一種東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR分子標(biāo)記開發(fā)方法
【專利摘要】一種東鄉(xiāng)野生稻genic?SSR分子標(biāo)記開發(fā)方法，所述方法步驟為：東鄉(xiāng)野生稻Unigene?EST序列的獲得；東鄉(xiāng)野生稻SSR序列的識(shí)別；東鄉(xiāng)野生稻genic?SSR引物的設(shè)計(jì)；東鄉(xiāng)野生稻genic?SSR引物的有效性和通用性鑒定。本發(fā)明利用生物信息學(xué)方法從東鄉(xiāng)野生稻Unigene?EST序列中挖掘SSR位點(diǎn)，進(jìn)行g(shù)enic?SSR分子標(biāo)記的開發(fā)，克服了東鄉(xiāng)野生稻genic?SSR分子標(biāo)記獲取困難的問題；使用東鄉(xiāng)野生稻和不同品種的現(xiàn)代栽培稻對(duì)開發(fā)的genic?SSR引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果真實(shí)可靠；本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，獲得的分子標(biāo)記數(shù)量巨大，為東鄉(xiāng)野生稻的遺傳學(xué)研究及分子育種等奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】一種東鄉(xiāng)野生賴gen i c-SSR分子標(biāo)巧開發(fā)方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR分子標(biāo)記開發(fā) 方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 長(zhǎng)期W來，由于育種者片面地追求高產(chǎn)及品種推廣的單一化，導(dǎo)致現(xiàn)代栽培稻遺 傳多樣性顯著降低。水稻野生資源處于自然生長(zhǎng)狀態(tài)，蘊(yùn)藏著豐富的基因資源和遺傳多樣 性，是水稻改良極其寶貴的遺傳資源。東鄉(xiāng)野生稻起源于江西省東鄉(xiāng)縣(28°14'），是迄今發(fā) 現(xiàn)的中國(guó)乃至全球分布最北的普通野生稻，富含眾多優(yōu)異特性(如高產(chǎn)、胞質(zhì)不育、育性恢 復(fù)、強(qiáng)分葉等)和豐富的抗逆特性(如耐冷、耐旱、抗病、抗蟲等），利用東鄉(xiāng)野生稻優(yōu)異基因 資源改良栽培稻是水稻育種有效途徑。
[0004] 然而，將野生稻優(yōu)異基因轉(zhuǎn)移到栽培稻培育新品種往往需要耗費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間。此 夕h由于野生稻的優(yōu)異基因常與不利基因緊密連鎖，使得育種過程具有較大困難。DNA分子 標(biāo)記可W大大加快育種進(jìn)程，并且可W定位優(yōu)異基因的染色體位置，分離優(yōu)異基因，降低育 種難度。在已發(fā)明的DNA分子標(biāo)記中，SSR(simple sequence repeat,簡(jiǎn)單重復(fù)序列）分子標(biāo) 記被認(rèn)為是最有效和最理想的DNA分子標(biāo)記，具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如共顯性遺傳、豐富的基因 組多態(tài)性、高重復(fù)性和多等位性等。此外，SSR分子標(biāo)記只需要簡(jiǎn)單和廉價(jià)的PCR(聚合酶鏈 式反應(yīng))擴(kuò)增，其產(chǎn)物多態(tài)性通常可W通過瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)。
[0005] 依據(jù)SSR分子標(biāo)記在基因組中的位置，可W將其分為兩種基本類型，即genomic- SSR分子標(biāo)記和genic-SSR分子標(biāo)記。與genomic-SSR分子標(biāo)記相比，genic-SSR分子標(biāo)記位 于基因的編碼區(qū)，具有信息量大和通用性好等優(yōu)點(diǎn)。近幾年，隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)快速發(fā) 展，使得針對(duì)沒有全基因組參考序列的物種，開發(fā)大規(guī)模genic-SSR分子標(biāo)記成為可能。
[0006] 迄今為止，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已有大量genic-SSR分子標(biāo)記在許多物種中被開 發(fā)和利用，例如蘿l·、亞麻巧、梨、金錢械等。然而，利用東鄉(xiāng)野生稻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)genic- SSR分子標(biāo)記尚未見報(bào)道，同時(shí)，目前東鄉(xiāng)野生稻可用的genic-SSR分子標(biāo)記也十分有限。因 此，利用東鄉(xiāng)野生稻轉(zhuǎn)錄組序列信息，批量開發(fā)genic-SSR分子標(biāo)記，將會(huì)對(duì)東鄉(xiāng)野生稻種 質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性、優(yōu)異性狀基因定位及分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面起重要推動(dòng) 作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR分子標(biāo)記的開發(fā)方法，通過網(wǎng) 絡(luò)數(shù)據(jù)庫下載轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法獲得東鄉(xiāng)野生稻化igene-EST序列，發(fā) 掘SSR位點(diǎn)，開發(fā)引物，構(gòu)建東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR分子標(biāo)記體系。
