使用包含cmp或酪蛋白種類的給料分離骨橋蛋白的方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?201280015495. 4"，申請日為"2012年3月5日"，發(fā)明名稱為 "使用包含CMP或酪蛋白種類的給料來分離骨橋蛋白的方法"的申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種用于從一種乳源給料（例如，基于乳血清（milkserum)或甜乳清 的一種給料）中分離骨橋蛋白的方法。具體來說，本方法涉及使用該乳源給料的一個窄窗 位的pH和比電導(dǎo)，這已經(jīng)出乎意料地被證明實(shí)現(xiàn)了從化學(xué)上復(fù)雜的給料中非常有效地分 離骨橋蛋白。
【背景技術(shù)】
[0003] 骨橋蛋白是一種酸性的、高度磷酸化的、唾液酸豐富的、鈣結(jié)合蛋白。骨橋蛋白含 有約28摩爾結(jié)合磷酸鹽/摩爾骨橋蛋白，并且結(jié)合約50摩爾鈣/摩爾骨橋蛋白。
[0004] 骨橋蛋白（OPN)是在許多生物過程中涉及的一種多功能生物活性蛋白，這些生物 過程如骨重塑、異位鈣化抑制、以及細(xì)胞粘附與迀移、還有若干免疫功能。骨橋蛋白具有細(xì) 胞因子樣特性并且是啟動T輔助1型免疫應(yīng)答的一個關(guān)鍵因素。骨橋蛋白存在于大多數(shù)組 織和體液中，并且發(fā)現(xiàn)在乳中濃度最高。
[0005] 為了支持在異位鈣化中OPN的抑制功能，使用了OPN缺陷小鼠的體內(nèi)模型在外源 性添加這種蛋白質(zhì)時顯示出鈣化減弱。此外，在泌尿道防御腎結(jié)石的形成中涉及0PN，因?yàn)?OPN可以抑制一水草酸鈣晶體的生長和聚集。
[0006]目前尚不清楚乳中OPN的生物學(xué)作用；然而，可以推測若干功能。已經(jīng)報道在乳腺 發(fā)育和分化中涉及骨橋蛋白，并且已經(jīng)在泌乳早期在乳腺中觀察到高水平的OPN表達(dá)。此 外，該蛋白質(zhì)的高陰離子性質(zhì)可以使得OPN能夠與鈣離子形成可溶性絡(luò)合物，并且從而抑 制乳中無意的鈣結(jié)晶和沉淀。
[0007] 在科學(xué)文獻(xiàn)中，骨橋蛋白典型地是從骨或乳中純化出的，并且該蛋白質(zhì)典型地以 20mg/L的濃度存在于牛乳中。在乳中，骨橋蛋白是一種血清蛋白，但取決于Ca2+的水平還 可能在一定程度上與酪蛋白膠束締合。酸乳清是用于骨橋蛋白的工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)選原材料。 當(dāng)酸乳清形成時，骨橋蛋白被認(rèn)為在Ca2+泄漏進(jìn)入血清相時離開酪蛋白膠束。此方面使酸 乳清成為骨橋蛋白的一個直接來源。由于相同的原因，甜乳清具有稍低的骨橋蛋白質(zhì)含量。 此外，甜乳清含有來自K-酪蛋白（kappa-casein)的酶裂解的酪蛋白巨肽（CMP)。CMP與 骨橋蛋白在生化方面具有許多相似之處-都是小的、柔性的、酸性的、磷酸化的糖蛋白。由 于此原因，CMP和骨橋蛋白被認(rèn)為在其結(jié)合離子交換樹脂方面相當(dāng)類似，這將在從含CMP的 原材料中純化骨橋蛋白中造成問題。另一方面是由用于奶酪制作的蛋白水解酶所引起的骨 橋蛋白的可能降解。無論是對于工業(yè)生產(chǎn)還是對于科學(xué)研究，這三個方面可能已導(dǎo)致避免 使用這種原材料來純化骨橋蛋白。
[0008] WO02/28413A1描述了一種借助于低pH陰離子交換來從給料（如乳和酸乳清）中 生產(chǎn)含骨橋蛋白的組合物的方法。在WO02/28413A1中，強(qiáng)調(diào)了無論是工藝給料還是所得 的產(chǎn)品都不可能含有cGMP，cGMP是已知結(jié)合陰離子交換劑并且將抑制骨橋蛋白的結(jié)合的 一種類型的CMP。
[0009] WO01/149741A2描述了一種方法，其中通過以下方式從一種乳材料中純化出骨橋 蛋白：將該乳材料與可溶性鈣混合并調(diào)節(jié)該混合物的PH，以便選擇性地沉淀乳清的其他蛋 白質(zhì)組分同時保留溶液中的骨橋蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，出乎意料地并且與在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的偏見相反，可以通過 陰離子交換從多種復(fù)雜的乳源給料中以高產(chǎn)量和高純度分離出骨橋蛋白，盡管給料存在多 種競爭蛋白。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，給料的比電導(dǎo)對于骨橋蛋白的產(chǎn)量和純度特別重要，并且 已經(jīng)確定了用于從乳源給料中分離骨橋蛋白的最佳比電導(dǎo)窗位。
[0011] 因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種用于從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法， 該方法包括以下步驟：
[0012] a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3. 6-6. 5 的范圍內(nèi)的pH以及在25°C下4-lOmS/cm的范圍內(nèi)的比電導(dǎo)，
[0013]b)使所述乳源給料經(jīng)受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換 介質(zhì)進(jìn)行接觸，
[0014]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質(zhì)，并且
