一種蝎毒素蛋白包涵體的純化與復(fù)性方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蝎毒素蛋白包涵體的純化、復(fù)性方 法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在中國，全竭是傳統(tǒng)的中藥材，具有極高的藥用價(jià)值。在《本草綱目》即有記載治 療"諸風(fēng)掉眩，搐掣，瘧疾寒熱，耳聾無聞"，在《本草圖經(jīng)》中記載"治小兒驚搐"，在《開寶本 草》中記載"療諸風(fēng)癮疹，及中風(fēng)半身不遂，口眼喁斜，語澀，手足抽掣"等。
[0003] 隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展，人們已經(jīng)認(rèn)識到全蝎最主要的藥用成分來源于竭子的毒液， 特別是其中的蛋白組分，以神經(jīng)毒素的含量最高。這些神經(jīng)毒素的作用位點(diǎn)為各種離子通 道，包括鉀離子通道，鈉離子通道，氯離子通道和鈣離子通道等。
[0004] 離子通道是許多生命活動的直接參與者，比如心肌、骨骼肌和平滑肌等肌肉收縮 過程，防御T細(xì)胞的激活、釋放胰島素的0細(xì)胞激活，以及很多神經(jīng)細(xì)胞突觸的遞質(zhì)傳遞 等。因此，離子通道與多種疾病息息相關(guān)，包括心血管疾病、癲癇、神經(jīng)病、腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎和糖尿病等。蝎毒素通過選擇性作用于離子通道，改變其傳導(dǎo)性、動力學(xué)特性等發(fā)揮生 物學(xué)功能，在上述疾病的治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 基于以上特性，蝎毒素可以作為研究細(xì)胞膜上離子通道的分子探針，有利于深入 了解離子通道的調(diào)控機(jī)制，大力推進(jìn)對離子通道結(jié)構(gòu)和功能以及相關(guān)疾病的研究；同時(shí)為 生理學(xué)、藥理學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等研究領(lǐng)域提供重要材料。
[0006] 蝎毒素主要是一類20~98個(gè)氨基酸構(gòu)成的具有生物活性的小分子多肽，具有重 要的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，但是由于蝎子來源匱乏，天然蝎毒素提取率極低，根本無法滿足臨床及 研究需要。分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展使蝎毒素在其他體系中的重組表達(dá)成為可 能。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)由于其生長迅速，表達(dá)量高，成本低廉，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，成為目前最 廣泛使用的表達(dá)系統(tǒng)。但是由于多數(shù)蝎毒素富含二硫鍵，在大腸桿菌中表達(dá)量極低，很難折 疊成正確構(gòu)象，常形成包涵體，導(dǎo)致獲得的重組蛋白生物活性大大低于天然蝎毒素。所以許 多措施被應(yīng)用于增加蝎毒素的可溶性表達(dá)。例如分泌信號肽的使用，融合表達(dá)技術(shù)及一些 高拷貝表達(dá)載體的選擇和強(qiáng)啟動子的使用等。近年來，SUMO融合技術(shù)的發(fā)展大大改善了蝎 毒素的可溶表達(dá)情況，但是由于這種方法收率低以及得到的毒素活性不高等因素，為蝎毒 素的進(jìn)一步研究和新藥開發(fā)造成了不便。
