毒素基因及其使用方法
【專利說明】毒轟基因及其使用方法
[0001] 本申請是申請人于2009年6月25日提交的題為"毒素基因及其使用方法"的中 國專利申請200980122563. 5號的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域。所提供的是編碼殺蟲蛋白的新基因。運(yùn)些蛋白質(zhì)和 編碼它們的核酸序列用于制備殺蟲制劑和用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗害蟲植物。
【背景技術(shù)】
[0003] 蘇云金芽抱桿菌度acillus thuringiensis)是革蘭氏陽性的產(chǎn)芽抱±壤細(xì)菌，其 特征在于其產(chǎn)生晶狀包含體的能力，該晶狀包含體特異性地對某些目和種的昆蟲有毒，但 對植物和其他非祀標(biāo)生物體無害。由于此原因，包含蘇云金芽抱桿菌菌株或它們的殺蟲蛋 白的組合物可W用作環(huán)境可接受的殺蟲劑來控制農(nóng)業(yè)昆蟲害蟲或各種人或動物疾病的昆 蟲媒介。
[0004] 源自蘇云金芽抱桿菌的晶體（化y)蛋白質(zhì)（5-內(nèi)毒素）具有主要針對鱗翅目 (Lepidopteran)、雙翅目（Dipteran)和銷翅目（Coleopteran)幼蟲的有效殺蟲活性。運(yùn)些 蛋白質(zhì)還已顯示針對膜翅目（Hymenoptera)、同翅目（Homoptera)、風(fēng)目任hthiraptera)、 食毛目（Mallo地aga)和婢蛾亞綱（Acari)害蟲目，W及其他無脊椎動物目如線形動物口 (化mathelminthes)、扁形動物（Platyhelminthes)和肉鞭蟲口（Sarcomastigo巧hora) 的活性（Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc. , New York, N.Y.中的 FeitelsonQggS^he Bacillus Hiuringiensis family tree)。最初主要根據(jù)運(yùn)些蛋白質(zhì) 的殺蟲活性將它們分類為化W至化八。主要的種類是鱗翅目（Lepidoptera)特異的（I)、 鱗翅目和雙翅目值iptera)特異的（II)、銷翅目（Coleoptera)特異的（III)、雙翅目特異 的（IV)和線蟲類特異的（V)和（VI)。進(jìn)一步將運(yùn)些蛋白質(zhì)分類進(jìn)入亞家族；為各家族內(nèi) 更高度相關(guān)的蛋白質(zhì)指定各字母如化714、化718、化71(：等。各分部內(nèi)還更接近地相關(guān)的蛋 白質(zhì)命名為如化ylCl、化ylC2等。
[0005] 最近描述了基于氨基酸序列同源性而非昆蟲祀特異性的化y基因的新命名法 (Crickmore 等（1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813)。在此新分類中，為各毒素指 定合并了初級等級（阿拉伯?dāng)?shù)字）、二級等級（大寫字母）、=級等級（小寫字母）和四級 等級（另一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字）的唯一的名稱。在此新分類中，在初級等級中已將羅馬數(shù)字調(diào) 換為阿拉伯?dāng)?shù)字。序列同一性低于45%的蛋白質(zhì)具有不同的初級等級，二級等級和=級等 級的標(biāo)準(zhǔn)分別是78 %和95%。
[0006] 晶體蛋白質(zhì)直到被攝入并在昆蟲中腸中溶解時(shí)才顯示殺蟲活性。昆蟲消化道中 的蛋白酶將攝入的前毒素水解為活性毒性分子。（H6化e和Whitel巧（1989)Microbiol. Rev. 53:242-255)。該毒素與祀標(biāo)幼蟲中腸中的頂刷狀緣受體結(jié)合并插入頂膜（apical membrane)產(chǎn)生離子通道或管孔，導(dǎo)致幼蟲死亡。
[0007] 5 -內(nèi)毒素一般具有5個(gè)保守序列域（sequence domain)和3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（見 例如 de Maagd 等（2001)Trends Genetics 17:193-199)。第一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域由 7 個(gè) a 螺 旋組成并設(shè)及膜插入和管孔形成。結(jié)構(gòu)域II由W希臘鑰匙構(gòu)型排列的3個(gè)P片層組成， 而結(jié)構(gòu)域III由"薄卷餅"型的2個(gè)反平行P片層組成（de Maagd等，2001，上文）。結(jié)構(gòu) 域II和III設(shè)及受體識別和結(jié)合，因此認(rèn)為它們是毒素特異性決定子。
[0008] 基于蘇云金芽抱桿菌的殺蟲劑的密集使用已經(jīng)在菜蛾（Plutella x^ostella)田 間群體中引起了抗性（Ferr6 和 Van Rie(2002)Annu. Rev. Entomol.47:501-533)。最常見的 抗性機(jī)制是毒素與其一種或多種特異性中腸受體結(jié)合的減弱。運(yùn)還可W賦予對共用同一受 體的其他毒素的交叉抗性（Ferr6和Van Rie(2002))。
