含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔10，〇〇〇個(gè)細(xì)胞接 種到12孔板，每孔體積為I ml; ② 培養(yǎng)細(xì)胞:5% C02,37°C孵育24 h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底； ③ 藥物處理:加入制備出的BSNQ(IC5t): 1.40 μΜ)，處理不同時(shí)間（0,3,6，12,24 h); ④ 用PBS洗滌2次，加入 195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，再加入5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻； ⑤ 加入10 μL碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液，輕輕混勾； ⑥ 室溫(20-25°C)避光孵育15分鐘； ⑦ (A)在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及顏色的改變，綠色熒光為Annexin V-FITC染 色陽(yáng)性細(xì)胞，紅色熒光為碘化丙啶陽(yáng)性細(xì)胞。僅被綠色熒光染色，且體積較小的細(xì)胞為凋亡 細(xì)胞;被紅色或綠色和紅色雙染，且體積較大的細(xì)胞為壞死細(xì)胞;未被染色的細(xì)胞為正常細(xì) 胞。隨機(jī)觀察200個(gè)細(xì)胞，求得各種細(xì)胞所占的百分比，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)3次取平均。（B)同時(shí)， 也利用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)BSNQ對(duì)人肝癌細(xì)胞的凋亡。
[0023] 1、用BSNQ處理Hep3B細(xì)胞，檢測(cè)BSNQ對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞的凋亡 采用上述實(shí)驗(yàn)方法，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4A、圖4B、圖5A及圖5B，其中圖4A是用BSNQ處 理Hep3B細(xì)胞后，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況圖，shikonin和5-FU為陽(yáng)性對(duì)照組；圖 4B是圖4A的定量分析圖。圖5A是用BSNQ和OSNQ處理Hep3B細(xì)胞后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì) 胞凋亡情況圖；圖5B是圖5A的定量分析圖。
[0024]結(jié)果分析 用BSNQ(終濃度為1.40 μΜ)處理人肝癌Hep3B細(xì)胞0、3、6、12、24 11后，進(jìn)行4111161丨11￥-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)，并在熒光顯微鏡觀察。從圖4B中可以看出，隨著藥物處理時(shí)間的不斷增 加 ，Annexin V-FITC熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，其細(xì)胞凋亡程度也顯著增加。尤其當(dāng)時(shí)間為24 h 時(shí)，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度最高。結(jié)果說(shuō)明，BSNQ可以有效誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞的凋亡，并呈時(shí)間依賴 性。
[0025]用BSNQ(終濃度為1.40 μΜ)處理人肝癌Hep3B細(xì)胞0、3、6、12、24 11后，進(jìn)行4111^^111 V-FITC和PI進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。從圖5B中可以看出，隨著藥物處 理時(shí)間的不斷增加，肝癌Hep3B細(xì)胞凋亡的程度也隨之增加，尤其當(dāng)藥物處理時(shí)間達(dá)到24 h 時(shí)，細(xì)胞的凋亡水平明顯增加。這一結(jié)果說(shuō)明，BSNQ可以有效誘導(dǎo)Hep3B的凋亡，并呈時(shí)間依 賴性。
[0026] 2、用BSNQ處理HepG2細(xì)胞，檢測(cè)BSNQ對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡 采用上述實(shí)驗(yàn)方法，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6A及圖6B，其中圖6A是用BSNQ處理HepG2細(xì) 胞后，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況圖，hikonin和5-FU為陽(yáng)性對(duì)照組；圖6B是6A圖的 定量分析圖。
[0027]結(jié)果分析 用BSNQ(終濃度為1.40 μΜ)處理人肝癌HepG2細(xì)胞0、3、6、12、24 11后，進(jìn)行4111161丨11￥-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)，并在熒光顯微鏡觀察。從圖6B中可以看出，隨著藥物處理時(shí)間的不斷增 加 ，Annexin V-FITC熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，其細(xì)胞凋亡程度也顯著增加。尤其當(dāng)時(shí)間為24 h 時(shí)，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度最高。BSNQ可以有效誘導(dǎo)!fepG2細(xì)胞的凋亡，并呈時(shí)間依賴性。