[0007] 為提高收率、改善毒素活性，體外氧化復(fù)性使毒素結(jié)構(gòu)重折疊是個(gè)不錯(cuò)的選擇。 通常，將包涵體蛋白復(fù)性變?yōu)榛钚缘鞍仔枰鋈缦氯教幚恚旱谝唬斋@并洗滌包涵體；第 二，溶解包涵體，得到變性蛋白；第三，復(fù)性。經(jīng)洗滌和溶解得到的變性蛋白是不具備生物活 性的，需要復(fù)性。復(fù)性的原理是通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從完全伸展的變性狀態(tài)恢 復(fù)到正確折疊的結(jié)構(gòu)，去除還原劑效應(yīng)，使二硫鍵正確配對形成正確的空間構(gòu)象，而產(chǎn)生生 物活性。前兩步收率相對較高，第三步收率較低。影響復(fù)性成功的關(guān)鍵因素較多，包括確定 復(fù)性初始的蛋白濃度、復(fù)性緩沖液、pH、溫度、復(fù)性時(shí)間間隔等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種高效分離純化重組蝎毒蛋白包涵體的方 法，以及蝎毒蛋白包涵體的復(fù)性方法。
[0009] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供利用上述方法制備得到的蝎毒蛋白在制備抗 腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0011] -種蝎毒蛋白的純化與復(fù)性方法，該方法包括如下步驟：
[0012] (1)將蝎毒蛋白包涵體投入變性緩沖液，攪拌處理，離心，過濾，收集濾液，得到變 性的蝎毒蛋白，所述的攪拌處理，其攪拌轉(zhuǎn)速為50~300rpm，攪拌時(shí)間為1~10h。；
[0013] 所述的變性緩沖液，其組成如下：50~200mmol/LTris，1~10mol/LGdn-HCl， 20~lOOmmol/LDTT，pH7~9,溶劑為水；所述的變性緩沖液的組成優(yōu)選為：80~ 120臟〇1/11^8,4~8111〇1/16(111-11(：1，40~60臟〇1/101'1'，？117.5~8.5 ;最優(yōu)選為： lOOmmol/LTris,6mol/LGdn-HCl,50mmol/LDTT,pH8.0〇
[0014] 其中，Tris為緩沖試劑，維持緩沖液pH值；Gdn-HCl為變性劑，能夠通過離子間的 相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白；DTT為還原劑，具有抗氧化作用，能保護(hù)蛋 白上的還原性基團(tuán)。
[0015] (2)純化變性的蝎毒蛋白；
[0016] (3)用復(fù)性緩沖液溶解變性的蝎毒蛋白，復(fù)性處理，得到復(fù)性的蝎毒蛋白，
[0017] 所述的復(fù)性緩沖液，其組成如下：50~200臟〇1/1似2冊0 4，10~100臟〇1/11^8， 0? 1 ~lmol/LL_Arg，1 ~5mmol/LEDTA，0. 1 ~5mmol/LGSH，0. 05 ~0? 5mmol/LGSSG， 5~20%v/v甘油，0? 01~5%v/vtritonX-100,pH7~9,溶劑為水，復(fù)性緩沖液的組 成優(yōu)選為：80 ~1 20mmo1/],Na2HPO4,40~BOmmo1/],Tris，pH7. 5 ~8. 5,0? 4 ~0? 6mol/ LL-Arg，1 ~3mmol/LEDTA，0. 5 ~I. 5mmol/LGSH，0. 05 ~0? 2mmol/LGSSG，5 ~10%v/ v甘油，〇?I~〇? 3%v/vtritonX-100 ;最優(yōu)選為：10Ommol/],Na2HPO4, 50mmol/LTris，pH 8.5,0.5mol/LL-Arg，2mmol/LEDTA，lmmol/LGSH，0.1mmol/LGSSG，5%v/v甘油，0.2%v/vtritonX-lOOo
[0018] 其中，Na2HPOjPTris為緩沖試劑，維持緩沖液pH值；L-Arg為助溶劑；EDTA 為金屬離子螯合劑；GSH和GSSG能夠提供氧化還原電子對，為二硫鍵的形成提供條件； tritonX-100是溫和去垢劑，能夠洗滌去除膜碎片和膜蛋白；甘油為蛋白穩(wěn)定劑。
[0019] 步驟（1)中，所述的蝎毒蛋白包涵體，是利用重組大腸桿菌發(fā)酵得到。
[0020] 其中，所述的重組大腸桿菌是將克隆有蝎毒蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得 到的。
[0021] 其中，所述的大腸桿菌為E.coliBL21(DE3)。
