專利名稱：:毒素基因及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。所提供的是編碼殺蟲蛋白的新基因。這些蛋白質(zhì)和編碼它們的核酸序列用于制備殺蟲制劑和用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗害蟲植物。
背景技術(shù)：
：蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)是革蘭氏陽性的產(chǎn)芽孢土壤細(xì)菌，其特征在于其產(chǎn)生晶狀包含體的能力，該晶狀包含體特異性地對(duì)某些目和種的昆蟲有毒，但對(duì)植物和其他非靶標(biāo)生物體無害。由于此原因，包含蘇云金芽孢桿菌菌株或它們的殺蟲蛋白的組合物可以用作環(huán)境可接受的殺蟲劑來控制農(nóng)業(yè)昆蟲害蟲或各種人或動(dòng)物疾病的昆蟲媒介。源自蘇云金芽孢桿菌的晶體(Cry)蛋白質(zhì)(δ-內(nèi)毒素)具有主要針對(duì)鱗翅目(L印idopteran)、雙翅目(Dipteran)和鞘翅目(Coleopteran)幼蟲的有效殺蟲活性。這些蛋白質(zhì)還已顯示針對(duì)膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱螨亞綱(Acari)害蟲目，以及其他無脊椎動(dòng)物目如線形動(dòng)物門(Nemathelminthes)、扁形云力物(Platyhelminthes)禾口肉鞭蟲門(Sarcomastigorphora)的活性(AdvancedEngineeredPesticides,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.中的Feitelson(1993)TheBacillusThuringiensisfamilytree)。最初主要根據(jù)這些蛋白質(zhì)的殺蟲活性將它們分類為CryI至CryV。主要的種類是鱗翅目(L印idoptera)特異的(I)、鱗翅目和雙翅目(Diptera)特異的(II)、鞘翅目(Coleoptera)特異的(III)、雙翅目特異的(IV)和線蟲類特異的(V)和(VI)。進(jìn)一步將這些蛋白質(zhì)分類進(jìn)入亞家族；為各家族內(nèi)更高度相關(guān)的蛋白質(zhì)指定各字母如CrylA、CrylB、CrylC等。各分部?jī)?nèi)還更接近地相關(guān)的蛋白質(zhì)命名為如CrylCl、CrylC2等。最近描述了基于氨基酸序列同源性而非昆蟲靶特異性的Cry基因的新命名法(Crickmore等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)。在此新分類中，為各毒素指定合并了初級(jí)等級(jí)(阿拉伯?dāng)?shù)字)、二級(jí)等級(jí)(大寫字母)、三級(jí)等級(jí)(小寫字母)和四級(jí)等級(jí)(另一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字)的唯一的名稱。在此新分類中，在初級(jí)等級(jí)中已將羅馬數(shù)字調(diào)換為阿拉伯?dāng)?shù)字。序列同一性低于45%的蛋白質(zhì)具有不同的初級(jí)等級(jí)，二級(jí)等級(jí)和三級(jí)等級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)分別是78%和95%。晶體蛋白質(zhì)直到被攝入并在昆蟲中腸中溶解時(shí)才顯示殺蟲活性。昆蟲消化道中的蛋白酶將攝入的前毒素水解為活性毒性分子。(H6fte和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53:242-255)0該毒素與靶標(biāo)幼蟲中腸中的頂刷狀緣受體結(jié)合并插入頂膜(apicalmembrane)產(chǎn)生離子通道或管孔，導(dǎo)致幼蟲死亡。δ-內(nèi)毒素一般具有5個(gè)保守序列域(sequencedomain)和3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(見例如deMaagd等Q001)TrendsGenetics17:193-199)。第一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域由7個(gè)α螺旋組成并涉及膜插入和管孔形成。結(jié)構(gòu)域II由以希臘鑰匙構(gòu)型排列的3個(gè)β片層組成，而結(jié)構(gòu)域III由”薄卷餅”型的2個(gè)反平行β片層組成(deMaagd等，2001，上文)。結(jié)構(gòu)域II和III涉及受體識(shí)別和結(jié)合，因此認(rèn)為它們是毒素特異性決定子?；谔K云金芽孢桿菌的殺蟲劑的密集使用已經(jīng)在菜蛾(Plutellaxylostella)田間群體中引起了抗性(Ferr6和VanRie(2002)Annu.Rev.Entomol.47:501-533)最常見的抗性機(jī)制是毒素與其一種或多種特異性中腸受體結(jié)合的減弱。這還可以賦予對(duì)共用同一受體的其他毒素的交叉抗性(Ferr6和VanRie(2002))0發(fā)明概述本發(fā)明提供用于賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子害蟲抗性的組合物和方法。組合物包含編碼S-內(nèi)毒素多肽序列的核酸分子、包含那些核酸分子的載體和包含載體的宿主細(xì)胞。組合物還包含該內(nèi)毒素的多肽序列和那些多肽的抗體。該核苷酸序列可以用于用來在生物體(包含微生物和植物)中轉(zhuǎn)化和表達(dá)的DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中。核苷酸或氨基酸序列可以是設(shè)計(jì)用于在包含但不限于微生物或植物的生物體中表達(dá)的合成序列。組合物還包含轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。具體而言，提供對(duì)應(yīng)于δ-內(nèi)毒素核酸序列的分離的核酸分子。此外，涵蓋對(duì)應(yīng)于該多核苷酸的氨基酸序列。具體而言，本發(fā)明提供編碼包含編碼SEQIDNO:61-121和133-141中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的核苷酸序列的分離的核酸分子，或SEQIDNO1-60和1M-132中任一所示的核苷酸序列，以及其變體和片段。還涵蓋與本發(fā)明的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或與本發(fā)明的序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的組合物和方法用于產(chǎn)生具有殺蟲劑抗性的生物體，尤其是細(xì)菌和植物。這些生物體和從它們衍生的組合物是為了農(nóng)業(yè)目的而希望得到的。本發(fā)明的組合物還用于產(chǎn)生改變的或改進(jìn)的具有殺蟲活性的S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)，或用于檢測(cè)δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)或核酸在產(chǎn)物或生物體中的存在。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于在生物體，尤其是植物或植物細(xì)胞中調(diào)節(jié)害蟲抗性的組合物和方法。該方法涉及用編碼本發(fā)明的S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的核苷酸序列轉(zhuǎn)化生物體。具體而言，本發(fā)明的核苷酸序列可用于制備具有殺蟲活性的植物和微生物。因此，提供轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、植物組織和種子。組合物是蘇云金芽孢桿菌S-內(nèi)毒素的核酸和蛋白質(zhì)。這些序列用于構(gòu)建表達(dá)載體用于隨后轉(zhuǎn)化進(jìn)入目的生物體，作為用于分離其他S-內(nèi)毒素基因的探針，和用于通過本領(lǐng)域已知的方法，如結(jié)構(gòu)域交換或DNA改組產(chǎn)生改變的殺蟲蛋白。這些蛋白質(zhì)用于控制或殺死鱗翅目、鞘翅目和線蟲類害蟲群體，并用于產(chǎn)生具有殺蟲活性的組合物?！唉?內(nèi)毒素”指具有針對(duì)一種或多種害蟲的毒性活性的源自蘇云金芽孢桿菌的毒素，或與這種蛋白質(zhì)具有同源性的蛋白質(zhì)，所述一種或多種害蟲包含但不限于鱗翅目、雙翅目和鞘翅目的成員或線蟲動(dòng)物門(Nematodaphylum)的成員。在一些情況下，已從包含雙酶梭菌(Clostridiumbifermentans)和日本甲蟲類芽孢桿菌(Paenibacilluspopilliae)的其他生物體分離了S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)。S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)包含從本文公開的全長(zhǎng)核苷酸序列推斷的氨基酸序列，和由于使用其他下游起始位點(diǎn)或由于產(chǎn)生具有殺蟲活性的較短蛋白質(zhì)的加工而比全長(zhǎng)序列短的氨基酸序列。加工可以發(fā)生在表達(dá)該蛋白質(zhì)的生物體中，或該蛋白質(zhì)被攝入后發(fā)生在害蟲體內(nèi)。δ-內(nèi)毒素包含鑒定為cryl至cry43、cytl和cyt2和Cyt-樣毒素的蛋白質(zhì)。目前已知超過250種具有大范圍的特異性和毒性的δ-內(nèi)毒素。全面的列表見Crickmore等(1998)，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813,定期更新見www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index上的Crickmore等(2003)"Bacillusthuringiensistoxinnomenclature，，。本文所提供的是賦予殺蟲活性的新的分離的核苷酸序列。還提供δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的氨基酸序列。從該基因翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)允許細(xì)胞控制或殺死將其攝入的害蟲。分離的核酸分子及其變體和片段本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含編碼δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)和多肽或其生物學(xué)活性部分的核苷酸序列的分離的或重組的核酸分子，以及能夠用作雜交探針來鑒定S-內(nèi)毒素編碼核酸的核酸分子。本文所用的術(shù)語“核酸分子”旨在包含DNA分子(例如重組DNA、cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA?！胺蛛x的，，或“純化的，，核酸分子或蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分基本上游離于其他細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基(通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí))，或基本上游離于化學(xué)品前體或其他化學(xué)品(化學(xué)合成時(shí))。優(yōu)選地，“分離的”核酸游離于衍生該核酸的生物體的基因組DNA中天然位于該核酸側(cè)翼(即位于該核酸的5'和3'端的序列)的序列(優(yōu)選蛋白質(zhì)編碼序列)。為了本發(fā)明的目的，當(dāng)用來指核酸分子時(shí)，“分離的”排除了分離的染色體。例如，在各種實(shí)施方案中，分離的3-內(nèi)毒素編碼核酸分子可以包含少于約5吐、41^、31^、21^、11^、0.51^或0.Ikb在衍生該核酸的細(xì)胞基因組DNA中天然位于該核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列?；旧嫌坞x于細(xì)胞物質(zhì)的S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)包含具有少于約30^^20^^10%或5%(按干重計(jì))的非S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)(本文還稱之為“污染蛋白質(zhì)”)的蛋白質(zhì)制劑。編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核苷酸序列包含SEQIDNO:1_60和1M-132中所示的序列及其變體、片段和互補(bǔ)序列?！