[000引發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明提供用于賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子害蟲抗性的組合物和方 法。組合物包含編碼5-內(nèi)毒素多膚序列的核酸分子、包含那些核酸分子的載體和包含載 體的宿主細(xì)胞。組合物還包含該內(nèi)毒素的多膚序列和那些多膚的抗體。該核巧酸序列可W 用于用來在生物體（包含微生物和植物）中轉(zhuǎn)化和表達(dá)的DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中。核巧酸 或氨基酸序列可W是設(shè)計(jì)用于在包含但不限于微生物或植物的生物體中表達(dá)的合成序列。 組合物還包含轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。
[0011] 具體而言，提供對應(yīng)于5-內(nèi)毒素核酸序列的分離的核酸分子。此外，涵蓋對應(yīng) 于該多核巧酸的氨基酸序列。具體而言，本發(fā)明提供編碼包含編碼SEQ ID N0:61-121和 133-141中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的核巧酸序列的分離的核酸分子，或SEQ ID N0:l-60 和124-132中任一所示的核巧酸序列，W及其變體和片段。還涵蓋與本發(fā)明的核巧酸序列 互補(bǔ)的核巧酸序列，或與本發(fā)明的序列雜交的核巧酸序列。
[0012] 本發(fā)明的組合物和方法用于產(chǎn)生具有殺蟲劑抗性的生物體，尤其是細(xì)菌和植物。 運(yùn)些生物體和從它們衍生的組合物是為了農(nóng)業(yè)目的而希望得到的。本發(fā)明的組合物還用于 產(chǎn)生改變的或改進(jìn)的具有殺蟲活性的5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)，或用于檢測5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)或 核酸在產(chǎn)物或生物體中的存在。
[001引發(fā)明詳述
[0014] 本發(fā)明設(shè)及用于在生物體，尤其是植物或植物細(xì)胞中調(diào)節(jié)害蟲抗性的組合物和方 法。該方法設(shè)及用編碼本發(fā)明的5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的核巧酸序列轉(zhuǎn)化生物體。具體而言， 本發(fā)明的核巧酸序列可用于制備具有殺蟲活性的植物和微生物。因此，提供轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植 物、植物細(xì)胞、植物組織和種子。組合物是蘇云金芽抱桿菌5-內(nèi)毒素的核酸和蛋白質(zhì)。運(yùn) 些序列用于構(gòu)建表達(dá)載體用于隨后轉(zhuǎn)化進(jìn)入目的生物體，作為用于分離其他5-內(nèi)毒素基 因的探針，和用于通過本領(lǐng)域已知的方法，如結(jié)構(gòu)域交換或DNA改組產(chǎn)生改變的殺蟲蛋白。 運(yùn)些蛋白質(zhì)用于控制或殺死鱗翅目、銷翅目和線蟲類害蟲群體，并用于產(chǎn)生具有殺蟲活性 的組合物。
[0015] " 5 -內(nèi)毒素"指具有針對一種或多種害蟲的毒性活性的源自蘇云金芽抱桿菌的毒 素，或與運(yùn)種蛋白質(zhì)具有同源性的蛋白質(zhì)，所述一種或多種害蟲包含但不限于鱗翅目、雙翅 目和銷翅目的成員或線蟲動物口（Nematoda地如11111)的成員。在一些情況下，已從包含雙 酶梭菌（Clostridium bifermentans)和日本甲蟲類芽抱桿菌（Paenibacillus popilliae) 的其他生物體分離了 5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)。5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)包含從本文公開的全長核巧酸 序列推斷的氨基酸序列，和由于使用其他下游起始位點(diǎn)或由于產(chǎn)生具有殺蟲活性的較短蛋 白質(zhì)的加工而比全長序列短的氨基酸序列。加工可w發(fā)生在表達(dá)該蛋白質(zhì)的生物體中，或 該蛋白質(zhì)被攝入后發(fā)生在害蟲體內(nèi)。
[0016] 5 -內(nèi)毒素包含鑒定為cryl至cry43、巧tl和巧t2和切t-樣毒素的蛋白質(zhì)。目 前已知超過250種具有大范圍的特異性和毒性的5-內(nèi)毒素。全面的列表見化ickmore等 (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813,定期更新見 WWW. biols. SUSX. ac. uk/Home/ Neil_Crickmore/Bt/index 上的 Crickmore 等（2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomencl曰ture"〇
[0017] 本文所提供的是賦予殺蟲活性的新的分離的核巧酸序列。還提供5 -內(nèi)毒素蛋白 質(zhì)的氨基酸序列。從該基因翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)允許細(xì)胞控制或殺死將其攝入的害蟲。