[0022] 其中，所述的表達(dá)質(zhì)粒為pET29a。
[0023] 其中，所述的克隆有竭毒蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒，在竭毒蛋白基因的5'端或3'端含 有His-tag，即表達(dá)得到的蝎毒蛋白的C端或N端含有His-tag。
[0024] 作為優(yōu)選，所述的克隆有竭毒蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒，在竭毒蛋白基因的5'端含有 His-tag，即表達(dá)得到的蝎毒蛋白的C端含有His-tag。
[0025] 本發(fā)明中所述的His-tag，是指由多個(gè)組氨酸組成的標(biāo)簽，優(yōu)選用6個(gè)組氨酸組成 的標(biāo)簽。
[0026] 分別在蝎毒蛋白基因的5'端或3'端增加6個(gè)組氨酸組成的標(biāo)簽（His-Tag)，表 達(dá)得到的蝎毒蛋白分別命名為CHls6-rAGAP、NHls6-rAGAP，所述的CHls6-rAGAP和NHls6-rAGAP對 腫瘤細(xì)胞生長的抑制活性有明顯差別，其中，CHls6-rAGAP對HepG2細(xì)胞的抑制率達(dá)到90%， 而NHls6-rAGAP在體外幾乎沒有抗腫瘤活性。分子動力學(xué)模擬表明，N端His-tag浮于融合 蛋白的表面，改變了rAGAP的表面電荷，使得表面靜電勢發(fā)生變化，而C端His-tag對AGAP 的三維結(jié)構(gòu)及表面電荷影響不大。
[0027] 步驟（2)是利用組氨酸親和層析柱純化得到變性的蝎毒蛋白。
[0028] 步驟（3)中，所述的復(fù)性處理，是將溶解有變性的蝎毒蛋白的復(fù)性緩沖液在4~ 25°C條件下保溫12~72h，優(yōu)選在15~25°C條件下保溫18~48h，最優(yōu)選在20°C條件下 保溫24h。
[0029] 上述的蝎毒蛋白的純化與復(fù)性方法制備得到的蝎毒蛋白也在本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
[0030] 上述蝎毒蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0031] 有益效果：本發(fā)明提供了一種高效分離純化重組蝎毒蛋白包涵體的方法，以及蝎 毒蛋白包涵體的復(fù)性方法。本發(fā)明解決了重組蝎毒素在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中收率低、蛋白 不能正確折疊以及生物學(xué)活性低等問題，通過本方法得到的重組蝎毒素比SUMO融合技術(shù) 表達(dá)的蝎毒素在小鼠體內(nèi)的生物學(xué)活性要高。采用本發(fā)明方法，以IL細(xì)菌培養(yǎng)物計(jì)算，最 終可以獲得可溶性蝎毒素約16mg，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的蛋白。應(yīng)用本 發(fā)明方法制備重組蝎毒素蛋白，提高了產(chǎn)率，節(jié)省成本，操作簡便，為蝎毒素的進(jìn)一步研究 和新藥開發(fā)提供了便利。
[0032] 通過該包涵體復(fù)性技術(shù)獲得的重組蝎毒素AGAP比之前文獻(xiàn)中報(bào)道的低溫誘導(dǎo)可 溶表達(dá)技術(shù)以及SUMO融合表達(dá)技術(shù)獲得的重組AGAP抗腫瘤效果更高，接近天然蝎毒素的 活性水平。
【附圖說明】
[0033] 圖1為構(gòu)建的pET29a_AGAP重組質(zhì)粒圖。
[0034] 圖2為CHls6-rAGAP的表達(dá)、純化以及復(fù)性結(jié)果分析。A圖為CHls6-rAGAP表達(dá)的 SDS-PAGE圖；泳道1 :未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌蛋白，泳道2 :37°C下lmmol/L的IPTG誘導(dǎo) 4h的全菌蛋白，泳道3 :超聲上清蛋白，泳道4、5 :超聲沉淀蛋白，泳道M:蛋白marker;B 圖為CHls6-rAGAP的純化及復(fù)