盎パa(bǔ)序列”是指與給定的核苷酸序列充分互補(bǔ)，使得其可以與該給定的核苷酸序列雜交從而形成穩(wěn)定的雙鏈體的核苷酸序列。由該核苷酸序列編碼的δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的對(duì)應(yīng)的氨基酸序列示于SEQIDNO:61-121和133-141。本發(fā)明還涵蓋是這些δ-內(nèi)毒素編碼核苷酸序列的片段的核酸分子?！捌巍笔侵妇幋aS-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的核苷酸序列的部分。核苷酸序列的片段可以編碼δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分，或者它可以是用下文所公開的方法可以用作雜交探針或PCR引物的片段。取決于預(yù)期的用途，是S-內(nèi)毒素核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、四50、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350個(gè)毗連核苷酸，或高達(dá)存在于本文所公開的全長(zhǎng)S-內(nèi)毒素編碼核苷酸序列中的核苷酸的數(shù)目?！芭B”核苷酸是指彼此相鄰的核苷酸殘基。本發(fā)明的核苷酸序列的片段可編碼保留S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性并因此保留殺蟲活性的蛋白質(zhì)片段?！氨Ａ艋钚浴笔侵冈撈慰删哂兄辽偌s30%、至少約50%、至少約70%、80(%、90(%、95(%或更高的δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的殺蟲活性。測(cè)量殺蟲活性的方法為本領(lǐng)域熟知。見例如Czapla禾口Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252:199-206;Marrone等(1985)J.ofEconomicEntomology78:290-293；和美國專利號(hào)5，743，477，所有文獻(xiàn)在此完整引入作為參考。編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分的δ-內(nèi)毒素編碼核苷酸序列的片段可編碼至少約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100個(gè)毗連氨基酸，或高達(dá)存在于本發(fā)明的全長(zhǎng)S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)中的氨基酸的總數(shù)。本發(fā)明優(yōu)選的δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)由與SEQIDNO:1_60和1Μ-132的核苷酸序列幾乎相同的核苷酸序列編碼?！皫缀跸嗤摹笔侵甘褂脴?biāo)準(zhǔn)參數(shù)用本文所述的比對(duì)程序之一與參考序列相比，具有至少約60%或65%序列同一性、約70%或75%序列同一性、約80%或85%序列同一性、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，通過考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)這些值來測(cè)定由兩條核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的對(duì)應(yīng)的同一性。為了測(cè)定兩條氨基酸序列或兩個(gè)核酸的百分比同一性，比對(duì)序列用于最佳比較的目的。兩條序列間的百分比同一性是序列所共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即百分比同一性=相同位置數(shù)/位置(例如重疊位置)總數(shù)xlOO)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩條序列具有相同的長(zhǎng)度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，比較跨越參考序列的整體(例如跨越SEQIDNO:1-60和1M-132之一的整體，或跨越SEQIDNO:61-121和133-141之一的整體)?？梢杂门c下文所述技術(shù)類似的允許或不允許缺口的技術(shù)來測(cè)定兩條序列間的百分比同一性。在計(jì)算百分比同一性中，通常計(jì)數(shù)精確匹配?？梢杂脭?shù)學(xué)算法完成兩條序列間百分比同一性的測(cè)定。用來進(jìn)行兩條序列的比較的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是按Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877中修改的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.ki.USA87:2264的算法。這種算法已被并入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLASTN和BLASTX程序。可以用BLASTN程序，得分=100，字長(zhǎng)=12進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的S-內(nèi)毒素樣核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肂LASTX程序，得分=50，字長(zhǎng)=3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的缺口比對(duì)，可以按Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25:3389中所述使用缺口BLAST(在BLAST2.0中)。備選地，可以用PSI-Blast進(jìn)行檢測(cè)分子間距離關(guān)系的迭代搜索。見Altschul等(1997)上文。當(dāng)利用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用各程序(例如BLASTX和BLASTN)的默認(rèn)參數(shù)。還可以通過目檢進(jìn)行手工比對(duì)。用于進(jìn)行序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性實(shí)例是ClustalW算法(Higgins^(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680)。ClustalW比較序列并比對(duì)氨基酸或DNA序列的整體，從而可以提供關(guān)于整個(gè)氨基酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。ClustalW算法用于幾種市售DNA/氨基酸分析軟件包中，如VectorNTIProgramSuite(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)的ALIGNX模塊。用ClustalW比對(duì)氨基酸序列后，可以評(píng)估百分比氨基酸同一性。用于ClustalW比對(duì)分析的軟件程序的非限制性實(shí)例是GENED0C。GENED0C(KarlNicholas)允許評(píng)估多個(gè)蛋白質(zhì)間的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于進(jìn)行序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性實(shí)例是Myers和Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法。這種算法已并入ALIGN程序(2.0版)，其是GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage,版本10(可從Accelrys,Inc.,9685ScrantonRd.,SanDiego,CA,USA獲得)的部分。當(dāng)用ALIGN程序進(jìn)行氨基酸序列比較時(shí)，可以使用PAM120權(quán)重余數(shù)表(weightresiduetable)，缺口長(zhǎng)度罰分12和缺口罰分4。除非另作說明，將使用以下參數(shù)，用GAP版本10(其使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453的算法)來測(cè)定序列同一性或相似性核苷酸序列的％同一性和％相似性使用缺口權(quán)重(GAPWeight)50和長(zhǎng)度權(quán)重3和nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣；氨基酸序列的％同一性或％相似性使用缺口權(quán)重8和長(zhǎng)度權(quán)重3和BL0SUM62評(píng)分程序。還可以使用等同的程序。“等同的程序”指任意序列比較程序，其為所討論的任意兩條序列產(chǎn)生這樣的比對(duì)，當(dāng)與由GAPVersion10產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)的比對(duì)相比時(shí)，該比對(duì)具有相同的核苷酸殘基匹配和相同的百分比序列同一性。本發(fā)明還包含變體核酸分子。S-內(nèi)毒素編碼核苷酸序列的“變體”包含編碼本文所公開的S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)，但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而保守地不同的那些序列，以及如上文所討論的幾乎相同的那些序列?？梢杂檬熘姆肿由飳W(xué)技術(shù)，如下文概述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)來鑒定天然存在的等位變體。變體核苷酸序列還包含合成衍生的核苷酸序列，其通過例如使用位點(diǎn)定向誘變產(chǎn)生，但其仍按下文所討論編碼本發(fā)明中公開的S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)。本發(fā)明所包含的變體蛋白質(zhì)是有生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)保持所希望的天然蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，即保留殺蟲活性。“保留活性”是指變體可具有至少約30%、至少約50%、至少約70%或至少約80%天然蛋白質(zhì)的殺蟲活性。測(cè)量殺蟲活性的方法為本領(lǐng)域熟知。見例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252:199-206；Marrone等(1985)J.ofEconomicEntomology78:290-293；和美國專利號(hào)5，743，477，所有文獻(xiàn)在此完整引入作為參考。熟練的技術(shù)人員可進(jìn)一步理解，可以通過本發(fā)明的核苷酸序列的突變來引入改變，從而在不改變蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的情況下導(dǎo)致所編碼的S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)氨基酸序列中的改變。因此，可以通過將一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、添加或缺失引入本文所公開的對(duì)應(yīng)核苷酸序列來產(chǎn)生分離變體的核酸分子，以便將一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失引入所編碼的蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如位點(diǎn)定向誘變和PCR介導(dǎo)的誘變引入突變。這類變體核苷酸序列也包含于本發(fā)明。例如，可以在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基處產(chǎn)生保守氨基酸取代?！胺潜匦琛卑被釟埢强梢栽诓桓淖兩飳W(xué)活性的情況下從S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的野生型序列改變的殘基，而“必需”氨基酸殘基為生物學(xué)活性所需?！氨Ｊ匕被崛〈笔怯镁哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基取代該氨基酸殘基的取代。