[0015]d)回收結(jié)合至該陰離子交換介質(zhì)的蛋白質(zhì)，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種 組合物。
[0016] 本發(fā)明可以例如涉及一種用于從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法，該方法包 括以下步驟：
[0017]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3. 6-6. 5 的范圍內(nèi)的pH以及在25°C下4-lOmS/cm的范圍內(nèi)的比電導(dǎo)，
[0018] 并且其中所述乳源給料進(jìn)一步包含
[0019]-相對于乳源給料的蛋白質(zhì)的總量而言量為至少1% (w/w)的酪蛋白巨肽，或
[0020] -游離a酪蛋白和游離(6-酪蛋白，
[0021] b)使所述乳源給料經(jīng)受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換 介質(zhì)進(jìn)行接觸，
[0022] c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質(zhì)，并且
[0023] d)回收結(jié)合至該陰離子交換介質(zhì)的蛋白質(zhì)，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種 組合物。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料還可包含具有小于5. 0的等電點(diǎn)（pi)的額外蛋白 質(zhì)。優(yōu)選地，該一種或多種額外蛋白質(zhì)可包含選自下組的一種或多種蛋白質(zhì)，該組由以下各 項組成：a-乳清蛋白、酪蛋白巨肽、酪蛋白磷酸肽、蛋白胨-3、蛋白胨_5、蛋白胨-8以及它 們的混合物。更優(yōu)選地，該一種或多種額外蛋白質(zhì)可包括酪蛋白巨肽（CMP)。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可包含一種乳血清源給料、或甚至基本上由其組 成。優(yōu)選地，該乳源給料可包含甜乳清源給料、或甚至基本上由其組成。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可包含相對于該乳源給料的蛋白質(zhì)的總量而言量 為至少1% (w/w)的CMP。優(yōu)選地，該乳源給料可包含相對于該乳源給料的蛋白質(zhì)的總量而 言量在1%至40% (w/w)的范圍內(nèi)的CMP。
[0027] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可包含相對于該乳源給料的蛋白質(zhì)的總量而言總 量為至少0.5% (w/w)的游離a酪蛋白和游離(6-酪蛋白。
[0028] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可具有在5. 0-6. 5范圍內(nèi)的pH，例如在pH 5. 0-6. 0的范圍內(nèi)。
[0029] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可具有在15°C-40°C范圍內(nèi)的溫度，例如在 20°C-38°C的范圍內(nèi)。
[0030] 在一些實(shí)施方案中，所述方法中提供該乳源給料的步驟a)可涉及從一種將形成 該乳源給料的酸化液體中去除沉淀。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可包含相對于該乳源給料的蛋白質(zhì)的總量而言量 為至少1% (w/w)的a-乳清蛋白。優(yōu)選地，該乳源給料可包含相對于該乳源給料的蛋白質(zhì) 的總量而言量在1%至50% (w/w)的范圍內(nèi)的a-乳清蛋白。
[0032] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可包含相對于該乳源給料的蛋白質(zhì)的總量而言量 為至少1% (w/w)的(6-乳球蛋白。優(yōu)選地，該乳源給料可包含相對于該乳源給料的蛋白質(zhì) 的總量而言量在1%至70% (w/w)的范圍內(nèi)的(6-乳球蛋白。
[0033] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可包含總量在6_250g/L乳源給料的范圍內(nèi)的蛋 白質(zhì)。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可具有在25°C下pH3. 8-5. 5的范圍內(nèi)的pH。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可具有在25°C下4. 5-9.OmS/cm的范圍內(nèi)的比電 導(dǎo)。
[0036] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可具有在25°C下4_7mS/cm的范圍內(nèi)的比電導(dǎo)。
[0037] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可具有在25°C下5_8mS/cm的范圍內(nèi)的比電導(dǎo)。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，該乳源給料可具有在25°C下7-10mS/cm的范圍內(nèi)的比電導(dǎo)。
