專利名稱：一種乳中β-酪蛋白含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳中(3-酪蛋白含量的檢測方法，尤其是一種利用毛細(xì)管電 泳檢測乳中(3-酪蛋白含量的方法，特別是關(guān)于毛細(xì)管電泳檢測乳中(3-酪蛋白含 量過程中樣品的處理步驟的改進(jìn)。
背景技術(shù)：
酪蛋白制品是乳品工業(yè)的主要產(chǎn)品之一，由于其具有優(yōu)良的功能特性和較 高的營養(yǎng)價(jià)值，因此在食品工業(yè)和其他工業(yè)上都得到了廣泛的應(yīng)用。酪蛋白具 有較高的營養(yǎng)價(jià)值，可添加到其他食品中強(qiáng)化蛋白質(zhì)。酪蛋白能夠在水中形成 膠體，具有一定的粘度和良好的持水特性，在冰淇淋生產(chǎn)中。添加酪蛋白酸鈉 做穩(wěn)定劑，具有增強(qiáng)脂肪乳化、保濕和改善粘度等作用。酪蛋白中存在著明顯 的疏水區(qū)和親水區(qū)，因此具有較好的乳化性和發(fā)泡性。近年來，對酪蛋白生理 功能及生物活性的研究日益增多，對酪蛋白采用各種方法改性制備改性產(chǎn)品也 越來越受到關(guān)注，因此酪蛋白改性制品的生產(chǎn)必將成為今后食品工業(yè)發(fā)展的一 大趨勢。
卩-酪蛋白在酪蛋白中含量僅次于(3-酪蛋白，它占酪蛋白的22%以上，占奶 中總蛋白量25%以上。P-酪蛋白含有209個(gè)氨基酸殘基，分子中有5個(gè)磷酸基。 分子量24000。至今己發(fā)現(xiàn)P-酪蛋白有七個(gè)變異型，即A1、 A2、 A3、 B、 C、 D、 E。在堿性條件下電泳，泳動速度依次為A1=A2=A3>B>D， E>C;在酸性 條件下為:OB:D〉A(chǔ)^E〉A(chǔ)2〉A(chǔ)3。在干酪的生產(chǎn)中，干酪的特有風(fēng)味與(3-酪蛋 白的分解有關(guān)。此外可作為生化試劑。因此準(zhǔn)確檢測出P-酪蛋白含量有非常重 要的意義。
目前，國內(nèi)尚未有P-酪蛋白含量檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。相關(guān)國 標(biāo)有DIN-10466—2001《牛奶和牛奶制品的全部蛋白中乳清蛋白含量的測定》、 DIN-10470-1999《牛奶和牛奶制品的全部蛋白質(zhì)中乳蛋白含量和酪蛋白含量測 定》、DIN—10472 —1996《牛奶和乳制品總蛋白量中乳蛋白和酪蛋白成分量測
定-電泳法》。
毛細(xì)管電泳儀是一類包括電泳、色譜及其交叉內(nèi)容的液相微分離技術(shù)。它 能快速精確檢測出牛奶中的摻假成分、抗生素、添加的功能性因子、乳清蛋白、 免疫球蛋白、酶、糖、添加劑和其他小分子的含量。毛細(xì)管電泳儀檢測最低濃
度能達(dá)到10-5 10-8 mol/L.該方法操作簡便、準(zhǔn)確，檢測到出結(jié)果時(shí)間僅為l-2h 左右。目前，毛細(xì)管電泳儀的應(yīng)用前景非常廣泛。
《毛細(xì)管電泳在牛乳中酪蛋白含量測定及摻假檢測方面的應(yīng)用》(《食品與 發(fā)酵工業(yè)》，2005年第31巻第1期，張東送、龐廣昌、高法國、張濤、陳慶森、 胡志和)公開了一種毛細(xì)管電泳法分離和檢測原料乳中酪蛋白的方法，該方法 離心處理原料乳來分離脂肪，但離心30min的時(shí)間較長，容易引起部分蛋白沉 淀或者脂肪殘留。此外，該方法還公開了一種樣品緩沖溶液，然而其對酪蛋白 的分離效果仍不夠理想。
《奶制品中蛋白質(zhì)測定的毛細(xì)管電泳法研究》，(《分析科學(xué)學(xué)報(bào)》，2006 年2月，第22巻第1期，唐萍、田晶、佘振寶、翁前鋒、許國旺)也公開了 一種使用毛細(xì)管電泳法檢測奶制品中酪蛋白的定量分析方法。
上述兩種方法均使用了較長的涂層毛細(xì)管柱，但較長的毛細(xì)管柱分離時(shí)間 也較長，涂層毛細(xì)管柱的價(jià)格相對較高、容易損壞、對使用環(huán)境要求苛刻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用毛細(xì)管電泳檢測乳中(3-酪蛋白 含量的方法，以提高(3-酪蛋白的分離效果，縮短檢測時(shí)間，降低檢測成本。
本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種乳中P-酪蛋白含量的檢測方 法，以提供一種改進(jìn)的樣品處理步驟。
本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是通過采用較短的未涂層毛細(xì)管柱，降低 檢測成本，提高檢測速度。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種乳中p-酪蛋白含量的檢測方法， 該方法包括以下步驟將需要檢測的乳樣品與樣品緩沖液進(jìn)行混合處理，將混 合處理之后的樣品通過毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測，所述樣品緩沖液的配制方法 是三甲基氨基甲垸緩沖液加3-嗎啉代丙烷磺酸、乙二胺四乙酸二鈉、尿素， 處理樣品時(shí)再添加(3-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素。