已在本領(lǐng)域內(nèi)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包含具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支(β-branched)側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。δ-內(nèi)毒素一般具有5個(gè)保守序列域和3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(見例如deMaagd等(2001)TrendsGenetics17:193-199)。第一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域由7個(gè)α螺旋組成并涉及膜插8入和管孔形成。結(jié)構(gòu)域II由以希臘鑰匙構(gòu)型排列的3個(gè)片層組成，而結(jié)構(gòu)域III由”薄卷餅”型的兩個(gè)反平行β-片層組成(deMaagd等，2001，上文)。結(jié)構(gòu)域II和III涉及受體識(shí)別和結(jié)合，并因此認(rèn)為它們是毒素特異性決定子?？梢栽诒Ａ艄δ艿姆潜Ｊ貐^(qū)域中進(jìn)行氨基酸取代。一般，不對(duì)保守氨基酸殘基或處于保守基序內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行這類取代，其中這類殘基是蛋白質(zhì)活性必需的。保守且可以為蛋白質(zhì)活性必需的殘基實(shí)例包含，例如，包含于本發(fā)明的氨基酸序列比對(duì)中的所有蛋白質(zhì)和已知的S-內(nèi)毒素序列間相同的殘基。保守但可以允許保守氨基酸取代且仍保留活性的殘基的實(shí)例包含，例如，在包含于本發(fā)明的氨基酸序列比對(duì)中的所有蛋白質(zhì)和已知的S-內(nèi)毒素序列間僅具有保守取代的殘基。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，功能性變體可以在保守殘基中具有較少的保守或非保守改變。備選地，可以通過沿全部或部分編碼序列隨機(jī)引入突變，如通過飽和誘變來產(chǎn)生變體核苷酸序列，并可以針對(duì)賦予S-內(nèi)毒素活性的能力篩選產(chǎn)生的突變體來鑒定保留活性的突變體。誘變后，可以重組表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)，并可以用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)的活性?？梢杂萌鏟CR、雜交等的方法鑒定對(duì)應(yīng)的δ-內(nèi)毒素序列，這類序列與本發(fā)明的序列具有基本的同一性。見例如Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)禾口Innis等(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NY)。在雜交法中，可以用全部或部分δ-內(nèi)毒素核苷酸序列來篩選cDNA或基因組文庫。構(gòu)建這類cDNA和基因組文庫的方法一般為本領(lǐng)域已知并公開于Sambrook和Russell，2001，上文中。所謂的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并可以用可檢測(cè)基團(tuán)如32P或任意其他可檢測(cè)標(biāo)記，如其他放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子標(biāo)記。可以根據(jù)本文所公開的已知的S-內(nèi)毒素編碼核苷酸序列，通過標(biāo)記合成的寡核苷酸來產(chǎn)生用于雜交的探針。此外，可以使用根據(jù)核苷酸序列或所編碼的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸殘基設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物。探針通常包含在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的δ-內(nèi)毒素編碼核苷酸序列或其片段或變體的至少約12、至少約25、至少約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400個(gè)相鄰核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)域。用于制備雜交探針的方法一般為本領(lǐng)域已知并公開于Sambrook和Russell，2001，上文中，其在此引用作為參考。例如，可以將本文所公開的整個(gè)δ-內(nèi)毒素序列或其一個(gè)或多個(gè)部分用作能夠特異性地與對(duì)應(yīng)的S-內(nèi)毒素樣序列和信使RNA雜交的探針。為了在各種條件下達(dá)到特異性雜交，這類探針包含獨(dú)特且優(yōu)選長(zhǎng)度為至少約10個(gè)核苷酸或長(zhǎng)度為至少約20個(gè)核苷酸的序列?？梢杂眠@類探針通過PCR從所選擇的生物體擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的δ-內(nèi)毒素序列。該技術(shù)可以用來從所希望的生物體分離其他編碼序列或作為診斷測(cè)定來測(cè)定編碼序列在生物體中的存在。雜交技術(shù)包含涂布DNA文庫的雜交篩選(噬斑或菌落；見例如Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。這類序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”是指這樣9的條件，在該條件下，探針可與其靶序列雜交至高于與其他序列的雜交的可檢測(cè)程度(例如超過背景至少2倍)。嚴(yán)格條件是序列依賴性的且在不同環(huán)境中可不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探測(cè))。備選地，可以將嚴(yán)格性條件調(diào)整為允許序列中的一些錯(cuò)配，以便于檢測(cè)較低程度的相似性(異源探測(cè))。一般，探針長(zhǎng)度小于約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度小于500個(gè)核苷酸。通常，嚴(yán)格條件可以是這樣的條件在pH7.0至8.3，鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常為約0.01至1.OM鈉離子濃度(或其他鹽類)，溫度對(duì)短探針(例如10至50個(gè)核苷酸)為至少約30°C，對(duì)長(zhǎng)探針(例如大于50個(gè)核苷酸)為至少約60°C。還可以用去穩(wěn)定劑如甲酰胺的加入達(dá)到嚴(yán)格條件。示例性低嚴(yán)格性條件包含在37°C下用30-35%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液雜交，并在50_55°C下在IX至2XSSC(20XSSC=3.OMNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性中等嚴(yán)格性條件包含在37°C下在40-45%甲酰胺、1.0MNaCl、l%SDS中雜交，并在55-60°C下在0.5X至IXSSC中洗滌。示例性高嚴(yán)格性條件包含在37°C下在50%甲酰胺、IMNaCl、l%SDS中雜交，并在60-65°C下在0.IXSSC中洗滌?？蛇x地，洗滌緩沖液可以包含約0.至約SDS0雜交時(shí)間一般少于約M小時(shí)，通常為約4至約12小時(shí)。特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)，臨界因子是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于DNA-DNA雜種，可以從Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的方程得出近似Tm值=Tm=81.5°C+16.6(logΜ)+0.41(%GC)-0.61(%甲酰胺)-500/L；其中M是單價(jià)鹽離子的體積摩爾濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是雜交溶液中甲酰胺的百分比，L是以堿基對(duì)計(jì)的雜化物的長(zhǎng)度。Tm是在該溫度下50%互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度。對(duì)每的錯(cuò)配，Tffl降低約1°C；因此，可以調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或洗滌條件來與具有所希望的同一性的序列雜交。例如，如果尋找具有>90%同一性的序列，可以將Tm降低10°C。一般，在給定的離子強(qiáng)度和pH下，選擇嚴(yán)格條件為比特定序列和它的互補(bǔ)序列的熱熔點(diǎn)(thermalmeltingpoint,Tm)低約5°C。但是，極嚴(yán)格條件可以利用比熱熔點(diǎn)(Tm)低1、2、3或4°C下的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以利用比熱熔點(diǎn)(Tm)低6、7、8、9或10°C下的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格性條件可以利用比熱熔點(diǎn)(Tm)低11、12、13、14、15或20°C下的雜交和/或洗滌。普通技術(shù)人員可理解，利用該方程、雜交和洗滌組合物和所希望的Tm，隱喻了雜交和/洗滌溶液的嚴(yán)格性中的變化。如果所希望的錯(cuò)配程度導(dǎo)致低于45°C(水性溶液)或32°C(甲酰胺溶液)的Tm，則優(yōu)選提高SSC濃度，使得可以使用較高的溫度。核酸雜交的大量指導(dǎo)見于Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分，第2章(Elsevier，紐約)；和Ausubel等，編輯(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章(GreenePublishingandffiley-Interscience,M^tl)中。見Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork))。分離的蛋白質(zhì)及其變體和片段δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)也包含于本發(fā)明內(nèi)?！唉?內(nèi)毒素蛋白質(zhì)”是指具有SEQIDNO61-121和133-141中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。還提供其片段、生物學(xué)活性部分和變體，且其可以用來實(shí)施本發(fā)明的方法?！捌巍被颉吧飳W(xué)活性部分”包含含有與SEQIDNO:61-121和133-141的任一項(xiàng)中所示的氨基酸序列幾乎相同的氨基酸序列并顯示殺蟲活性的多肽片段。S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分可以是長(zhǎng)度為例如10、25、50、100或更多個(gè)氨基酸的多肽。可以通過重組技術(shù)制備這類生物學(xué)活性部分并評(píng)估其殺蟲活性。測(cè)量殺蟲活性的方法為本領(lǐng)域熟知。見例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252:199-206；Marrone等(1985)J.ofEconomicEntomology78:290-293；禾口美國專利號(hào)5，743，477，所有文獻(xiàn)在此完整引入作為參考。如此處所用，片段包含SEQIDNO:61-121和133-141的至少8個(gè)毗連氨基酸。但是，本發(fā)明包含其他片段，如大于約10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)中的任意片段?！白凅w”是指與SEQIDNO:61-121和133-141中任一項(xiàng)的氨基酸序列具有至少約60%、65%、約70%、75%、約80%、85%、約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽。變體還包含由在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO1-60和1M-132的核酸分子雜交的核酸分子或其互補(bǔ)分子編碼的多肽。變體包含由于誘變而在氨基酸序列中不同的多肽。