[0028] 3、用BSNQ處理Huh7細(xì)胞，檢測(cè)BSNQ對(duì)人肝癌Huh7細(xì)胞的凋亡 采用上述實(shí)驗(yàn)方法，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7A及圖7B，其中圖7A是用BSNQ處理Huh7細(xì)胞 后，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況圖，shikonin和5-FU為陽(yáng)性對(duì)照組；圖7B是圖7A的定 量分析圖。
[0029]結(jié)果分析 用83購(gòu)(終濃度為1.40以1〇處理人肝癌肋117細(xì)胞0、3、6、12、24 11后，進(jìn)行4111161丨11￥-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)，并在熒光顯微鏡觀察。從圖7B中可以看出，隨著藥物處理時(shí)間的不斷增 加 ，Annexin V-FITC熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，其細(xì)胞凋亡程度也顯著增加。尤其當(dāng)時(shí)間為24 h 時(shí)，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度最高。BSNQ和OSNQ可以有效誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞的凋亡，并呈時(shí)間依賴性。 [0030] 綜上所述，BSNQ(IC5t): 1.40 μΜ)可以誘導(dǎo)人肝癌Hep3B、!fepG2和Huh7細(xì)胞的凋亡， 其癌細(xì)胞凋亡能力隨著時(shí)間的增加而逐漸升高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種2-丁亞砜-1，4-萘醌的制備方法，具體按照以下步驟進(jìn)行： (1) 2-丁巰基-1，4-萘醌的合成 在反應(yīng)容器中加入1，4_萘醌和甲醇，甲醇的量滿足充分溶解1，4_萘醌即可，二者混合 均勻后加入1-丁硫醇，1-丁硫醇與1，4_萘醌的摩爾比為1.5:1，室溫下反應(yīng)3-5小時(shí)后，向反 應(yīng)容器中加入重鉻酸鈉和濃硫酸，重鉻酸鈉與1，4-萘醌的摩爾比為1:5,濃硫酸與1，4-萘醌 的摩爾比為3:4，繼續(xù)反應(yīng)5-10分鐘;然后用二氯甲燒和飽和食鹽水萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥， 過(guò)濾，濃縮至干燥，得2-丁巰基-1，4-萘醌； (2) 2-丁亞砜-1，4-萘醌的合成 在反應(yīng)瓶中，加入步驟（1)產(chǎn)物2-丁巰基-1，4-萘醌和氯仿，氯仿的量滿足充分溶解2-丁巰基-1，4-萘醌即可，繼續(xù)加入3-氯過(guò)氧苯甲酸，3-氯過(guò)氧苯甲酸與2-丁巰基-1，4-萘醌 的摩爾比為1.2:1，0°C溫度下反應(yīng)1.5-2.5小時(shí)，反應(yīng)完全后加入5% NaHC03溶液中和反應(yīng) 中過(guò)剩的3-氯過(guò)氧苯甲酸后終止反應(yīng);反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)二氯甲烷和飽和食鹽水萃取，無(wú)水硫酸 鈉干燥，過(guò)濾，濃縮至干燥，得2-丁亞砜-1，4-萘醌。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種2-丁亞砜-1,4-萘醌的制備方法，解決了現(xiàn)有僅從植物中提取和分離萘醌類化合物遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足研究和應(yīng)用需求的問(wèn)題。具體分兩步進(jìn)行，首先合成2-丁巰基-1,4-萘醌，使1-丁硫醇與1,4-萘醌室溫下反應(yīng)3-5小時(shí)后，加入重鉻酸鈉和濃硫酸，繼續(xù)反應(yīng)5-10分鐘后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行后處理得2-丁巰基-1,4-萘醌；然后合成2-丁亞砜-1,4-萘醌，將2-丁巰基-1,4-萘醌與3-氯過(guò)氧苯甲酸在0℃溫度下反應(yīng)1.5-2.5小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)后處理得2-丁亞砜-1,4-萘醌。本發(fā)明制備方法的合成路線簡(jiǎn)單，反應(yīng)溫度低，得到的2-丁亞砜-1,4-萘醌產(chǎn)物，抗癌效果明顯，而且對(duì)癌細(xì)胞的選擇性高。
【IPC分類】C07C315/02, C07C317/12
【公開(kāi)號(hào)】CN105541678
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610046372
【發(fā)明人】金成浩, 孫虎男, 羅英花, 臧延青, 申貴男, 劉暢, 吳丹丹, 蔣雪園, 孟令旗, 王浩, 徐婉婷
【申請(qǐng)人】黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月25日