優(yōu)選的，樣品緩沖液的配制方法為160mmol/L三甲基氨基甲烷緩沖液加
40mmol/L3-嗎啉代丙烷磺酸、60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、7mol/L尿素，處 理樣品時(shí)再添加5ul/ml的P-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素0.05。/。，調(diào)節(jié)pH值 至8.5。
優(yōu)選的，在所述乳樣品與所述樣品緩沖液混合前，對乳樣品進(jìn)行離心處理， 離心的條件為2000-6000r/min、離心5-15min，優(yōu)選4500r/min、 10min。離心 的目的是去除脂肪，避免脂肪顆粒對分離峰值和分離時(shí)間的影響。
優(yōu)選的，在通過所述毛細(xì)管電泳儀對所述混合處理之后的樣品進(jìn)行檢測 前，將所述混合處理之后的樣品以超聲波清洗l-10min。超聲波清洗可防止緩 沖液中有氣體，緩沖液中含有氣體將影響電流，使其忽高忽低，影響檢測結(jié)果。
優(yōu)選地，所述檢測方法進(jìn)一步包括如下步驟l)將P-酪蛋白溶于所述樣品 緩沖液中，制備得到多個(gè)不同含量P-酪蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶 液通過所述毛細(xì)管電泳儀分別檢測得到(3-酪蛋白含量與檢測結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn) 曲線；2)將通過所述毛細(xì)管電泳儀檢測獲得的所述乳樣品的檢測結(jié)果與所述 標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，得到所述乳樣品中(3-酪蛋白的含量。
上述步驟l)中，在所述樣品緩沖液中溶解P-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制成 4mg/ml、 2mg/ml、 lmg/ml、 0.5mg/ml、 0.25mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
所述乳樣品的上清液或所述P-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與所述樣品緩沖液使用漩 渦混合器搖勻。該儀器能混合樣品比較均勻，同時(shí)對樣品不會產(chǎn)生任何破壞作 用。
上述毛細(xì)管電泳儀檢測參數(shù)如下檢測溫度15-40°C，毛細(xì)管柱直徑 25-75pm、長度20-600 mm, 二極管陣列檢測器或紫外光檢測器，壓力進(jìn)樣或 電動進(jìn)樣，壓力為0-lpsi，進(jìn)樣時(shí)間ls-20s，檢測溫度為15-40°C，工作電壓 7-30 kV;優(yōu)選參數(shù)為檢測溫度為30'C，毛細(xì)管柱直徑25-75(im、長度20mm， 壓力進(jìn)樣，壓力為0.5psi，進(jìn)樣時(shí)間5s-20s，工作電壓M-2SkV。
上述毛細(xì)管柱可使用涂層石英毛細(xì)管柱也可以使用未涂層的石英毛細(xì)管柱。
優(yōu)選的，使用涂層石英毛細(xì)管柱時(shí)，上述電泳工作電壓為20kV，使用未 涂層石英毛細(xì)管柱時(shí)，電泳工作電壓為25kV。
優(yōu)選的，上述毛細(xì)管電泳檢測時(shí)電泳模式為區(qū)帶電泳或凝膠電泳，其電泳 緩沖液為無機(jī)鹽緩沖液，pH2.0-9.0，優(yōu)選磷酸鹽、硼酸或檸檬酸緩沖液。
上述的檢測結(jié)果為樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶的分析軟件， 積分各峰的峰高或峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，計(jì)算出樣品濃度，再乘稀釋倍數(shù)， 即得實(shí)際濃度。
本發(fā)明所提供的檢測方法與現(xiàn)有的方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)
1. 樣品離心時(shí)間短，不會引起部分蛋白沉淀或者脂肪殘留，其離心分離效 果較好；
2. 樣品緩沖液能有效防止蛋白質(zhì)吸附于毛細(xì)管管壁上，能準(zhǔn)確反映出蛋白 質(zhì)實(shí)際含量；同時(shí)能使各種蛋白保持獨(dú)立狀態(tài)，去除相互干擾和聚集，與現(xiàn)有 技術(shù)相比，明顯提高蛋白質(zhì)分離效果。更具體的說與現(xiàn)有技術(shù)相比，其尿素 含量的提高提高了吸光度值，分離效果好，分離吸光度值增加了 50%左右；(3-巰基乙醇作為電荷表面活性劑，使分離效果明顯提高；使用甲基羥乙基纖維素 作為動態(tài)網(wǎng)絡(luò)形成劑其分離效果比使用甲基羥乙基纖維素更佳。