本發(fā)明所包含的變體蛋白質(zhì)是有生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)保持所希望的天然蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，即保留殺蟲活性。測(cè)量殺蟲活性的方法為本領(lǐng)域熟知。見例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等(1988)Biochem.J.252:199-206；Marrone等(1985)J.ofEconomicEntomology78:290-293；禾口美國專利號(hào)5，743，477，所有文獻(xiàn)在此完整引入作為參考。細(xì)菌基因，如本發(fā)明的axmi基因常在靠近可讀框起點(diǎn)處具有多個(gè)甲硫氨酸起始密碼子。通常，在一個(gè)或多個(gè)這些起始密碼子處的翻譯起始可導(dǎo)致功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。這些起始密碼子可以包含ATG密碼子。但是，細(xì)菌如芽孢桿菌屬物種(Bacillussp.)還將密碼子GTG識(shí)別為起始密碼子，在GTG密碼子處起始翻譯的蛋白質(zhì)在第一個(gè)氨基酸處包含甲硫氨酸。此外，通常不確定這些密碼子中的哪一個(gè)是細(xì)菌中天然優(yōu)先使用的。因此，據(jù)理解，備選甲硫氨酸密碼子之一的使用也可以導(dǎo)致編碼殺蟲活性的S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。這些S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)包含于本發(fā)明中并可以用于本發(fā)明的方法。針對(duì)本發(fā)明的多肽或針對(duì)其變體或片段的抗體也涵蓋于本發(fā)明。產(chǎn)生抗體的方法為本領(lǐng)域熟知(見例如Harlow禾口Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約；美國專利號(hào)4，196，265)。改變的或改良的變體據(jù)認(rèn)可，可以通過各種方法改變?chǔ)?內(nèi)毒素的DNA序列，這些改變可以產(chǎn)生這樣的DNA序列，其編碼具有不同于本發(fā)明的δ-內(nèi)毒素所編碼的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白質(zhì)?？梢杂枚喾N方式改變?cè)摰鞍踪|(zhì)，該各種方式包括SEQIDNO:61-121和133-141的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸取代、缺失、平截和插入，包含至多約2個(gè)、約3個(gè)、約4個(gè)、約5個(gè)、約6個(gè)、約7個(gè)、約8個(gè)、約9個(gè)、約10個(gè)、約15個(gè)、約20個(gè)、約25個(gè)、約30個(gè)、約35個(gè)、約40個(gè)、約45個(gè)、約50個(gè)、約55個(gè)、約60個(gè)、約65個(gè)、約70個(gè)、約75個(gè)、約80個(gè)、約85個(gè)、約90個(gè)、約100個(gè)、約105個(gè)、約110個(gè)、約115個(gè)、約120個(gè)、約125個(gè)、約130個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代、缺失或插入。[0047]進(jìn)行這類操作的方法一般為本領(lǐng)域已知。例如，可以通過DNA中的突變制備δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的氨基酸序列變體。這還可以通過幾種誘變形式之一和/或在定向進(jìn)化中達(dá)到。在一些方面中，編碼于氨基酸序列中的改變可以基本上不影響蛋白質(zhì)的功能。這類變體可以具有所希望的殺蟲活性。但是，據(jù)理解，可以通過在本發(fā)明的組合物上使用這類技術(shù)來改進(jìn)δ-內(nèi)毒素賦予殺蟲活性的能力。例如，可以在DNA復(fù)制過程中顯示高堿基錯(cuò)參率的宿主細(xì)胞，如XL-IRed(Stratagene)中表達(dá)δ-內(nèi)毒素。在這類菌株中繁殖后，可以分離δ-內(nèi)毒素DNA(例如通過制備質(zhì)粒DNA，或通過用PCR擴(kuò)增并將產(chǎn)生的PCR片段克隆入載體)，在非誘變菌株中培養(yǎng)S-內(nèi)毒素突變，并例如通過進(jìn)行測(cè)試殺蟲活性的測(cè)定來鑒定具有殺蟲活性的突變的S-內(nèi)毒素基因。一般而言，將蛋白質(zhì)混合并用于攝食測(cè)定。見例如Marrone等(198J.ofEconomicEntomology78:290-293。這類測(cè)定可以包括將植物與一種或多種害蟲接觸，并測(cè)定植物存活和/或引起害蟲死亡的能力。產(chǎn)生提高的毒性的突變的實(shí)例見于^An印f等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:775-806中。備選地，可以在基本不影響活性的情況下，在氨基或羧基端對(duì)許多蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改變。這可以包含通過現(xiàn)代分子方法如PCR(包括由于在用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸中包含氨基酸編碼序列而改變或衍生蛋白質(zhì)編碼序列的PCR擴(kuò)增)引入的插入、缺失或改變。備選地，所添加的蛋白質(zhì)序列可以包含整個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列，如本領(lǐng)域中通常用來產(chǎn)生蛋白質(zhì)融合的序列。這類融合蛋白質(zhì)通常用來(1)提高目的蛋白質(zhì)的表達(dá)；(引入結(jié)合結(jié)構(gòu)域、酶活性或表位以便于蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)檢測(cè)或本領(lǐng)域已知的其他實(shí)驗(yàn)用途;(3)將蛋白質(zhì)的分泌或翻譯靶向至亞細(xì)胞器，如革蘭氏陰性菌的壁膜間隙，或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其中后者常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的糖基化。本發(fā)明的變體核苷酸和氨基酸序列還包含衍生自誘變法和重組法(如DNA改組)的序列。使用這種方法，可以用一個(gè)或多個(gè)不同的S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)編碼區(qū)來產(chǎn)生具有所希望的特性的新的S-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)。在這種方式中，從相關(guān)序列多核苷酸的群體產(chǎn)生重組多核苷酸文庫，該群體包含具有基本的序列同一性且可以在體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)域。例如，使用此方法，可以在本發(fā)明的S-內(nèi)毒素基因和其他已知的S-內(nèi)毒素基因間改組編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序，以獲得編碼具有改進(jìn)的目的特性(例如增加的殺蟲活性)的蛋白質(zhì)的新基因。用于這種DNA改組的策略為本領(lǐng)域已知。見例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature370:389-391；Crameri等(1997)NatureBiotech.15:436-438；Moore等(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhang等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509；Crameri等(1998)Nature391:288-291；和美國專利號(hào)5，605，793和5，837，458。結(jié)構(gòu)域交換或改組是產(chǎn)生改變的δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的另一種機(jī)制。可以在δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)間交換結(jié)構(gòu)域II和III，得到具有改良的殺蟲活性或目標(biāo)特征的雜化物或嵌合毒素。用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)和測(cè)試它們的殺蟲活性的方法為本領(lǐng)域熟知(見例如Naimov等(2001)Appl.Environ.Microbiol.67:5328-5330;deMaagd等(1996)Appl.Environ.Microbiol.62:1537-1543；Ge等(1991)J.Biol.Chem.26617954-17958;Schnepf等(1990)J.Biol.Chem.265:20923-20930；Rang等91999)Appl.Environ.Microbiol.652918-2925)。載體[0052]可以在用于在目的植物中表達(dá)的表達(dá)盒中提供本發(fā)明的δ-內(nèi)毒素序列?！爸参锉磉_(dá)盒”是指能夠在植物細(xì)胞中引起從可讀框表達(dá)蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體。這些通常包含啟動(dòng)子和編碼序列。通常，這類構(gòu)建體還可包含3'非翻譯區(qū)。這類構(gòu)建體可以包含“信號(hào)序列”或“前導(dǎo)序列”以便于該肽共翻譯或翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)至某些胞內(nèi)結(jié)構(gòu)如葉綠體(或其他質(zhì)體)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體。“信號(hào)序列”是指已知或懷疑其導(dǎo)致肽共翻譯或翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)跨過細(xì)胞膜的序列。在真核細(xì)胞中，這通常涉及分泌進(jìn)入高爾基體，其中一些產(chǎn)生糖基化。“前導(dǎo)序列”是指，在翻譯氨基酸序列時(shí)，能夠引起肽鏈共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)至亞細(xì)胞器的任意序列。因此，這包含通過進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)過液泡、質(zhì)體(包含葉綠體、線粒體等)靶向轉(zhuǎn)運(yùn)和/或糖基化的前導(dǎo)序列?！爸参镛D(zhuǎn)化載體”是指有效的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化所必需的DNA分子。這種分子可以由一個(gè)或多個(gè)植物表達(dá)盒組成，且可以組織入一個(gè)以上的“載體"DNA分子。例如，二元載體是利用兩個(gè)非毗連DNA載體來編碼植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化必需的所有順式和反式作用功能的植物轉(zhuǎn)化載體(Hellens和MullineauxUOOO)iTrendsinPlantScience5:446-451)。“載體”指設(shè)計(jì)用于在不同宿主細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?！氨磉_(dá)載體”指具有在外源細(xì)胞中摻入、整合和表達(dá)異源DNA序列的能力的載體。盒可以包含與本發(fā)明的序列有效連接的5'和3'調(diào)節(jié)序列。“有效連接”是指啟動(dòng)子和第二序列的功能性連接，其中啟動(dòng)子序列起始和介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般而言，有效連接指所連接的核酸序列是毗連的，且在必須連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的地方是毗連并處于同一閱讀框中的。盒可以額外包含至少一個(gè)待轉(zhuǎn)化進(jìn)入生物體的其他基因。備選地，一個(gè)或多個(gè)其他基因可以提供在多個(gè)表達(dá)盒上。“啟動(dòng)子”指發(fā)揮作用來指導(dǎo)下游編碼序列的轉(zhuǎn)錄的核酸序列。啟動(dòng)子與其他轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸序列(也稱為“控制序列”)共同為目的DNA序列的表達(dá)所需。