[001引 分離的核酸分子及其巧體巧片段
[0019] 本發(fā)明的一個(gè)方面設(shè)及包含編碼5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)和多膚或其生物學(xué)活性部分 的核巧酸序列的分離的或重組的核酸分子，W及能夠用作雜交探針來鑒定5 -內(nèi)毒素編碼 核酸的核酸分子。本文所用的術(shù)語"核酸分子"旨在包含DNA分子（例如重組DNA、cDNA或 基因組DNA)和RNA分子（例如mRNA) W及用核巧酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。核 酸分子可W是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。
[0020] "分離的"或"純化的"核酸分子或蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分基本上游離于其他 細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基（通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)），或基本上游離于化學(xué)品前體或其他化學(xué)品（化 學(xué)合成時(shí)）。優(yōu)選地，"分離的"核酸游離于衍生該核酸的生物體的基因組DNA中天然位于 該核酸側(cè)翼（即位于該核酸的5'和3'端的序列）的序列（優(yōu)選蛋白質(zhì)編碼序列）。為 了本發(fā)明的目的，當(dāng)用來指核酸分子時(shí)，"分離的"排除了分離的染色體。例如，在各種實(shí)施 方案中，分離的5 -內(nèi)毒素編碼核酸分子可W包含少于約5化、地b、3化、2化、化b、0. 5化或 0. 1化在衍生該核酸的細(xì)胞基因組DNA中天然位于該核酸分子側(cè)翼的核巧酸序列?；旧?游離于細(xì)胞物質(zhì)的5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)包含具有少于約30%、20%、10%或5% (按干重計(jì)） 的非5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)（本文還稱之為"污染蛋白質(zhì)"）的蛋白質(zhì)制劑。
[002。 編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核巧酸序列包含SEQ ID NO: 1-60和124-132中所示的序 列及其變體、片段和互補(bǔ)序列。"互補(bǔ)序列"是指與給定的核巧酸序列充分互補(bǔ)，使得其可W 與該給定的核巧酸序列雜交從而形成穩(wěn)定的雙鏈體的核巧酸序列。由該核巧酸序列編碼的 5 -內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的對應(yīng)的氨基酸序列示于SEQ ID N0:61-121和133-141。
[0022] 本發(fā)明還涵蓋是運(yùn)些5-內(nèi)毒素編碼核巧酸序列的片段的核酸分子。"片段"是 指編碼5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的核巧酸序列的部分。核巧酸序列的片段可W編碼5-內(nèi)毒素 蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分，或者它可W是用下文所公開的方法可W用作雜交探針或PCR引 物的片段。取決于預(yù)期的用途，是5-內(nèi)毒素核巧酸序列的片段的核酸分子包含至少50、 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、 1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、 2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、 2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350 個(gè)郵連核巧酸，或高達(dá)存在于本 文所公開的全長5-內(nèi)毒素編碼核巧酸序列中的核巧酸的數(shù)目。"郵連"核巧酸是指彼此 相鄰的核巧酸殘基。本發(fā)明的核巧酸序列的片段可編碼保留5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的生物學(xué) 活性并因此保留殺蟲活性的蛋白質(zhì)片段。"保留活性"是指該片段可具有至少約30%、至少 約50%、至少約70%、80%、90%、95%或更高的5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的殺蟲活性。測量殺蟲 活性的方法為本領(lǐng)域熟知。見例如Czapla和Lang (1990) J. Econ.化tomol. 83:2480-2485 ; An化ews 等（1988) Biochem. J. 252:199-206 sMarrone 等（198f5)J. of Economic Elntomology 78:290-293 ;和美國專利號5, 743, 477,所有文獻(xiàn)在此完整引入作為參考。