[0039] 在一些實(shí)施方案中，該陰離子交換介質(zhì)可包含一種固相和一種或多種陽離子基 團(tuán)。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，該陰離子交換介質(zhì)的該固相可包含選自下組的一種或多種組 分，該組由以下各項組成：多個粒子、一種過濾器、以及一種膜。優(yōu)選地，該固相可包含多糖、 或甚至基本上由其組成。更優(yōu)選地，該固相可包含交聯(lián)多糖、或甚至基本上由其組成。最優(yōu) 選地，該固相可包含瓊脂糖、或甚至基本上由其組成。
[0041] 在一些實(shí)施方案中，所述陽離子基團(tuán)可包括氨基、或甚至基本上由其組成。
[0042] 在一些實(shí)施方案中，該回收的組合物還可經(jīng)受選自下組的一個或多個處理步驟， 該組由以下各項組成：濃縮、滲濾、蒸發(fā)溶劑、噴霧干燥、以及取代結(jié)合了蛋白質(zhì)的陽離子。 因此，在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例中，用于從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法包括以 下步驟：
[0043]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3. 6-6. 5 的范圍內(nèi)的pH以及在25°C下4-10mS/cm的范圍內(nèi)的比電導(dǎo)，并且其中所述乳源給料進(jìn)一步 包含相對于乳源給料的蛋白質(zhì)的總量而言量為至少1% (w/w)的酪蛋白巨肽，
[0044]b)使所述乳源給料經(jīng)受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換 介質(zhì)進(jìn)行接觸，
[0045]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質(zhì)，并且
[0046]d)回收結(jié)合至該陰離子交換介質(zhì)的蛋白質(zhì)，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種 組合物。
[0047] 在本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施例中，用于從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法包括 以下步驟：
[0048]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3. 6-6. 5 的范圍內(nèi)的pH以及在25°C下4-10mS/cm的范圍內(nèi)的比電導(dǎo)，并且其中所述乳源給料進(jìn)一步 包含游離a酪蛋白和游離(6-酪蛋白，
[0049] b)使所述乳源給料經(jīng)受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換 介質(zhì)進(jìn)行接觸，
[0050]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質(zhì)，并且
[0051]d)回收結(jié)合至該陰離子交換介質(zhì)的蛋白質(zhì)，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種 組合物。
[0052] 在本發(fā)明的另外的優(yōu)選實(shí)施例中，用于從一種乳源給料中分離骨橋蛋白的方法包 括以下步驟：
[0053]a)提供包含骨橋蛋白的一種乳源給料，所述乳源給料具有在25°C下pH3. 6-6. 5 的范圍內(nèi)的pH以及在25°C下4-10mS/cm的范圍內(nèi)的比電導(dǎo)，并且其中所述乳源給料進(jìn)一步 包含
[0054]-相對于乳源給料的蛋白質(zhì)的總量而言量為至少1% (w/w)的酪蛋白巨肽，以及
[0055]-游離a酪蛋白和游離(6-酪蛋白，
[0056] b)使所述乳源給料經(jīng)受陰離子交換色譜法，包括使該乳源給料與一種陰離子交換 介質(zhì)進(jìn)行接觸，
[0057]c)可任選地，洗滌該陰離子交換介質(zhì)，并且
[0058] d)回收結(jié)合至該陰離子交換介質(zhì)的蛋白質(zhì)，從而獲得包含分離的骨橋蛋白的一種 組合物。
[0059] 除了上面所提到的優(yōu)點(diǎn)外，本方法允許更具成本效益地使用該陰離子交換介質(zhì)， 并且允許每kg陰離子交換介質(zhì)骨橋蛋白的更高產(chǎn)量。
[0060] 本方法的另一優(yōu)點(diǎn)是如實(shí)例5中所展示的每個陰離子交換周期提高的骨橋蛋白 產(chǎn)量。
[0061] 水溶液的"比電導(dǎo)"（有時被稱為"比電導(dǎo)率"）是該溶液導(dǎo)電能力的一個量度。該 比電導(dǎo)可以（例如）通過測量該溶液在兩個電極之間的AC電阻來確定，并且典型地以單位 毫西門子每厘米（mS/cm)來給出結(jié)果。比電導(dǎo)的測量可以例如根據(jù)EPA(美國環(huán)境保護(hù)署） 方法第120. 1號進(jìn)行測量。
[0062] 本發(fā)明的又一方面涉及通過本方法獲得的含骨橋蛋白的組合物。
[0063] 本發(fā)明的再一方面因此涉及一種含骨橋蛋白的組合物。
【附圖說明】
[0064]圖1.在5. 5mS/cm的比電導(dǎo)下甜乳清源給料的pH對骨橋蛋白的純度和產(chǎn)量的影 響，
[0065] 圖2.在pH4. 3下甜乳清源給料的比電導(dǎo)對骨