3. 本發(fā)明的方法可以使用涂層石英毛細(xì)管柱也可以使用未涂層的石英毛細(xì) 管柱，使用未涂層石英毛細(xì)管柱價(jià)格低廉、堅(jiān)韌耐用，對使用環(huán)境要求底，可 以降低檢測成本。
4. 本發(fā)明的方法可以使用較短的石英毛細(xì)管柱，其分離速度較快。
5. 本發(fā)明的方法線性回歸方程相關(guān)系數(shù)〉0.9 8 ，其線性范圍在 0.01mg/ml-2mg/ml，最低檢出限為0.15ng，最低檢出濃度為0.005mg/ml，精確 度達(dá)90%以上，標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率達(dá)到90%以上，樣品回收率達(dá)70%以上，能有 效檢測出樣品中的P-酪蛋白的含量。


圖1是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的P-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖2是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的P-酪蛋白檢測分離圖譜； 圖3是本發(fā)明的另一實(shí)施例中的P-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖4是本發(fā)明的另一實(shí)施例中的(3-酪蛋白檢測分離圖譜； 圖5是本發(fā)明的又一實(shí)施例中的(3-酪蛋白檢測分離圖譜； 圖6是本發(fā)明的又一實(shí)施例中的(3-酪蛋白檢測分離圖譜； 圖7是不同離心轉(zhuǎn)速下酪蛋白檢測分離圖譜； 圖8是不同尿素濃度下酪蛋白檢測分離圖譜；
圖9是分別使用e-巰基乙醇和DL-二硫蘇糖醇作為電荷表面活性劑的酪 蛋白檢測分離圖譜；
圖10是使用羥丙基甲基纖維素和甲基羥乙基纖維素的酪蛋白檢測分離圖譜。
具體實(shí)施例方式
下面將結(jié)合具體實(shí)施方案對本發(fā)明的方法做更詳細(xì)的說明。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)當(dāng)理解，下述實(shí)施例均用于對本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍進(jìn)行實(shí)例性的描
述，以此概括本發(fā)明的各參數(shù)的相對范圍，因而不能將之理解為對本發(fā)明的一 種具體限制。
實(shí)施例l檢測牛乳中P-酪蛋白含量(使用涂層石英毛細(xì)管柱)
1. 樣品緩沖液的配置160mmol/L三甲基氨基甲垸緩沖液中加40mmol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，7mol/L尿素，處理樣品時(shí) 添加5ul/ml的P-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素0.05%,使用0.1M氫氧化鈉溶 液把pH值調(diào)至8.5。
2. 電泳緩沖液的配置0.32mol/L檸檬酸，20 mmol/L檸檬酸三鈉，7mol/L 尿素，羥丙基甲基纖維素0.05%。
3. 高壓毛細(xì)管電泳儀(貝克曼庫爾特、P/ACEMDQ)，檢測參數(shù)檢測溫 度控制在3(TC，使用直徑為50pm、長度為20mm的涂層石英毛細(xì)管柱，二極 管陣列檢測器(DAD檢測器)，壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力為0.5psi，進(jìn)樣時(shí)間為5s， 工作電壓為20kV。
4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定將(3-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶于樣品緩沖液中，配制成濃度分 別為4mg/ml、 2mg/ml、 lmg/ml、 0.5mg/ml、 0.25mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用漩渦 混合器搖勻，精確提取40ul處理后的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入樣品管中，之后使用前述 高壓毛細(xì)管電泳儀測定。利用毛細(xì)管電泳儀自帶軟件32KaratTM8.0獲得的圖譜 各峰積分后的峰面積分別為1864251、 970046、 479526、 241356、 121123，利 用高壓毛細(xì)管電泳儀自帶32KaratTM8.0軟件得出標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示(圖中的 橫坐標(biāo)代表采樣值，單位為AU;縱坐標(biāo)代表擬合值，單位ml/L)，其線性回 歸相關(guān)系數(shù)為0.9991，最低檢出限為O.Olug，最低檢出含量為0.25mg/ml，標(biāo) 準(zhǔn)樣品回收率達(dá)92%。分離前，把電泳緩沖液加入到儀器所特有的容量瓶中， 待檢測。