[0023] 編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分的5 -內(nèi)毒素編碼核巧酸序列的片段可 編碼至少約 15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、 650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100個(gè)郵連氨基酸，或高達(dá)存在于本發(fā)明的全 長5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)中的氨基酸的總數(shù)。
[0024] 本發(fā)明優(yōu)選的5 -內(nèi)毒素蛋白質(zhì)由與SEQ ID NO: 1-60和124-132的核巧酸序列 幾乎相同的核巧酸序列編碼。"幾乎相同的"是指使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)用本文所述的比對程序之一 與參考序列相比，具有至少約60 %或65 %序列同一性、約70 %或75 %序列同一性、約80% 或85%序列同一性、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序 列同一性的氨基酸或核巧酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相 似性、閱讀框定位等，可W適當(dāng)調(diào)節(jié)運(yùn)些值來測定由兩條核巧酸序列編碼的蛋白質(zhì)的對應(yīng) 的同一性。
[0025] 為了測定兩條氨基酸序列或兩個(gè)核酸的百分比同一性，比對序列用于最佳比較的 目的。兩條序列間的百分比同一性是序列所共有的相同位置數(shù)的函數(shù)（即百分比同一性 =相同位置數(shù)/位置（例如重疊位置）總數(shù)xlOO)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩條序列具有相 同的長度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，比較跨越參考序列的整體（例如跨越SEQ ID NO: 1-60和 124-132之一的整體，或跨越SEQ ID N0:61-121和133-141之一的整體）?？蒞用與下文 所述技術(shù)類似的允許或不允許缺口的技術(shù)來測定兩條序列間的百分比同一性。在計(jì)算百分 比同一性中，通常計(jì)數(shù)精確匹配。
[0026] 可W用數(shù)學(xué)算法完成兩條序列間百分比同一性的測定。用來進(jìn)行兩條序列的比 較的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是按Karlin和Altschul (1993)Proc.化tl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 中修改的 Karl in 和 Altschul (1990) Proc.化tl. Acad. Sci. USA 87:2264 的 算法。運(yùn)種算法已被并入 Altschul 等（1990)J.Mol.Biol. 215:403 的 BLASTN 和 BLASTX 程 序?？蒞用BLASTN程序，得分=100,字長=12進(jìn)行BLAST核巧酸捜索，W獲得與本發(fā)明 的5-內(nèi)毒素樣核酸分子同源的核巧酸序列?？蒞用BLASTX程序，得分=50,字長=3進(jìn) 行BLAST蛋白質(zhì)捜索，W獲得與本發(fā)明的5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了 獲得用于比較目的的缺口比對，可W按Altschul等（1997) Nucleic Acids Res. 25:3389中 所述使用缺口 BLAST (在BLAST 2. 0中）。備選地，可W用PSI-Blast進(jìn)行檢測分子間距離 關(guān)系的迭代捜索。見Altschul等（1997)上文。當(dāng)利用BLAST、缺口 BLAST和PSI-Blast程 序時(shí)，可W使用各程序（例如BLASTX和BLASTN)的默認(rèn)參數(shù)。還可W通過目檢進(jìn)行手工比 對。
[0027] 用于進(jìn)行序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性實(shí)例是ClustalW算法化iggins 等（1994)Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)。ClustalW 比較序列并比對氨基酸或 DM 序列的整體，從而可W提供關(guān)于整個(gè)氨基酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。ClustalW算法 用于幾種市售DNA/氨基酸分析軟件包中，如Vector NTI Program SuiteQnvitrogen Co巧oration, Carlsbad, CA)的ALIGNX模塊。用ClustalW比對氨基酸序列后，可W評估 百分比氨基酸同一性。用于ClustalW比對分析的軟件程序的非限制性實(shí)例是GE肥DOC?。 GE肥DOC?化arl Nicholas)允