[000引本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR分子標(biāo)記開發(fā)方法步驟為： 1)東鄉(xiāng)野生稻化igene-EST序列的獲得： 通過美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中屯、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫下載東鄉(xiāng)野生稻轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序數(shù)據(jù)， 進(jìn)行去接頭污染序列及低質(zhì)量reads的處理，獲得化igene集，然后利用TIGR Gene Indices Clustering軟件和CD-mT軟件進(jìn)行組裝，最終獲得東鄉(xiāng)野生稻非冗余化igene-EST序列。
[0009] 2)東鄉(xiāng)野生稻SSR序列的識(shí)別： 采用SSR檢索軟件MISA對(duì)上述步驟（1)得到的非冗余化igene-EST序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)查 找。檢索的限定條件為:重復(fù)基序?yàn)?-6個(gè)堿基，重復(fù)單元數(shù)依次大于12次、6次、5次、5次、4 次和4次。
[0010] 3)東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR引物的設(shè)計(jì)： 根據(jù)上述步驟（2)識(shí)別的SSR位點(diǎn)，使用primers.0軟件批量設(shè)計(jì)genic-SSR引物，引物 設(shè)計(jì)參數(shù)設(shè)定為：引物長(zhǎng)度18-28 bp;烙解溫度55-65°C，60°C為最優(yōu)溫度;產(chǎn)物大小為80- 300 bp〇
[00川 4)東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR引物的有效性和通用性鑒定： 提取東鄉(xiāng)野生稻和現(xiàn)代栽培稻不同品種的基因組DNA，W其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò) 增反應(yīng)采用15化的反應(yīng)體系，其中包括50 ng模板DNA、1.5化10XPCR buffer、0.5 mM dNTPs、0.2 liM引物和lU TaqDNA聚合酶； 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性5 min;然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)95°C變性30s，55-63°C退 火303,72。(：延伸303;最后72。(：延伸10111111。
[001^ 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物加入2化loading buffer，W50 bp DNA Ladder為DM分子量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度為3-4%。電泳結(jié)束后，采用紫外凝 膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。依據(jù)每條引物擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度，若有80-300 bp擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 出，該引物即為有效引物。
[0013] 利用現(xiàn)代栽培稻的基因組DM進(jìn)行引物通用性鑒定，依據(jù)每條引物的目的片段長(zhǎng) 度，若有80-300 bp擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)出，該引物即具有通用性。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果： 1) 本發(fā)明通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫下載東鄉(xiāng)野生稻轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，獲得大量東鄉(xiāng)野 生稻非冗余化igene-EST序列，極大地增加了 genic-SSR分子標(biāo)記開發(fā)所用的原始數(shù)據(jù)； 2) 本發(fā)明利用生物信息學(xué)方法從東鄉(xiāng)野生稻化igene-EST序列中挖掘SSR位點(diǎn)，進(jìn)行 genic-SSR分子標(biāo)記的開發(fā)，克服了東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR分子標(biāo)記獲取困難的問題； 3) 使用東鄉(xiāng)野生稻和不同品種的現(xiàn)代栽培稻對(duì)開發(fā)的genic-SSR引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié) 果真實(shí)可靠； 4) 方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，獲得的分子標(biāo)記數(shù)量巨大，為東鄉(xiāng)野生稻的遺傳學(xué)研究及分子 育種等奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明中部分SSR重復(fù)基序類型和數(shù)量： 圖中縱坐標(biāo)軸表示SSR數(shù)量，橫坐標(biāo)軸表示SSR重復(fù)基序類型； 圖2為隨機(jī)選取25條genic-SSR分子標(biāo)記，利用東鄉(xiāng)野生稻基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和 瓊脂糖凝膠電泳： 圖中：1-18為成功擴(kuò)增的引物，M:50 bp DNA Ladder; 1-18:引物編號(hào)； 圖3為利用東鄉(xiāng)野生稻和15個(gè)現(xiàn)代栽培稻品種的基因組DNA進(jìn)行g(shù)enic-SSR分子標(biāo)記 通用性檢測(cè)（引物5); 圖中M:50 bp DNA Ladder;l:東鄉(xiāng)野生稻;2-16:15個(gè)現(xiàn)代栽培稻品種。
【具體實(shí)施方式】
[0016] -種東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR分子標(biāo)記開發(fā)方法，其【具體實(shí)施方式】包括W下步驟： 1)東鄉(xiāng)野生稻化igene-EST序列的獲得： 登陸美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中屯、(NCBI)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，下載東鄉(xiāng)野生稻轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè) 序數(shù)據(jù)，進(jìn)行去接頭污染序列及低質(zhì)量reads的處理，獲得地上和地下部分化igene集。然后 利用TIGR Gene Indices Clustering(TGICL,http://sourceforge.net/projects/tgicl/ files/tgicl〇/〇20v2.1/)軟件和CD-HIT化 ttp://www. bioinformat ics ,o;rg/cd-hit/)軟件進(jìn) 行組裝，最終獲得東鄉(xiāng)野生稻非冗余化igene-EST序列。
[0017] 2)東鄉(xiāng)野生稻SSR序列的識(shí)別： 采用SSR檢索軟件MISA化ttp: //pgrc . ipk-gatersleben. de/misa)對(duì)得到的非冗余 化igene-EST序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)查找，軟件參數(shù)設(shè)置如下：重復(fù)基序?yàn)?-6個(gè)堿基，重復(fù)單元 數(shù)依次大于12次，6次，5次，5次，4次和4次。
[0018] 3)東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR引物的設(shè)計(jì)： 使用町 imer3.0(ht1:ps ://sou;rceforge .1161:/91'〇^'6。13/91'；[1116^處;[163/)軟件對(duì)55尺位 點(diǎn)批量設(shè)計(jì)genic-SSR引物，引物設(shè)計(jì)參數(shù)設(shè)定為：引物長(zhǎng)度18-28 bp;烙解溫度55-65DC， 60T為最優(yōu)溫度;產(chǎn)物大小為80-300 bp。
[0019] 4)東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR引物的有效性和通用性鑒定： 提取東鄉(xiāng)野生稻和現(xiàn)代栽培稻不同品種的基因組DNA，W其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò) 增反應(yīng)采用15化的反應(yīng)體系，其中包括50 ng模板DNA、1.5化10XPCR buffer、0.5 mM dNTPs、0.2 liM引物和lU TaqDNA聚合酶。
[0020] PCR反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性5 min;然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)95°C變性30s，55-63°c退火 30s，72T延伸30s;最后72°C延伸 10 min。
[0021] PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物加入2 化 loading buffer，W50 bp DNA Ladder為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度為3-4%。電泳結(jié)束后，采用紫外凝膠成像系統(tǒng) 觀察并拍照。
[0022] 實(shí)施例1: 應(yīng)用上述方法從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中屯、(NCBI)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中下載獲得東鄉(xiāng)野生 稻正常培養(yǎng)的地上和地下部分組織轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，分別進(jìn)行去接頭污染序列及低 質(zhì)量reads的處理，然后組裝獲得76258條東鄉(xiāng)野生稻非冗余化igene-EST序列（表1)，應(yīng)用 MISA軟件共發(fā)掘出21226個(gè)SSR位點(diǎn)，其中SSR變異類型的頻率分布見圖1，使用Primer 3.0 軟件開發(fā)SSR引物3681對(duì)。
[0023] 從3681對(duì)設(shè)計(jì)的SSR引物中隨機(jī)選取25對(duì)，使用東鄉(xiāng)野生稻和15個(gè)現(xiàn)代栽培稻(表 2)的基因組DNA進(jìn)行引物通用性驗(yàn)證，具體材料信息詳見表2。結(jié)果表明：選取的25對(duì)引物 中18對(duì)可在東鄉(xiāng)野生稻中檢測(cè)到清晰的目的擴(kuò)增條帶(表3)，成功率達(dá)到72%，說明引物的 設(shè)計(jì)成功率較高（圖2) ; W現(xiàn)代栽培稻為模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，也可W檢測(cè)到清晰的目的 擴(kuò)增條帶，并且不同品種之間存在多態(tài)性，說明運(yùn)些genic-SSR引物在栽培稻中具有較好的 通用性（圖3)。

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR分子標(biāo)記開發(fā)方法，其特征在于，所述方法步驟為： 1) 東鄉(xiāng)野生稻Unigene-EST序列的獲得： 通過美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫下載東鄉(xiāng)野生稻轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序數(shù)據(jù)， 進(jìn)行去接頭污染序列及低質(zhì)量reads的處理，獲得Unigene集，然后利用TIGR Gene Indices Clustering軟件和CD-HIT軟件進(jìn)行組裝，最終獲得東鄉(xiāng)野生稻非冗余Unigene-EST序列； 2) 東鄉(xiāng)野生稻SSR序列的識(shí)別： 采用SSR檢索軟件MISA對(duì)上述步驟（1)得到的非冗余Unigene-EST序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)查 找;檢索的限定條件為:重復(fù)基序?yàn)?-6個(gè)堿基，重復(fù)單元數(shù)依次大于12次、6次、5次、5次、4 次和4次； 3) 東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR引物的設(shè)計(jì)： 根據(jù)上述步驟(2)識(shí)別的SSR位點(diǎn)，使用primer3.0軟件批量設(shè)計(jì)genic-SSR引物，引物 設(shè)計(jì)參數(shù)設(shè)定為：引物長(zhǎng)度18-28 bp;熔解溫度55-65°C，60°C為最優(yōu)溫度;產(chǎn)物大小為80-300 bp; 4) 東鄉(xiāng)野生稻genic-SSR引物的有效性和通用性鑒定： 提取東鄉(xiāng)野生稻和現(xiàn)代栽培稻不同品種的基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR擴(kuò) 增反應(yīng)程序采用15 yL的反應(yīng)體系，其中包括50 ng模板DNA、1.5 yL 10XPCR buffer、0.5 mM dNTPs、0.2 μΜ引物和 1U TaqDNA聚合酶； 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性5 min;然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)95°C變性30s，55-63°C退 火30s，72°C延伸30s;最后72°C延伸 10 min; 所述PCR擴(kuò)增反程序結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物加入2 yL loading buffer，以50 bp DNA Ladder為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度為3-4%;電泳結(jié)束后，采用紫外凝 膠成像系統(tǒng)觀察并拍照;依據(jù)每條引物擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度，若有80-300 bp擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 出，該引物即為有效引物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106011275SQ201610556793
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】張帆濤, 張朦, 謝建坤, 孫佳
【申請(qǐng)人】江西師范大學(xué)