5. 樣品處理和檢測取牛奶樣品加入15ml的離心管中，在4500r/min離心 條件下離心10min。準(zhǔn)確提取離心處理之后的牛乳樣品上清液100ul置入凍存 管(或其他容器)。提取900ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用 漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理后的樣品加入樣品管中，放置于超聲波 清洗機(jī)3min，之后使用高壓毛細(xì)管電泳儀測定。
6. 樣品定量讀數(shù)儀器檢測后得到樣品分離的圖譜，如圖2所示(圖中的 橫坐標(biāo)代表分離時(shí)間，單位為min;縱坐標(biāo)代表吸光值，單位AU)，利用高壓 毛細(xì)管電泳儀所自帶的32KaratTM8.0軟件，積分(3-酪蛋白的峰面積為169572， 利用毛細(xì)管電泳儀自帶32KaratTM8.0軟件自動套入上述圖1所示標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 計(jì)算出試樣濃度為0.7mg/ml，再乘稀釋倍數(shù)10，即得實(shí)際濃度為7mg/ml，所 以該奶樣含有的P-酪蛋白濃度為7g/L。
實(shí)施例2檢測牛乳中P-酪蛋白含量(使用未涂層石英毛細(xì)管柱)
1. 樣品緩沖液的配置160mmol/L三甲基氨基甲烷緩沖液中加40mmol/L 3-嗎啉代丙垸磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，7mol/L尿素，處理樣品時(shí) 添加5ul/ml的P-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素0.05%。使用0.1M氫氧化鈉調(diào) 至pH值為8.5。
2. 電泳緩沖液的配置0.32mol/L檸檬酸，20 mmol/L檸檬酸三鈉，7mol/L 尿素，羥丙基甲基纖維素0.05%。
3. 毛細(xì)管電泳儀(貝克曼庫爾特、P/ACEMDQ)，檢測參數(shù)檢測溫度控 制在30。C，使用直徑為75pm、長度為600mm的未涂層石英毛細(xì)管柱，DAD 檢測器，壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力為0.5psi，進(jìn)樣時(shí)間為5s，工作電壓為25kV。
4. 校準(zhǔn)曲線的制定將P-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶于樣品緩沖液中，配制成濃度分 別為4mg/ml、 2mg/ml、 lmg/ml、 0.5mg/ml、 0.25mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用漩渦 混合器搖勻，精確提取40ul處理后的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入樣品管中，使用高壓毛細(xì) 管電泳儀測定。檢測得到的圖譜各峰積分后的峰面積分別為，1764251、 870046、 409512、 211035、 98168，利用32Karat 8.0分析軟件得出標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所 示，其線性回歸相關(guān)系數(shù)為0.9998，最低檢出線為O.Olug，最低檢出含量為 0.25mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率達(dá)90%。分離前，把電泳緩沖液加入到儀器所特 有的容量瓶中，待檢測。圖中的橫坐標(biāo)代表采樣值，單位為AU;縱坐標(biāo)代表
擬合值，單位ml/L。
5. 樣品處理和檢測取奶樣品加入15ml的離心管中，在4500r/min離心 條件下離心5min。準(zhǔn)確提取離心處理之后的牛乳樣品上清液100ul置入凍存管
(或其他容器)。提取900ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用漩 渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機(jī) 3min，之后使用毛細(xì)管電泳儀測定。