提供具有多個(gè)限制位點(diǎn)的這種表達(dá)盒用于將δ-內(nèi)毒素序列插至調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下。表達(dá)盒可以在5'至3'的轉(zhuǎn)錄方向上包含轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動(dòng)子)、本發(fā)明的DNA序列和在植物中有功能的翻譯和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(即終止區(qū))。對(duì)植物宿主和/或?qū)Ρ景l(fā)明的DNA序列而言，啟動(dòng)子可以是天然的或類似的，或外源的或異源的。備選地，啟動(dòng)子可以是天然序列或備選地是合成序列。啟動(dòng)子是植物宿主的“天然”或“同源”啟動(dòng)子時(shí)，其是指該啟動(dòng)子見于該啟動(dòng)子所引入的天然植物中。啟動(dòng)子是本發(fā)明的DNA序列的“外源”或“異源”啟動(dòng)子時(shí)，其是指該啟動(dòng)子不是本發(fā)明DNA序列的有效連接的天然的或天然存在的啟動(dòng)子。終止區(qū)可以是轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的天然終止區(qū)，可以是有效連接的目的DNA序列的天然終止區(qū)，可以是植物宿主的天然終止區(qū)，或可以衍生自其他來源(即對(duì)啟動(dòng)子、目的DNA序列、植物宿主或其任意組合而言是外源的或異源的)?？蓮母鲛r(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的Ti質(zhì)粒獲得方便的終止區(qū)，如章魚堿合酶和胭脂氨酸合酶終止區(qū)。還見Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell64:671-674；Sanfacon等(1991)GenesDev.5141-149;Mogen等(1990)PlantCell2:1洸1_1272;Munroe等(1990)Gene91:151-158；Ballas等(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903；和Joshi等(1987)NucleicAcidRes.15:9627_9639。適當(dāng)時(shí)，可以優(yōu)化一個(gè)或多個(gè)基因用于提高在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。即可以13用宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子來合成基因，或可以按宿主優(yōu)選的密碼子選擇頻率用密碼子來合成基因，以改進(jìn)表達(dá)。參見,例如Campbell和Gowri(1990)，PlantPhysiol.92:1-11關(guān)于宿主優(yōu)選密碼子使用的討論。一般，可以提高基因的GC含量。可在本領(lǐng)域內(nèi)獲得用于合成植物優(yōu)選的基因的方法。見例如美國專利號(hào)5，380，831和5，436，391，和Murray等(1989)NucleicAcidsRes.17:477_498，其在此引用作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，將δ-內(nèi)毒素靶向至葉綠體進(jìn)行表達(dá)。在不直接將δ-內(nèi)毒素插入葉綠體的此方式中，表達(dá)盒可額外包含編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽來將S-內(nèi)毒素導(dǎo)向葉綠體的核酸。這類轉(zhuǎn)運(yùn)肽為本領(lǐng)域已知。見例如VonHeijne等(1991)PlantMol.Biol.Rep.9104-126；Clark等(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等(1987)PlantPhysiol.84:965-968；Romer等(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；禾口Shah等(1986)Science233:478-481?？梢葬槍?duì)在葉綠體中的表達(dá)優(yōu)化待靶向至葉綠體的δ-內(nèi)毒素基因，以補(bǔ)償植物細(xì)胞核和該細(xì)胞器間密碼子選擇的差異。在此方式中，可以用葉綠體優(yōu)選的密碼子合成目的核酸。見例如美國專利號(hào)5，380，831，其在此引用作為參考。棺物轉(zhuǎn)化本發(fā)明的方法涉及將核酸構(gòu)建體引入植物?！耙搿笔侵敢赃@樣的方式將核酸構(gòu)構(gòu)建體遞呈至植物，使得該構(gòu)建體可以接近該植物細(xì)胞內(nèi)部。本發(fā)明的方法不要求使用用于將核苷酸構(gòu)建體引入植物的特定方法，只要核苷酸構(gòu)建體可以接近該植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部。將核苷酸構(gòu)建體引入植物的方法為本領(lǐng)域已知，其包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法和病毒介導(dǎo)法。“植物”是指整株植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚及這些的子代。植物細(xì)胞可以是分化的或未分化的(例如愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉細(xì)胞、根細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞、花粉)?！稗D(zhuǎn)基因植物”或“轉(zhuǎn)化植物”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”植物或細(xì)胞或組織指已將外源核酸序列或DNA片段摻入或整合入植物細(xì)胞的植物。這些核酸序列包含外源的或不存在于未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的核酸序列，以及可以是內(nèi)源的或存在于未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的核酸序列?！爱愒吹摹币话阒高@樣的核酸序列，其不是細(xì)胞內(nèi)源的或不是其存在于其中的天然基因組的部分，且已通過感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、顯微投影等加入至該細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的幾種技術(shù)之一達(dá)到植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化?？梢孕揎棻景l(fā)明的S-內(nèi)毒素基因以獲得或增強(qiáng)在植物細(xì)胞中的表達(dá)。通常，表達(dá)這種蛋白質(zhì)的構(gòu)建體可包含驅(qū)動(dòng)該基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，以及允許轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷化作用的3'非編碼區(qū)。這類構(gòu)建體的組織為本領(lǐng)域熟知。在一些情況下，改造基因使得產(chǎn)生的多肽分泌或以其他方式在植物細(xì)胞內(nèi)靶向可以是有用的。例如，可以將基因改造為包含信號(hào)肽，以便于該肽轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。還可以優(yōu)選將植物表達(dá)盒改造為包含內(nèi)含子，使得內(nèi)含子的mRNA加工為表達(dá)所需。通?？蓪⒃摗爸参锉磉_(dá)盒”插入“植物轉(zhuǎn)化載體”。該植物轉(zhuǎn)化載體可以包含達(dá)到植物轉(zhuǎn)化所需的一個(gè)或多個(gè)DNA載體。例如，利用包含一個(gè)以上毗連DNA片段的植物轉(zhuǎn)化載體是本領(lǐng)域中常見的實(shí)施。這些載體在本領(lǐng)域中通常稱為“二元載體”。二元載體以及具有輔助質(zhì)粒的載體最常用于農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中達(dá)到有效轉(zhuǎn)化所需的DNA片段的大小和復(fù)雜性非常大，且將功能分開在獨(dú)立的DNA分子上是有利的。二元載體通常包含含有T-DNA轉(zhuǎn)移所需的順式作用序列(如左邊緣和右邊緣)的載體、改造為能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記和“目的基因”(改造為能夠在希望針對(duì)其產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的植物細(xì)胞中表達(dá)的基因)。細(xì)菌復(fù)制所需的序列也存在于該質(zhì)粒載體上。順式作用序列按允許有效轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物細(xì)胞并在其中表達(dá)的方式排列。例如，選擇標(biāo)記基因和S-內(nèi)毒素位于左邊緣和右邊緣之間。第二質(zhì)粒載體通常包含介導(dǎo)T-DNA從農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞的反式作用因子。如本領(lǐng)域中所理解(Hellens和MullineauxQOOO)TrendsinPlantScience5:446-451)，該質(zhì)粒通常包含允許通過農(nóng)桿菌屬感染植物細(xì)胞和通過在邊緣序列切割和vir介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移來轉(zhuǎn)移DNA的毒力功能。幾種類型的農(nóng)桿菌屬菌株(例如LBA4404、GV3101、EHAlOUEHA105等)可以用來進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化。第二質(zhì)粒載體不是通過其他方法如顯微投影、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇等轉(zhuǎn)化植物必需的。一般，植物轉(zhuǎn)化方法涉及轉(zhuǎn)移異源DNA進(jìn)入靶植物細(xì)胞(例如未成熟的或成熟的胚、懸浮培養(yǎng)物、未分化的愈傷組織、原生質(zhì)體等)，然后應(yīng)用最大閾值水平的適當(dāng)?shù)倪x擇(取決于選擇標(biāo)記基因)從一組未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群集回收轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。通常將外植體轉(zhuǎn)移至新鮮補(bǔ)給的相同培養(yǎng)基并進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。隨后，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在放置在補(bǔ)充有最大閾值水平的選擇劑的再生培養(yǎng)基上之后分化為苗。然后將苗轉(zhuǎn)移至選擇性生根培養(yǎng)基進(jìn)行有根苗或小植物的恢復(fù)。然后將轉(zhuǎn)基因小植物培育為成熟植物并產(chǎn)生可育種子(例如Hiei等(1994)ThePlantJournal6:271-282;Ishida等(1996)NatureBiotechnology14:745-750)。通常將外植體轉(zhuǎn)移至新鮮補(bǔ)給的相同培養(yǎng)基并進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)和方法的一般描述見于Ayres和Park(1994)CriticalReviewsinPlantScience13:219-239和Bommineni和Jauhar(1997)Maydica42:107-120中。由于轉(zhuǎn)化的物質(zhì)包含許多細(xì)胞；轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞都存在于任意一片其所屬的靶愈傷組織或組織或細(xì)胞群中。殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞和允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖的能力產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物培養(yǎng)物。