNA的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異 性基因 vanA的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanA的Taqman探針的核甘酸序列如SEQIDNO: 8所不；檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球囷特異性基因 vanB的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 10~11所示，檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌特異性基因 vanB的 Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的試劑盒，其特征在于，所述核酸 抽提液由 3%(M/V)Chelex-100、0.5%(V/V)Tris-HCl，lM，pH9.(^P0.5%(V/V)TritonX-100 組成。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的試劑盒，其特征在于，所述第一 引物探針混合液由4yL 10XPCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN(U)TP、 2.4yL ΙΟμ mol/L引物、0.4yL ΙΟμ mol/L探針和18.2yL滅菌純化水組成；第二引物探針混合 液由4yL 10XPCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN(U)TP、1.2yL ΙΟμ mol/ L引物、0.2yL ΙΟμ mol/L探針和20.9yL滅菌純化水組成；第三引物探針混合液由4yL 10X PCR Buffer、4yL25mmol/LMgCl2、3.2yL 2.5mmol/L dN(U)TP、1.2yL lOymol/L引物、0.6yL ΙΟμ mol/L探針和20.4yL滅菌純化水組成。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的試劑盒，其特征在于，PCR反應(yīng) 酶系由5U/yL水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq酶)和2U/yL尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)按體積比3 :1比例混合組成。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的試劑盒，其特征在于，PCR擴(kuò)增 的條件為：371€\2111丨11，94 1€\2111丨11，循環(huán)1次；931€\158,601€\608，循環(huán)40次 ；單點(diǎn)熒光 檢測(cè)在60°C，對(duì)于16S rDNA基因、vanA、vanB基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò)增。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)耐萬(wàn)古霉素腸球菌基因的試劑盒，其特征在于，所述陽(yáng)性 對(duì)照品為含有滅活的E-16S rDNA菌、E-vanA菌和E-vanB菌的混合液，菌濃度為IO6CFlVmL; 陰性對(duì)照品為含有滅活的大腸桿菌溶液，菌濃度為10 6CFU/mL，其中，E-16S rDNA菌為含有 16S rDNA基因片段的工程菌，E-vanA菌為含有vanA基因片段的工程菌，E-vanB菌為含有 vanB基因片段的工程菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK105950773SQ201610539448
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月11日
【發(fā)明人】王偉建, 倪劍鋒, 包婷婷, 翁毅
【申請(qǐng)人】寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司, 王偉建