6. 樣品定量讀數(shù)儀器檢測后得到樣品分離的圖譜，如圖4所示，運(yùn)用毛 細(xì)管電泳儀所帶的分析軟件，積分P-酪蛋白的峰面積為1492167，利用分析軟件 自動套入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計(jì)算出試樣濃度為0.76mg/ml，再乘稀釋倍數(shù)10，即 得實(shí)際濃度為7.6mg/ml，所以該奶樣含有的p-酪蛋白濃度為7.6g/L。
實(shí)施例3 —種巴氏滅菌乳中p-酪蛋白含量的檢測方法
使用與實(shí)施例1相同的樣品緩沖液、電泳緩沖液、以及高壓毛細(xì)管電泳儀， 使用與實(shí)施例1相同的儀器檢測參數(shù)。采用實(shí)施例1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣品處理和檢測步驟為把巴氏滅菌乳樣品加入15ml的離心管中，在 4500r/min離心條件下離心10min。準(zhǔn)確提取離心處理之后的巴氏滅菌乳樣品上 清液100ul置入凍存管(或其他容器)。提取300ul樣品緩沖液加入凍存管(或 其他容器)，并使用漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中， 放置于超聲波清洗機(jī)3min，之后使用毛細(xì)管電泳儀測定。
樣品定量讀數(shù)儀器檢測后得到樣品分離的圖譜，如圖5所示，運(yùn)用毛細(xì) 管電泳儀所帶的分析軟件，積分(3-酪蛋白的峰面積為728879,利用分析軟件自 動套入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計(jì)算出試樣濃度為1.52mg/ml，再乘稀釋倍數(shù)5，即得 實(shí)際濃度為7.6mg/ml，所以該奶樣含有的|3-酪蛋白濃度為7.6g/L。
實(shí)施例4 一種UHT滅菌乳中p-酪蛋白含量的檢測方法
使用與實(shí)施例1相同的樣品緩沖液、電泳緩沖液、以及高壓毛細(xì)管電泳儀， 使用與實(shí)施例相同的儀器檢測參數(shù)。采用實(shí)施例1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣品處理和檢測步驟為把UHT滅菌乳樣品加入15ml的離心管中，在 4500r/min離心條件下離心10min。準(zhǔn)確提取離心處理之后的UHT滅菌乳樣品
上清液50ul置入凍存管(或其他容器)。提取950ul樣品緩沖液加入凍存管(或 其他容器)，并使用漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中， 放置于超聲波清洗機(jī)3min，之后使用毛細(xì)管電泳儀測定。
樣品定量讀數(shù)儀器檢測后得到樣品分離的圖譜，如圖6所示，運(yùn)用毛細(xì)管 電泳儀所帶的分析軟件，積分P-酪蛋白的峰面積為163804,利用分析軟件自動套 入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程內(nèi)計(jì)算出試樣濃度為0.4mg/ml，再乘稀釋倍數(shù)20，即得實(shí)際 濃度為8mg/ml，所以該奶樣含有的p-酪蛋白濃度為8g/L。
實(shí)施例5 —種原料乳中P-酪蛋白含量的檢測方法
樣品緩沖液、電泳緩沖液以及指定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法與實(shí)施例l相同。高壓 毛細(xì)管電泳儀(貝克曼庫爾特、P/ACEMDQ)，檢測參數(shù)溫度控制在15'C， 使用直徑為25pm、長度為60mm的未涂層石英毛細(xì)管柱，紫外光檢測器，電 動進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力為Opsi，進(jìn)樣時(shí)間為20s，工作電壓為7kV。
檢測得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸相關(guān)系數(shù)為0.9996，最低檢出限為O.Olug， 最低檢出含量為0.15mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率達(dá)90%，樣品回收率70%。
樣品處理和檢測取原料乳樣品加入15ml的離心管中，在2000r/min離心 條件下離心15min。準(zhǔn)確提取離心處理之后的原料乳樣品上清液40ul置入凍存 管(或其他容器)。提取800ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用 漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗 機(jī)lmin，之后使用毛細(xì)管電泳儀測定。
樣品定量讀數(shù)儀器檢測后得到樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶 的分析軟件，積分P-酪蛋白的峰面積為428879，利用分析軟件自動套入標(biāo)準(zhǔn)曲線 方程內(nèi)計(jì)算出試樣濃度為0.37mg/ml，再乘稀釋倍數(shù)21，即得實(shí)際濃度為 7.8mg/ml，所以該奶樣含有的p-酪蛋白濃度為7.8g/L。