通常，除去非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力是快速回收轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和成功產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的限制。取決于靶向轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)，轉(zhuǎn)化流程以及將核苷酸序列引入植物的流程可以不同。轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生可以通過幾種方法之一進(jìn)行，其包括但不限于顯微注射、電穿孔、直接基因轉(zhuǎn)移、通過農(nóng)桿菌屬將異源DNA引入植物細(xì)胞(農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)、用粘附至粒子的異源外源DNA轟擊植物細(xì)胞、彈道粒子加速、氣溶膠束轉(zhuǎn)化(美國公開申請(qǐng)?zhí)?0010(^6941；美國專利號(hào)4，945，050；國際公開號(hào)WO91/00915；美國公開申請(qǐng)?zhí)?002015066)、Lecl轉(zhuǎn)化和多種其他非粒子直接介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移DNA的方法。用于葉綠體轉(zhuǎn)化的方法為本領(lǐng)域已知。見例如Svab等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917;Svab和Maliga(1993)EMBOJ.12:601_606。該方法依賴于DNA的粒子槍遞送，該DNA包含選擇標(biāo)記并通過同源重組將該DNA靶向至質(zhì)體基因組。此外，通過核編碼和質(zhì)體導(dǎo)向的RNA聚合酶的組織優(yōu)選表達(dá)，通過攜帶轉(zhuǎn)基因的沉默質(zhì)體的反式激活可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)化。這種系統(tǒng)已報(bào)道于McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305中。將異源外源DNA整合入植物細(xì)胞后，在培養(yǎng)基中應(yīng)用最大閾值水平的適當(dāng)?shù)倪x擇來殺死未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并通過定期轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基來分離和增殖從該選擇處理存活的推定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過連續(xù)傳代并用適合的選擇挑戰(zhàn)來鑒定并增殖用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。15然后可以用分子和生物化學(xué)方法來確認(rèn)整合進(jìn)入該轉(zhuǎn)基因植物基因組的異源目的基因的存在。可以按照常規(guī)方式將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)為植物。見例如McCormick等(1986)PlantCellReports5:81_84。然后可以培養(yǎng)這些植物，并用相同的轉(zhuǎn)化品系或不同品系對(duì)其授粉，鑒定具有所希望的表型特征的組成性表達(dá)的雜種。可以培養(yǎng)兩代或多代以確保所希望的表型特征的表達(dá)穩(wěn)定維持和遺傳，然后收獲種子以確保已達(dá)到所希望的表型特征的表達(dá)。在此方式中，本發(fā)明提供具有穩(wěn)定整合入其基因組的本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體，例如本發(fā)明的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化種子(也稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)。棺物轉(zhuǎn)化的評(píng)估異源外源DNA引入植物細(xì)胞后，通過多種方法，如對(duì)與所整合的基因相關(guān)的核酸、蛋白質(zhì)和代謝物的分析來確認(rèn)異源基因在該植物基因組中的轉(zhuǎn)化或整合。在移植入土壤前的更早階段，PCR分析是針對(duì)整合基因的存在篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或苗的快速方法(Sambrook禾口Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約)。用對(duì)目的基因或農(nóng)桿菌屬載體背景等特異的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR?？梢酝ㄟ^基因組DNA的DNA印跡分析確認(rèn)植物轉(zhuǎn)化(Sambrook和Russell，2001，上文))。一般，從轉(zhuǎn)化體提取總DNA，用適合的限制酶消化，在瓊脂糖凝膠中分級(jí)分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜。然后按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook和RUSSell，2001，上文)，用例如放射性標(biāo)記的32P靶DNA片段探測(cè)膜或“印跡”，以確認(rèn)所引入的基因整合入該植物基因組。在RNA印跡分析中，按照本領(lǐng)域中常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook和Russell，2001，上文)，從轉(zhuǎn)化體的特定組織分離RNA，在甲醛瓊脂糖凝膠中分級(jí)分離并印跡在尼龍濾膜上。然后通過將濾膜與通過本領(lǐng)域已知的方法(Sambrook和Russell，2001，上文)從δ-內(nèi)毒素衍生的放射性探針雜交來測(cè)試由δ-內(nèi)毒素編碼的RNA的表達(dá)。可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook和Russell，2001，上文)，用與存在于δ-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)上的一個(gè)或多個(gè)表位結(jié)合的抗體在轉(zhuǎn)基因植物上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡、生化測(cè)定等，以確認(rèn)由S-內(nèi)毒素基因編碼的蛋白質(zhì)的存在。植物中的殺蟲活性在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，可以產(chǎn)生表達(dá)具有殺蟲活性的δ-內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因植物。上文以實(shí)例的方式描述的方法可以用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，但產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方式對(duì)本發(fā)明并不重要。可以按照實(shí)驗(yàn)者的判斷使用本領(lǐng)域已知或已描述的方法，如農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、生物射彈轉(zhuǎn)化和非離子介導(dǎo)的方法?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中所描述的常見方法分離表達(dá)S-內(nèi)毒素的植物，例如通過轉(zhuǎn)化愈傷組織、選擇轉(zhuǎn)化的愈傷組織和從這種轉(zhuǎn)基因愈傷組織再生可育植物。在這種方法中，可以用任意基因作為選擇標(biāo)記，只要其在植物細(xì)胞中的表達(dá)賦予鑒定或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力。已發(fā)展了許多標(biāo)記用于植物細(xì)胞，如對(duì)氯霉素、氨基糖苷類G418、潮霉素等的抗性。其他編碼涉及葉綠體代謝的產(chǎn)物的基因也可以用作選擇標(biāo)記。例如，提供對(duì)植物除草劑如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮的抗性的基因可以具有特定用途。已報(bào)道了這類基因(Stalker等(1985)J.Biol.Chem.263:6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；禾口Sathasivan等(1990)Nucl.AcidsRes.18:2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因))。此外，用本文所公開的基因作標(biāo)記來評(píng)估細(xì)菌或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因在植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚或這些的子代中的存在的方法為本領(lǐng)域熟知。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過測(cè)試殺蟲活性來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的存在?？梢葬槍?duì)殺蟲活性測(cè)試表達(dá)δ-內(nèi)毒素的可育植物，并選擇顯示最佳活性的植物進(jìn)行進(jìn)一步繁殖。本領(lǐng)域中可獲得測(cè)定害蟲活性的方法。一般，將蛋白質(zhì)混合并用于攝食測(cè)定。見例如Marrone等(1985)J.ofEconomicEntomology78:290—293。本發(fā)明可以用于任意植物種類的轉(zhuǎn)化，其包含但不限于單子葉植物和雙子葉植物。目的植物的實(shí)例包含但不限于玉米(玉蜀黍)、高粱、小麥、向日葵、西紅柿、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜、蕓苔屬物種(Brassicasp.)、苜蓿、黑麥、蜀、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑桔樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果、澳洲堅(jiān)果(macadamia)、杏、燕麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。蔬菜包含但不限于西紅柿、萵苣、菜豆、利馬豆、豌豆和黃瓜屬(Curcumis)的成員如黃瓜、棱瓜和甜瓜。觀賞植物包含但不限于杜鵑花、繡球花、木槿、玫瑰、郁金香、水仙花、喇叭花、康乃馨、一品紅和菊花。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物是作物植物(例如玉蜀黍、高粱、小麥、向日葵、西紅柿、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜等)。在害蟲控制中的用涂在殺蟲劑控制或改造其他生物體為殺蟲劑中使用包含本發(fā)明的核苷酸序列或其變體的菌株的一般方法為本領(lǐng)域已知。見例如美國專利號(hào)5，039，523和EP0480762A2。包含本發(fā)明的核苷酸序列或其變體的芽孢桿菌屬菌株或已遺傳改造為包含殺蟲基因或蛋白質(zhì)的微生物可以用來保護(hù)作物或農(nóng)產(chǎn)品免受害蟲危害。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，當(dāng)將細(xì)胞應(yīng)用于一種或多種靶害蟲的環(huán)境時(shí)，用延長(zhǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生的毒素的活性的試劑處理產(chǎn)生毒素(殺蟲劑)的生物體的整個(gè)(即未裂解的)細(xì)胞。備選地，通過將δ-內(nèi)毒素基因引入細(xì)胞宿主來產(chǎn)生殺蟲劑。δ-內(nèi)毒素基因的表達(dá)直接或間接導(dǎo)致該殺蟲劑的胞內(nèi)產(chǎn)生和維持。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，當(dāng)將細(xì)胞應(yīng)用于一種或多種靶害蟲的環(huán)境時(shí)，隨后在延長(zhǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生的毒素的活性的條件下處理這些細(xì)胞。