一種基于等溫指數(shù)擴(kuò)增法快速檢測miRNA的方法
【專利摘要】本專利公開了一種基于等溫指數(shù)擴(kuò)增法快速檢測miRNA的方法，涉及熒光探針檢測技術(shù)領(lǐng)域。通過microRNA與模板DNA特異性結(jié)合，在聚合酶和內(nèi)切酶的作用下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物以指數(shù)的形式放大，較傳統(tǒng)方法有更高的靈敏度。本方法包括探針預(yù)變性?等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)?熒光檢測三個步驟，反應(yīng)時(shí)間短，能夠較好的區(qū)分單核苷酸的差異性，此外，等溫條件和簡單的熒光測量，將大大促進(jìn)一個簡單，快速，低成本的檢測系統(tǒng)的發(fā)展，有助于我們對microRNA進(jìn)行定量分析以及生物體的生理病理機(jī)制的理解，并最終為疾病的診斷和治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種基于等溫指數(shù)擴(kuò)増法快速檢測m i RNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及熒光探針檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是一種綜合了等溫指數(shù)擴(kuò)增法和利用兩種發(fā)夾探針實(shí)現(xiàn)對miRNA的快速超靈敏的熒光檢測方法。【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNA目前是一個十分活躍的研究領(lǐng)域，它對于深入探討生命現(xiàn)象的本質(zhì)、解釋細(xì)胞行為和疾病發(fā)生機(jī)制、以及疾病診斷、基因治療藥物的開發(fā)都具有重大意義。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)microRNA的表達(dá)水平與人類重大疾病如癌癥等密切相關(guān)。為此microRNA的檢測成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和前沿，先后出現(xiàn)了一些microRNA檢測方法，但目前microRNA的檢測仍不能滿足實(shí)際需要，追求更高的檢測限、更靈敏的檢測方法一直是microRNA研究的目標(biāo)。因此通過對microRNA高靈敏的檢測，能夠?qū)崿F(xiàn)疾病早期預(yù)警的目的。
[0003]MicroRNA被視為一種新型的生物標(biāo)志物和各種疾病的潛在治療靶標(biāo)。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上，microRNA有著十分重要的調(diào)節(jié)作用，microRNA的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)展和各種疾病相關(guān)。microRNA具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)活性的功能，廣泛存在于真核生物體內(nèi)。microRNA的廣泛存在與進(jìn)化上的保守性，暗示它在生命活動中具有必不可少的調(diào)節(jié)作用，他們參與動植物生長發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與調(diào)亡、激素分泌、腫瘤形成等各種過程。microRNA無論在數(shù)量上還是功能上，可能都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目前的發(fā)現(xiàn)，對其進(jìn)行深入的研究，將有助于我們對生物體的各種生理病理機(jī)制的理解，并最終為疾病的診斷和治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
[0004]為了解決microRNA在低濃度下也能進(jìn)行檢測的問題，microRNA識別和信號放大策略變的尤為重要。然而，目前檢測方法，如單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)、恒溫指數(shù)放大反應(yīng)雖然具有較高的靈敏度和特異性，但是都比較耗時(shí)。因此發(fā)展一種既能特異性識別， 又能夠檢測到低濃度microRNA的方法具有重要意義。microRNA與模板DNA特異性結(jié)合，在聚合酶和內(nèi)切酶的作用下實(shí)現(xiàn)microRNA以指數(shù)的形式放大，靈敏度高且操作簡單、省時(shí)省力。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是構(gòu)建一種發(fā)夾探針特異性識別microRNA以及能實(shí)現(xiàn)快速靈敏檢測microRNA的方法。
[0006]—種基于等溫指數(shù)擴(kuò)增的利用發(fā)夾探針靈敏、快速檢測microRNA的方法，其特征是包括以下步驟:(1)探針預(yù)變性首先，F(xiàn)AM標(biāo)記的發(fā)卡探針1和DABCYL標(biāo)記的發(fā)卡探針2以及模板DNA，在95 °C下分別孵育5min;將這三種溶液在室溫條件下放置30min;(2)等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)以下步驟進(jìn)行的總反應(yīng)混合液體積為80 yL，不同濃度的microRNA與120 nM的模板 DNA部分序列雜交，加入0.25 mM的dNTPs，在濃度為65.0 U/mL的Vent DNA polymerase的作用下，使單鏈模板DNA進(jìn)行復(fù)制形成雙鏈DNA，再加入666.7 U/mL的Nt.BstNBI，剪切下一條短的DNA引物鏈，最后加入20.0 nM的發(fā)卡探針1和發(fā)卡探針2混合于緩沖溶液中，混合溶液在55 °C反應(yīng)1 h;緩沖溶液的成分為Nt.BstNBI buffer和ThermoPol buffer;(3)熒光檢測熒光檢測的實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下:激發(fā)波長為496 nm，發(fā)射波長范圍為500-650 nm。
[0007]本發(fā)明的有益效果(1)通過microRNA與模板DNA雜交，在聚合酶、內(nèi)切酶作用下能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)物的指數(shù)擴(kuò)增；(2)利用發(fā)卡探針1和發(fā)卡探針2特異性識別microRNA，實(shí)現(xiàn)熒光信號快速放大；(3)本發(fā)明所述方法操作簡單、反應(yīng)快速。【附圖說明】
[0008]圖1為本文所述方法的實(shí)驗(yàn)原理圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0009]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施。
[0010]實(shí)施例1一種基于等溫指數(shù)擴(kuò)增的利用發(fā)夾探針靈敏、快速檢測microRNA的方法，其特征是包括以下步驟:(1)探針預(yù)變性首先，F(xiàn)AM標(biāo)記的發(fā)卡探針1和DABCYL標(biāo)記的發(fā)卡探針2以及模板DNA，在95 °C下分別孵育5 min;將這三種溶液在室溫條件下放置30 min;(2)等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)以下步驟進(jìn)行的總反應(yīng)混合液體積為80 yL，不同濃度的microRNA與120 nM的模板 DNA部分序列雜交，加入0.25 mM的dNTPs，在濃度為65.0 U/mL的Vent DNA polymerase的作用下，使單鏈模板DNA進(jìn)行復(fù)制形成雙鏈DNA，再加入666.7 U/mL的Nt.BstNBI，剪切下一條短的DNA引物鏈，最后加入20.0 nM的發(fā)卡探針1和發(fā)卡探針2混合于緩沖溶液中，混合溶液在55 °C反應(yīng)1 h;緩沖溶液的成分為Nt.BstNBI buffer和ThermoPol buffer;(3)熒光檢測熒光檢測的實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下:激發(fā)波長為496 nm，發(fā)射波長范圍為500-650 nm。
[0011]實(shí)施例2檢測步驟同例1，不同之處是:步驟2中反應(yīng)時(shí)間為0.5 h。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于等溫指數(shù)擴(kuò)增法快速檢測miRNA的方法，其特征是包括以下步驟:(1)探針預(yù)變性首先，F(xiàn)AM標(biāo)記的發(fā)卡探針1和DABCYL標(biāo)記的發(fā)卡探針2以及模板DNA，在95 °C下分別孵 育5 min;將這三種溶液在室溫條件下放置30 min;(2)等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)以下步驟進(jìn)行的總反應(yīng)混合液體積為80 yL，不同濃度的microRNA與120 nM的模板 DNA部分序列雜交，加入0.25 mM的dNTPs，在濃度為65.0 U/mL的Vent DNA polymerase的作 用下，使單鏈模板DNA進(jìn)行復(fù)制形成雙鏈DNA，再加入666.7 U/mL的Nt.BstNBI，剪切下一條 短的DNA引物鏈，最后加入20.0 nM的發(fā)卡探針1和發(fā)卡探針2混合于緩沖溶液中，混合溶液 在55 °C反應(yīng)1 h;緩沖溶液的成分為Nt.BstNBI buffer和ThermoPol buffer;(3)熒光檢測熒光檢測的實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下:激發(fā)波長為496 nm，發(fā)射波長范圍為500-650 nm。2.如權(quán)利要求1所述的一種基于等溫指數(shù)擴(kuò)增的利用發(fā)夾探針靈敏、快速檢測 microRNA的方法，其特征是步驟(2)中microRNA的濃度為0.375 nM，其核苷酸序列為說明書 核苷酸序列表中所述序列。3.如權(quán)利要求1所述的一種基于等溫指數(shù)擴(kuò)增的利用發(fā)夾探針靈敏、快速檢測 microRNA的方法，其特征是步驟(2)中的反應(yīng)溫度為55°C，反應(yīng)時(shí)間為1 h。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011274SQ201610551469
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月14日
【發(fā)明人】劉海云, 田甜, 顏梅, 于京華, 葛慎光, 張彥, 馬超
【申請人】濟(jì)南大學(xué)