實(shí)施例6 —種原料乳中P-酪蛋白含量的檢測方法
樣品緩沖液、電泳緩沖液以及指定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法與實(shí)施例l相同。高壓 毛細(xì)管電泳儀(貝克曼庫爾特、P/ACEMDQ)，檢測參數(shù)溫度控制在15"C， 使用直徑為50iim、長度為60mm的未涂層石英毛細(xì)管柱，紫外光檢測器，壓 力進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力為lpsi，進(jìn)樣時(shí)間為ls，工作電壓為30kV。檢測得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸相關(guān)系數(shù)為0.9991，最低檢出限為0.01ug， 最低檢出含量為0.15mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率達(dá)92%，樣品回收率90%。
樣品處理和檢測取原料乳樣品加入15ml的離心管中，在6000r/min離心 條件下離心5min。準(zhǔn)確提取離心處理之后的原料乳樣品上清液100ul置入凍存 管(或其他容器)。提取900ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用 漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗 機(jī)10min，之后使用毛細(xì)管電泳儀測定。
樣品定量讀數(shù)儀器檢測后得到樣品分離的圖譜，運(yùn)用毛細(xì)管電泳儀所帶 的分析軟件,積分P-酪蛋白的峰面積為838579，利用分析軟件自動套入標(biāo)準(zhǔn)曲線 方程內(nèi)計(jì)算出試樣濃度為0.79mg/ml，再乘稀釋倍數(shù)10，即得實(shí)際濃度為 7.9mg/ml，所以該奶樣含有的P-酪蛋白濃度為7.9g/L。
實(shí)施例7對比實(shí)施例
1. 不同離心轉(zhuǎn)速下分離效果對比
按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行試驗(yàn)，調(diào)整離心轉(zhuǎn)速，結(jié)果如圖7所示(3-酪蛋 白分離效果好到差的順序依次為4500 r/min、 4000 r/min禾Q 3500 r/min。
2. 不同樣品緩沖液組成時(shí)分離效果的對比
1) 不同尿素含量下，分離效果對比，具體實(shí)驗(yàn)步驟為固定其他成分，分 別使用尿素濃度為7mol/L和6mol/L的樣品緩沖液處理樣品，檢測原奶，得到 P -酪蛋白如圖8所示，尿素含量為7mol/L的吸光值比6mol/L的吸光值要高， 而且整個(gè)圖譜清晰、分離效果更好，分離吸光值增加50%左右。
2) 不同電荷表面活性劑的分離效果對比，固定其他成分，分別使用P-巰 基乙醇和DL-二硫蘇糖醇(DTT)，以上兩種物質(zhì)均為電荷表面活性劑。但是 P-巰基乙醇功效比DTT大六倍，很顯然功能越強(qiáng)分離效果越好。檢測原奶后 得到的圖譜如圖9所示，可見使用P-巰基乙醇的圖譜明顯比使用DTT的分離 效果好。
3) 使用羥丙基甲基纖維素和甲基羥乙基纖維素的分離效果對比，兩者均 為動態(tài)網(wǎng)絡(luò)形成劑。分離巴氏殺菌乳，得到的分離圖譜如圖IO所示可以看 到，使用羥丙基甲基纖維素比使用了甲基羥乙基纖維素分離效果更佳。
權(quán)利要求
1.一種利用毛細(xì)管電泳檢測乳中β-酪蛋白含量的方法，包括以下步驟將需要檢測的乳樣品與樣品緩沖液進(jìn)行混合處理，將混合處理之后的樣品通過毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測，其特征在于，所述樣品緩沖液的配制方法是三甲基氨基甲烷緩沖液加3-嗎啉代丙烷磺酸、乙二胺四乙酸二鈉、尿素，處理樣品時(shí)再添加β-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述樣品緩沖液的配制方法是160mmol/L三甲基氨基甲烷緩沖液加40mmol/L3-嗎啉代丙烷磺酸、 60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、7mol/L尿素，處理樣品時(shí)再添加5ul/ml的卩-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素0.05%，調(diào)節(jié)pH值至8.5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，在所述乳樣品與所述 樣品緩沖液進(jìn)行混合處理前，將所述乳樣品進(jìn)行離心處理，離心的條件為 