產(chǎn)生的產(chǎn)物保留毒素的毒性。然后可以按照常規(guī)技術(shù)配制這些天然封裝的殺蟲劑應(yīng)用于具有靶害蟲的環(huán)境，例如土壤、水和植物的葉。見例如EPA0192319和本文引用的參考文獻(xiàn)。備選地，可以這樣配置表達(dá)本發(fā)明的基因的細(xì)胞，使得允許將產(chǎn)生的物質(zhì)作為殺蟲劑應(yīng)用。殺蟲組合物本發(fā)明的活性成分通常以組合物形式應(yīng)用，并可以與其他化合物同時(shí)或順次地應(yīng)用于作物區(qū)或待處理的植物。這些化合物可以是肥料、除草劑、冷凍保護(hù)劑、表面活性劑、去污劑、殺蟲皂、休眠噴灑油、聚合物和/或單次應(yīng)用該制劑后允許靶區(qū)域的長(zhǎng)期給藥的延時(shí)釋放(time-release)或生物可降解載體制劑。它們還可以是選擇性除草劑、化學(xué)殺蟲劑、殺病毒劑、殺微生物劑、殺變形蟲劑、殺蟲劑、殺真菌劑、殺菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動(dòng)物劑或幾種這些制劑的混合物，如果希望，它們可與制劑領(lǐng)域通常使用的其他農(nóng)業(yè)可用載體、表面活性劑或應(yīng)用促進(jìn)佐劑一起。合適的載體和佐劑可以是固體或液體的，對(duì)應(yīng)于制劑技術(shù)中通常使用的物質(zhì)，例如天然或再生的礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、潤(rùn)濕劑、膠黏劑、黏合劑或肥料。類似地，制劑可制成可食用的“誘餌”或塑造成害蟲“陷阱”的形式，以使得殺蟲制劑的靶害蟲進(jìn)食或攝食。應(yīng)用本發(fā)明的活性成分或包含至少一種由本發(fā)明的細(xì)菌菌株產(chǎn)生的殺蟲蛋白的本發(fā)明的農(nóng)用化學(xué)品組合物的方法包括葉應(yīng)用、種子包被和土壤應(yīng)用。應(yīng)用數(shù)目和應(yīng)用比率取決于被對(duì)應(yīng)的害蟲侵襲的強(qiáng)度。組合物可以配制為粉末(powder)、粉劑(dust)、丸、顆粒、噴霧、乳劑、膠體、溶液等，且可以通過常規(guī)方法，如脫水、冷凍干燥、勻漿、提取、過濾、離心、沉降或濃縮包含多肽的細(xì)胞培養(yǎng)物來配制。在包含至少一種這種殺蟲多肽的所有這類組合物中，該多肽可以按從約Iwt%至約99wt%的濃度存在?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法在給定區(qū)域中殺死鱗翅目、鞘翅目或線蟲類害蟲或降低其數(shù)量，或者可以預(yù)防性地應(yīng)用于環(huán)境區(qū)域以防止被易感害蟲侵襲。優(yōu)選地，害蟲攝食或接觸殺蟲有效量的多肽?！皻⑾x有效量”是指能夠引起至少一只害蟲死亡或顯著降低害蟲的生長(zhǎng)、進(jìn)食或正常生理發(fā)育的殺蟲劑的量。此量可取決于以下這類因素而不同，例如待控制的具體靶害蟲、具體環(huán)境、位置、植物、作物、或待處理的農(nóng)業(yè)場(chǎng)所、環(huán)境條件、和方法、比率、濃度、穩(wěn)定性、和殺蟲有效的多肽組合物的應(yīng)用量。制劑還可以依氣候條件、環(huán)境考慮和/或應(yīng)用頻率和/或害蟲侵襲的嚴(yán)重度而不同?？梢酝ㄟ^用所希望的農(nóng)業(yè)可用載體配制細(xì)菌細(xì)胞、晶體和/或孢子懸液或分離的蛋白質(zhì)成分來產(chǎn)生所述殺蟲組合物?？梢杂眠m當(dāng)?shù)姆椒ㄔ谑┯们芭渲平M合物，如低壓凍干、冷凍干燥、脫水、或在水性載體、培養(yǎng)基或適合的稀釋液，如鹽水或其他緩沖液中。所配制的組合物可以是粉劑或顆粒材料的形式，或在油(植物或礦物)或水或油/水乳劑中的懸液，或作為可濕性粉，或與任意其他適合用于農(nóng)業(yè)應(yīng)用的載體材料組合。適合的農(nóng)業(yè)載體可以是固體或液體且為本領(lǐng)域熟知。術(shù)語“農(nóng)業(yè)可用載體”包含通常用于殺蟲劑制劑技術(shù)的所有佐劑、惰性成分、分散劑、表面活性劑、膠黏劑、黏合劑等；這些是殺蟲劑制劑領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。制劑可以與一種或多種固體或液體佐劑混合和通過多種方法制備，例如通過使用常規(guī)制劑技術(shù)將殺蟲組合物與適合的佐劑均質(zhì)地混合、搗碎和/或研磨。適合的制劑和應(yīng)用方法描述于美國專利號(hào)6，468，523中，其在此引入作為參考。“害蟲”包含但不限于昆蟲、真菌、細(xì)菌、線蟲、螨、蜱等。昆蟲害蟲包含選自鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目、食毛目、同翅目、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、纓翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、風(fēng)目(Anoplura)、圣目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等目，尤其是鞘翅目、鱗翅目和雙翅目的昆蟲。鞘翅目包含肉食亞目(Acbphaga)和多食亞目(Polyphaga)。肉食亞目包含步甲總科(Caraboidea)和鼓甲總科(Gyrinoidea)，而多食亞目包含牙甲總科(Hydrophiloidea)、隱翅蟲總科(Staphylinoidea)、花螢總科(Cantharoidea)、郭公蟲總科(Cleroidea)、叩頭蟲總科(Elateroidea)、花甲總科(Dascilloidea)、泥甲總科(Dryopoidea)、丸甲總科(Byrrhoidea)、扁甲總科(Cucujoidea)、芫菁總科(Meloidea)、花虱總科(Mordelloidea)、擬步行蟲總科(Tenebrionoidea)、長(zhǎng)蠢總科(Bostrichoidea)、金龜子總禾斗(Scarabaeoidea)、天?？偤潭?Cerambycoidea)、葉甲總禾斗(Chrysomeloidea)禾口象18蟲總科(Curculionoidea)。步甲總科包含虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)和龍虱科(Dytiscidae)。鼓甲總科包含鼓甲科(Gyrinidae)。牙甲總科包含牙甲科(Hydrophilidae)。隱翅蟲總科包含埋葬蟲科(Silphidae)和隱翅蟲科(Maphylinidae)。花螢總科包含花螢科(Cantharidae)和螢科(Lampyridae)。郭公蟲總科包含郭公蟲科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。叩頭蟲總科包含叩甲科(Elateridae)和吉丁甲科(Buprestidae)。扁甲總科包含瓢蟲科(Coccinellidae)。芫菁總科包含芫菁科(Meloidae)。擬步行蟲總科包含擬步行蟲科(Tenebrionidae)。金龜子總科包含黑蜣科(Passalidae)和金龜子科(Scarabaeidae)。天?？偪瓢炫？?Cerambycidae)。葉甲總科包含葉甲科(Chrysomelidae)。象蟲總科包含象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。雙翅目包含長(zhǎng)角亞目(Nematocera)、短角亞目(Brachycera)和環(huán)裂亞目(Cyclorrhapha)。長(zhǎng)角亞目包含大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、搖蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和癭蚊科(Cecidomyiidae)。短角亞目包含水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、劍虻科(Therevidae)、食蟲虻科(Asilidae)、擬食蟲虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和長(zhǎng)足虻科(Dolichopodidae)。環(huán)裂亞目包含無縫組(Aschiza)和無縫組(Aschiza)。無縫組包含蚤蠅科(Phoridae)、食蚜蠅科(Syrphidae)和眼蠅科(Conopidae)。無縫組包含無瓣類(Acalyptratae)和有瓣類(Calyptratae)。無瓣類包含斑蠅科(Otitidae)、實(shí)蠅科(T印hritidae)、潛蠅科(Agromyzidae)和果蠅科(Drosophilidae)。有瓣類包含虱蠅科(Hippoboscidae)、狂蠅科(Oestridae)、寄蠅科(Tachinidae)、花蠅科(Anthomyiidae)、#|科(Muscidae)、麗科(Calliphoridae)禾口麻科(Sarcophagidae)。鱗翅目包含鳳蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛺蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蠶蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、燈蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾禾斗(Tineidae)。線蟲類包含寄生線蟲類如根結(jié)線蟲類、包囊線蟲類和根腐線蟲類(root-knot，cyst,andlesionnematodes)，其包含棘皮線蟲屬物種(Heteroderaspp·)、根結(jié)線蟲屬物種(Meloidogynespp.)和球胞囊線蟲屬物種(Globoderaspp.)；尤其是包囊線蟲類的成員，其包含但不限于大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)；甜菜胞囊線蟲(Heteroderaschachtii)；M1MMM^A(Heteroderaavenae)；禾口g#■t_&(Globoderarostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(Globoderapailida)(馬鈴薯包囊線蟲)。根腐線蟲類包括短體線蟲屬物種(Pratylenchusspp.)。本發(fā)明的主要作物昆蟲害蟲包含玉蜀黍玉米螟(Ostrinianubilalis)，歐洲玉米螟(Europeancornborer)；小地老虎(Agrotisipsilon)；玉米穗蛾(Helicoverpazea)；秋夜蛾(Spodopterafrugiperda),草地夜蛾(fal1armyworm)；西南玉米稈草螟(Diatraeagrandiosella)，西南玉米螟(Southwesterncornborer)；小玉米蓮蟲主ji,(Elasmopalpuslignosellus)；胃_(Diatraeasaccharalis)；HR^ΞΕIHBf甲(Diabroticavirgifera)匕方玉f口十甲(Diabroticalongicornisbarberi)；南方玉fIflBfEp(Diabroticaundecimpunctatahowardi)；口口禾中(Melanotusspp.),蟲；北方圓頭犀金龜(Cycloc^phalaborealis)(白蠐螬)；南方圓頭犀金龜(Cycloc^phalaimmaculata)(白M蟲曹)；臼本U金龜(Popilliajaponica)；玉米足兆甲(Chaetocnemapulicaria)!EEfH(Sphenophorusmaidis)；玉f卩十蟲牙(Rhopalosiphummaidis)；玉米t艮蟲牙(Anuraphismaidiradicis)；麥長(zhǎng)蟲春(Blissusleucopterusleucopterus)；紅腿幢(Melanoplusfemurrubrum)；遷徙蚱錳(Melanoplussanguinipes)；種蠅(Hylemyaplatura)；玉米斑潛蜆(Agromyzaparvicornis)；美洲錐形薊馬(Anaphothripsobscrurus)；竊蟲義(Solenopsismilesta)；二點(diǎn)紅葉螨(Tetranychusurticae)；高梁高梁螟(Chilopartellus)；秋夜蛾；玉米穗蛾；小玉米莖蛀蟲；粒膚地老虎O^eltiasubterranea)；白M蟲曹(Phyllophagacrinita)；偽金針蟲屬(Eleodes)、金針蟲屬(Conoderus)和Aeolus物種，金針蟲；橙足負(fù)泥蟲(Oulemamelanopus)；玉米跳甲；玉米谷象；玉米葉蚜；蔗黃偽毛蚜(Siphaflava)；麥長(zhǎng)蝽；高粱癭蚊(Contariniasorghicola)；朱砂Bf蟲茜(Tetranychuscinnabarinus)；二^紅Bf蟲茜；小麥:沖亍軍蟲(Pseudaletiaunipunctata)；秋夜蛾；小玉米莖蛀蟲；西方灰地老虎(Agrotisorthogonia)；小玉米蓮蛀蟲；橙足負(fù)泥蟲