轉(zhuǎn)速2000-6000r/min、離心5-15min;優(yōu)選轉(zhuǎn)速4500r/min、離心時(shí)間10min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，在通過所述毛細(xì)管電泳儀 對所述混合處理之后的樣品進(jìn)行檢測前，將所述混合處理之后的樣品以超 聲波清洗l-10min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的檢測方法，其特征在于，在所述乳樣品與所 述樣品緩沖液進(jìn)行混合處理的步驟中，取所述乳樣品或離心后的的上清液 與所述樣品緩沖液進(jìn)行混合處理，乳樣品的上清液與所述樣品緩沖液的混 合比例為l:(3-20)(v/v)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，該方法進(jìn)一步包括如下步 驟1)將(3-酪蛋白溶于所述樣品緩沖液中，制備得到多個(gè)不同含量(3-酪蛋 白的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對所述多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液通過所述毛細(xì)管電泳儀分別檢測得 到(3-酪蛋白含量與檢測結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)將通過所述毛細(xì)管電泳儀 檢測獲得的所述乳樣品的檢測結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，得到所述乳樣品 中P-酪蛋白的含量。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，在所述步驟l)中，在所述 樣品緩沖液中溶解P-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制成4mg/ml、 2mg/ml、 lmg/ml、 0.5mg/ml、 0.25mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述乳樣品的上清液或所述卩-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與所述樣品緩沖液使用漩渦混合器搖勻。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的檢測方法，其特征在于，所述毛細(xì)管電泳儀的 檢測參數(shù)為檢測溫度15-40°C，毛細(xì)管柱直徑25-75pm、長度20-600 mm， 二極管陣列檢測器或紫外光檢測器，壓力進(jìn)樣或電動進(jìn)樣，壓力為0-lpsi， 進(jìn)樣時(shí)間ls-20s，檢測溫度為15-40°C，工作電壓7-30kV;優(yōu)選參數(shù)為 檢測溫度為30。C，毛細(xì)管柱直徑25-75pm、長度20mm，壓力進(jìn)樣，壓力 為0.5psi，進(jìn)樣時(shí)間5s-20s，工作電壓15-25 kV。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述毛細(xì)管柱為涂層石英 毛細(xì)管柱，所述工作電壓為20kV;或所述毛細(xì)管柱為未涂層石英毛細(xì)管柱， 所述工作電壓為25kV。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用毛細(xì)管電泳檢測乳中β-酪蛋白含量的方法，包括以下步驟將需要檢測的乳樣品與樣品緩沖液進(jìn)行混合處理，將混合處理之后的樣品通過毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測，所述樣品緩沖液的配制方法是三甲基氨基甲烷緩沖液加3-嗎啉代丙烷磺酸、乙二胺四乙酸二鈉、尿素，處理樣品時(shí)再添加β-巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素。其中乳樣品處理的步驟包括乳樣品的離心處理，取離心處理后的樣品上清液與樣品緩沖液混合，再經(jīng)超聲波清洗。本發(fā)明的方法分離效果好、速度快，可使用未涂層毛細(xì)管柱。本發(fā)明的方法線性回歸方程相關(guān)系數(shù)＞0.98，最低檢出線為0.15ng，最低檢出濃度為0.005mg/ml，精確度達(dá)90％以上。
文檔編號G01N27/447GK101339158SQ200810146950
公開日2009年1月7日 申請日期2008年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日
發(fā)明者劉衛(wèi)星, 孫國慶, 康小紅, 胡新宇 申請人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司