；車軸草葉象甲(Hyperapunctata)；南方玉米根葉甲；俄羅斯麥蚜；麥二叉蚜(Schizaphisgraminum)；麥長(zhǎng)管蚜(Macrosiphumavenae)；紅腿蝗；長(zhǎng)額負(fù)蝗(Melanoplusdifferentials)；遷徙蚱蜢；黑森癭蚊(Mayetioladestructor)；麥紅吸菜蟲(Sitodiplosismosellana)；美洲麥稈蠅(Meromyzaamericana)；冬作種蠅(Hylemyacoarctata)；煙草薊馬(Frankliniellafusca)；麥蓮蜂(Cephuscinctus)；郁金香瘤螨(Aceriatulipae)向日葵向日葵芽蛾(Suleimahelianthana)；向日葵斑螟(Homoeosomaelectellum)；向曰葵葉甲(Zygogrammaexclamationis)；古月蘿卜金Ii1(Bothyrusgibbosus)；(H^ff^4(Neolasiopteramurtfeldtiana)棉花綠棉鈴蟲(Heliothisvirescens)；棉鈴蟲(Helicoverpazea)；舌甘菜夜蛾(Spodopteraexigua)；棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)；棉鈴象甲(Anthonomusgrandis)；棉蚜(Aphisgossypii)；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelisseriatus)；帶狀翅白粉虱(Trialeurodesabutilonea)；牧草盲蝽(Lyguslineolaris)；紅腿幢；長(zhǎng)額負(fù)幢；棉薊馬(Thripstabaci)；煙草薊馬；朱砂葉螨；二點(diǎn)紅葉螨蔗螟；秋夜蛾，草地夜蛾；玉米穗蛾；葡萄肖葉甲(Colaspisbrunnea)；稻水象甲(Lissorhoptrusoryzophilus)；米象(Sitophilusoryzae)；黑尾葉蟬(^photettixnigropictus)；麥長(zhǎng)蝽；喜綠蟲春(AcrosternumhiIare)；大豆大豆夜娥(Pseudoplusiaincludens)；梨豆夜娥(Anticarsiagemmatalis)；苜蓿綠夜蛾(Plathypenascabra)；玉米螟,歐洲玉米螟；小地老虎；甜菜夜蛾；綠棉鈴蟲；棉鈴蟲；墨西哥豆瓢蟲(Epilachnavarivestis)；桃蚜(Myzuspersicae)；馬鈴薯微葉蟬(Empoascafabae)；喜綠蝽；紅腿蝗；長(zhǎng)額負(fù)蝗；種蠅；大豆薊馬(Sericothripsvariabilis)；豐帛J馬；草_蟲朱蟲菌(Tetranychusturkestani)；二；^紅卩十螨；M玉米螟，歐洲玉米螟；小地老虎；麥二叉蚜；麥長(zhǎng)蝽；喜綠蝽；褐臭蝽(Euschistusservus)；灰地種蠅(Deliaplatura)；黑森癭蚊；麥巖螨(Petrobialatens)油菜甘藍(lán)蟲牙(Brevicorynebrassicae)；跳甲(Phyllotretacruciferae)；披肩粘蟲(Mamestraconfigurata)；菜蛾；地種蠅屬(Delia)物種，根蛆。提高棺物產(chǎn)量的方法20[0102]提供用于提高植物產(chǎn)量的方法。該方法包括將包含本文所公開的殺蟲序列的多核苷酸引入植物或植物細(xì)胞。如本文所定義，植物的“產(chǎn)量”指由植物產(chǎn)生的生物量的質(zhì)量和/或數(shù)量。“生物量”是指任意測(cè)量的植物產(chǎn)物。生物量產(chǎn)生的提高是所測(cè)量的植物產(chǎn)物產(chǎn)量的改善。提高植物產(chǎn)量具有幾種商業(yè)應(yīng)用。例如，提高植物葉生物量可以提高用于人或動(dòng)物消費(fèi)的多葉蔬菜的產(chǎn)量。此外，提高葉生物量可以用來提高植物衍生的藥物或工業(yè)產(chǎn)物的產(chǎn)生。產(chǎn)量的提高可以包含任意統(tǒng)計(jì)上顯著的提高，其包含但不限于與不表達(dá)殺蟲序列的植物相比產(chǎn)量具有至少的提高、至少3%的提高、至少5%的提高、至少10%的提高、至少20%的提高、至少30%、至少50%、至少70%、至少100%更大的提高。在具體方法中，植物產(chǎn)量由于表達(dá)本文所公開的殺蟲蛋白的植物的改進(jìn)的害蟲抗性而提高。殺蟲蛋白的表達(dá)導(dǎo)致害蟲侵襲或攝食植物的能力降低，從而改進(jìn)植物產(chǎn)量。以說明的方式而不是限制的方式提供以下實(shí)施例。實(shí)施例棚列1.減用以下步驟從表1中所列的細(xì)菌菌株鑒定新的殺蟲基因從包含通常含有δ內(nèi)毒素基因的質(zhì)粒的菌株制備染色體外DNA;機(jī)械剪切染色體外DNA以產(chǎn)生大小不一的片段；克隆染色體外DNA的2Kb至IOKb的片段；長(zhǎng)出1500個(gè)染色體外DNA的克??；用克隆載體特異的引物對(duì)1500個(gè)克隆進(jìn)行部分測(cè)序(末端閱讀)；通過用MiDAS法(按美國專利公開號(hào)20040014091中所述，其在此完整引入作為參考)進(jìn)行同源性分析來鑒定推定的毒素基因；對(duì)包含推定的目的毒素基因的片段的克隆進(jìn)行序列補(bǔ)全(步行)。表1.從蘇云金芽孢桿菌分離的新基因列表。權(quán)利要求1.分離的核酸分子，其包含選自以下的核苷酸序列a)SEQIDNO:1-60和124-132中的任意核苷酸序列；b)與SEQIDNO:1-60和124-132中任意核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有殺蟲活性的多肽；c)編碼包含SEQIDNO:61-121和133-141中任意氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和d)編碼與SEQIDNO:61-121和133-141中任意氨基酸序列具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有殺蟲活性。2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列是已設(shè)計(jì)用于在植物中表達(dá)的合成序列。3.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列選自SEQIDNO:142-283中的任一個(gè)。4.載體，其包含權(quán)利要求1的核酸分子。5.權(quán)利要求4的載體，其還包含編碼異源多肽的核酸分子。6.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求4的載體。7.權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌宿主細(xì)胞。8.權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞，其是植物細(xì)胞。9.轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞。10.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉蜀黍、高粱、小麥、甘藍(lán)、向日葵、西紅柿、十字花科植物、胡椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜。11.具有殺蟲活性的分離的多肽，其選自以下a)包含SEQIDNO:61-121和133-141中的任意氨基酸序列的多肽；b)包含與SEQIDNO:61-121和133-141中任意氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽；c)由SEQIDNO:1-60,124-132^P142-283中任意核苷酸序列編碼的多肽；禾口d)由與SEQIDNO:1-60、124-132和142-283中任意核苷酸序列至少90%相同的核苷酸序列編碼的多肽。12.權(quán)利要求11的多肽，其還包含異源氨基酸序列。13.抗體，其選擇性結(jié)合權(quán)利要求11的多肽。14.組合物，其包含權(quán)利要求11的多肽。15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述組合物選自粉末、粉劑、丸、顆粒、噴霧、乳劑、膠體和溶液。16.權(quán)利要求14的組合物，其中通過脫水、冷凍干燥、勻漿、提取、過濾、離心、沉降或濃縮蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物制備所述組合物。17.權(quán)利要求14的組合物，其包含約至約99wt%的所述多肽。18.用于控制鱗翅目或鞘翅目害蟲群體的方法，其包括使所述群體與殺蟲有效量的權(quán)利要求11的多肽接觸。19.用于殺死鱗翅目或鞘翅目害蟲的方法，其包括用殺蟲有效量的權(quán)利要求11的多肽接觸所述害蟲，或飼喂所述害蟲。20.用于產(chǎn)生具有殺蟲活性的多肽的方法，其包括在表達(dá)編碼所述多肽的核酸分子的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞。21.包含編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的DNA構(gòu)建體已穩(wěn)定摻入其基因組的植物，其中所述核苷酸序列選自a)SEQIDNO:1_60、124-132和142-283中的任意核苷酸序列；b)與SEQIDNO:1-60、124-132和142-283中任意核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有殺蟲活性的多肽；c)編碼包含SEQIDNO:61-121和133-141中任意氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和d)編碼與SEQIDNO:61-121和133-141中任意氨基酸序列具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有殺蟲活性；其中所述核苷酸序列有效連接至驅(qū)動(dòng)編碼序列在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。22.權(quán)利要求21的植物，其中所述植物是植物細(xì)胞。23.權(quán)利要求22的植物的轉(zhuǎn)基因種子。24.用于保護(hù)植物免受害蟲的方法，其包括將至少一個(gè)包含編碼殺蟲多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體引入所述植物或其細(xì)胞，其中所訴核苷酸序列選自a)SEQIDNO:1_60、124-132和142-283中的任意核苷酸序列；b)與SEQIDNO:1-60、124-132和142-283中任意核苷酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有殺蟲活性的多肽；c)編碼包含SEQIDNO:61-121和133-141中任意氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和d)編碼與SEQIDNO:61-121和133-141中任意氨基酸序列具有至少90%氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有殺蟲活性；25.權(quán)利要求對(duì)的方法，其中所述植物產(chǎn)生具有針對(duì)鱗翅目或鞘翅目害蟲的殺蟲活性的殺蟲多肽。專利摘要本發(fā)明提供用于賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子殺蟲活性的組合物和方法。本發(fā)明提供包含δ-內(nèi)毒素多肽的編碼序列的組合物。該編碼序列可用于在植物和細(xì)菌中轉(zhuǎn)化和表達(dá)的DNA構(gòu)建體和表達(dá)盒中。該組合物還包含轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。具體而言，本發(fā)明提供分離的δ-內(nèi)毒素核酸分子。此外，本發(fā)明涵蓋對(duì)應(yīng)于多核苷酸的氨基酸序列和特異性結(jié)合那些氨基酸序列的抗體。具體而言，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含編碼SEQIDNO61-121和133-141中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或SEQIDNO1-60、124-132和142-283中所示的核苷酸序列，及其變體和片段。文檔編號(hào)C12N15/82GKCN102066408SQ200980122563公開日2011年5月18日申請(qǐng)日期2009年6月25日發(fā)明者B·麥克納爾蒂,C·坎貝爾,D·J·湯姆索,K·S·桑普森,S·阿加瓦爾申請(qǐng)人:阿森尼克斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan