一種內(nèi)毒素含量的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及內(nèi)毒素的檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種以彈力法對內(nèi)毒素含量進行分 析的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 病人在靜脈輸注藥劑后可能發(fā)生的發(fā)熱、冷感、寒顫、惡心、嘔吐、頭痛、腰及四肢 關(guān)節(jié)痛、膚色灰白、白細胞下降、血管通透性增強、昏迷、休克、死亡等一系列癥狀稱為熱原 反應。細菌內(nèi)毒素是一種最廣泛的熱原。防止輸注用藥品及器械的熱原污染，是臨床上十 分重要的。半個多世紀以來，熱原檢查法對保證注射用藥品安全發(fā)揮了重要作用。但隨著 制藥工業(yè)的發(fā)展，該方法已不完全適合許多品種的熱原檢查。為此，人們研宄了一種替代熱 原檢查法的方法，這就是我們今天正在研宄和擴大應用的細菌內(nèi)毒素檢查法。細菌內(nèi)毒素 一是革蘭氏陰性菌的細胞外壁層上的特有結(jié)構(gòu)，g卩脂多糖，具有廣泛的生物活性，以致熱居 首。其量值以國際單位（IU)或內(nèi)毒素單位（EU)表示，現(xiàn)規(guī)定1IU = 1EU。細菌內(nèi)毒素檢查 是輸注藥品及器械質(zhì)量控制中的一項重要指標。
[0003] 內(nèi)毒素檢測方法多基于豐試驗（limulus amebocyte lysate test，LAL)測定。豐 試驗是根據(jù)鱟血提取液能被皮克水平的內(nèi)毒素凝膠化的原理，通過檢測凝膠的形成來檢測 內(nèi)毒素。我國藥典規(guī)定的細菌內(nèi)毒素測定方法為池度法（turbidimetric technique)和顯 色法（Chromogenic Technique)，此外也包括一些電化學法，但這些方法都是終點法，無法 對內(nèi)毒素凝固的過程進行監(jiān)測，如在達到凝固的最高點后，產(chǎn)生的纖溶現(xiàn)象無法觀察到。另 外，傳統(tǒng)的濁度法以及電化學法檢測時間較長，已無法滿足目前高通量高效率的監(jiān)測要求 了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種直接檢測的凝固體系的彈力變 化的內(nèi)毒素檢測法，此法檢測速度快，準確率高。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種內(nèi)毒素含量的檢測方法，包括以下步驟：
[0007] 步驟1)配制至少五個含不同濃度的內(nèi)毒素標準液；
[0008] 步驟2)將已知含量的鱟試劑稀釋液分別與每個所述的內(nèi)毒素標準液按特定體積 比例混合，得到混合液；
[0009] 步驟3)分別對每個混合液采用血栓彈力圖儀檢測彈力達到0. 1振幅時所需的時 間，并繪制時間-內(nèi)毒素濃度的雙對數(shù)圖，得出標準曲線圖；
[0010] 步驟4)將步驟2)中所述鱟試劑稀釋液與待測樣品液按照步驟2)中所述的特定 體積比例混合，隨后采用血栓彈力圖儀檢測彈力達到0. 1振幅時所需的時間，并與標準曲 線圖對比，從而得出待測樣品液中的內(nèi)毒素含量。
[0011] 優(yōu)選的是，所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，所述鱟試劑稀釋液與內(nèi)毒素標準液混 合的特定體積比例為1 : 2.5~1 : 3. 5。
[0012] 優(yōu)選的是，所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，所述鱟試劑稀釋液與內(nèi)毒素標準液混 合的特定體積比例為1 : 2.9~1 : 3.1。
[0013] 優(yōu)選的是，所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，所述鱟試劑稀釋液中，鱟試劑的含量為 0? 05 ~0? 15mg/mL。
[0014] 優(yōu)選的是，所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，所述鱟試劑稀釋液中還包括有0. 03~ 0? 05mg/mL 的5A-分子篩。
[0015] 優(yōu)選的是，所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，所述鱟試劑稀釋液中還包括0.001~ 0. 002mg/mL的對甲基苯磺酸鈉。
[0016] 優(yōu)選的是，所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，所述鱟試劑稀釋液中還包括0. 0005~ 0. 001mg/mL的氯化鋰。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：與傳統(tǒng)的內(nèi)毒素檢測方法不同，該方法不是通過光學、濁度 或電化學法進行測量，而是直接檢測的凝固體系的彈力變化，得到的檢測結(jié)果涵蓋凝固過 程中所有的信息，相比傳統(tǒng)的濁度法以及電化學生物傳感器，能對整個過程進行更全面的 檢測，有利于對這種特殊的生理過程的研宄，比如達到凝固的最高點后，產(chǎn)生的纖溶現(xiàn)象也 能夠被觀察到；另外，相較于濁度法和電化學法，此法大大縮短了檢測時間，檢測的靈敏度 和精準度也得到同步提高。
【附圖說明】
[0018] 圖1為內(nèi)毒素誘導彈力變化機理示意圖。
[0019] 圖2為不同濃度內(nèi)毒素誘導彈力變化曲線圖，由圖2可知，若振幅上升得越快，則 表明內(nèi)毒素濃度越高。
[0020] 圖3為內(nèi)毒素檢測的標準曲線圖。（以實施例1為例）
[0021] 圖4為彈力檢測法與電化學檢測法、濁度檢測法的檢測時間對比圖。（以實施例1 為例）
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實施。
[0023] 鑒于內(nèi)毒素定量檢測的重大意義，以及現(xiàn)階段檢測技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一 種檢測液體中內(nèi)毒素含量的新方法。對于鱟血變形細胞裂解液凝集反應機制研宄，一直到 20世紀70年代后期才由日本學者所闡明。鱟血變形細胞裂解液中有許多能被內(nèi)毒素激活 的凝固系統(tǒng)，主要有凝固酶原、C因子、B因子及凝固蛋白原等，內(nèi)毒素激活C因子，活化的C 因子又激活B因子，或由（1-3) - -D-葡聚糖激活G因子（G因子系統(tǒng)），接著激活的B因子 或激活的G因子，再去激活凝固酶原，使其轉(zhuǎn)化為活化的凝固酶，該酶切斷凝固蛋白原中特 定的精氨肽鏈，形成凝固蛋白，產(chǎn)生凝膠。（參見圖1)
[0024] 作為本案一實施例的內(nèi)毒素含量的檢測方法，包括以下步驟：
[0025] 步驟1)配制至少五個含不同濃度的內(nèi)毒素標準液；
[0026] 步驟2)將已知含量的鱟試劑稀釋液分別與每個內(nèi)毒素標準液按特定體積比例混 合，得到混合液；
[0027] 步驟3)分別對每個混合液采用血栓彈力圖儀檢測彈力達到0. 1振幅時所需的時 間，并繪制時間-內(nèi)毒素濃度的雙對數(shù)圖，得出標準曲線圖；
[0028] 步驟4)將步驟2)中的鱟試劑稀釋液與待測樣品液按照步驟2)中的特定體積比 例混合，隨后采用血栓彈力圖儀檢測彈力達到0. 1振幅時所需的時間，并與標準曲線圖對 比，從而得出待測樣品液中的內(nèi)毒素含量。
[0029] 其中，鱟試劑是成熟的市售商品，可購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司。血栓彈力 圖儀也是成熟的市售產(chǎn)品，可購自多家醫(yī)療器械公司，本案對血栓彈力圖儀無需做特殊限 定。步驟3)得出的標準曲線圖應趨于線性。
[0030] 作為本案另一實施例，其中，鱟試劑稀釋液與內(nèi)毒素標準液混合的特定體積比例 優(yōu)選為1 : 2.5~1 : 3.5。實驗發(fā)現(xiàn)，該比例應被限定，若不將該比例限定在一個很小的 范圍內(nèi)，得出的標準曲線圖將偏離線性，且超出該比例范圍越多，偏離越嚴重。
[0031] 作為本案又一實施例，其中，鱟試劑稀釋液與內(nèi)毒素標準液混合的特定體積比例 為1 : 2.9~1 : 3.1。實驗發(fā)現(xiàn)，在該比例下，標準曲線圖的線性擬合指數(shù)R2> 0. 985， 說明標準曲線圖已完美接近于一條直線，由此測得的內(nèi)毒素含量將更加精準。（R2由軟件 0rigin8擬合獲得）
[0032] 作為本案又一實施例，其中，鱟試劑稀釋液中，鱟試劑的含量優(yōu)選為0.05~ 0. 15mg/mL。通過實驗發(fā)現(xiàn)，鱟試劑的含量大小也會影響最終所得的標準曲線圖的線性擬合 指數(shù)，通過對比得出，將鱟試劑的含量限定在該范圍內(nèi)，可以獲得最理想的標準曲線圖。
[0033] 作為本案又一實施例，其中，鱟試劑稀釋液中還包括有0. 03~0. 05mg/mL的5A?分 子篩。實驗發(fā)現(xiàn)，分子篩可以調(diào)節(jié)內(nèi)毒素與鱟試劑的反應速率，并且能夠在凝固達到最高點 時，延長纖溶現(xiàn)象存在的時間，使其能夠被更容易的觀察到。但分子篩的添加量應被限制， 若超出該范圍，其將會影響標準曲線的線性擬合指數(shù)。不僅添加量應被限制，分子篩的規(guī)格 也應被限定，實驗發(fā)現(xiàn)，3A分子篩和4A?分子篩均不能實現(xiàn)其延長纖溶現(xiàn)象存在的時間的功 能，而僅有5A分子篩可以實現(xiàn)這一功能，并且分子篩也能在一定程度上給標準曲線的線 性擬合指數(shù)帶來積極影響。
[0034] 作為本案又一實施例，其中，鱟試劑稀釋液中還包括0. 001~0. 002mg/mL的對甲 基苯磺酸鈉。對甲基苯磺酸鈉是助劑，可改善內(nèi)毒素與鱟試劑的反應速度，并提高標準曲線 的線性擬合指數(shù)。作為更優(yōu)選的方案，還可在豐試劑稀釋液中再加入〇.0005~0. 001mg/mL 的氯化鋰，它與對甲基苯磺酸鈉可發(fā)揮協(xié)效作用，進一步改善標準曲線的線性擬合指數(shù)，使 內(nèi)毒素的檢測更加準確靈敏。
[0035] 以下是具體實施例，其中，均使用這7種不同濃度的內(nèi)毒素標準液：0.01、0. 05、 0? 2、0. 5、1. 0、2. 0、10. 0、20. 0(EU/mL) 〇
[0036]
【主權(quán)項】
1. 一種內(nèi)毒素含量的檢測方法，包括以下步驟： 步驟1)配制至少五個含不同濃度的內(nèi)毒素標準液； 步驟2)將已知含量的鱟試劑稀釋液分別與每個所述的內(nèi)毒素標準液按特定體積比例 混合，得到混合液； 步驟3)分別對每個混合液采用血栓彈力圖儀檢測彈力達到0. 1振幅時所需的時間，并 繪制時間-內(nèi)毒素濃度的雙對數(shù)圖，得出標準曲線圖； 步驟4)將步驟2)中所述鱟試劑稀釋液與待測樣品液按照步驟2)中所述的特定體積 比例混合，隨后采用血栓彈力圖儀檢測彈力達到0. 1振幅時所需的時間，并與標準曲線圖 對比，從而得出待測樣品液中的內(nèi)毒素含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，其特征在于，所述鱟試劑稀釋液與 內(nèi)毒素標準液混合的特定體積比例為1 : 2.5~1 : 3.5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，其特征在于，所述鱟試劑稀釋液與 內(nèi)毒素標準液混合的特定體積比例為1 : 2.9~1 : 3.1。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，其特征在于，所述鱟試劑稀釋液中， 鱟試劑的含量為〇? 05~0? 15mg/mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，其特征在于，所述鱟試劑稀釋液中 還包括有〇. 03~0. 05mg/mL的5A'分子篩。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，其特征在于，所述鱟試劑稀釋液中 還包括0. 001~0. 002mg/mL的對甲基苯磺酸鈉。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的內(nèi)毒素含量的檢測方法，其特征在于，所述鱟試劑稀釋液中 還包括0? 0005~0? 001mg/mL的氯化鋰。
【專利摘要】本案公開了一種內(nèi)毒素含量的檢測方法，包括以下步驟：S1配制至少五個含不同濃度的內(nèi)毒素標準液；S2將鱟試劑稀釋液分別與每個內(nèi)毒素標準液按比例混合；S3分別對每個混合液采用血栓彈力圖儀檢測彈力達到0.1振幅時所需的時間，并繪制時間-內(nèi)毒素濃度的雙對數(shù)圖，得出標準曲線圖；S4將鱟試劑稀釋液與待測樣品液按照特定比例混合，隨后采用血栓彈力圖儀檢測彈力達到0.1振幅時所需的時間，并與標準曲線圖對比，從而得出待測樣品液中的內(nèi)毒素含量。本案相比傳統(tǒng)的濁度法以及電化學生物傳感器，能對整個過程進行更全面的檢測，有利于對這種特殊的生理過程的研究，并且大大縮短了檢測時間，檢測的靈敏度和精準度也得到同步提高。
【IPC分類】G01N33-48
【公開號】CN104698159
【申請?zhí)枴緾N201510103960
【發(fā)明人】繆鵬, 王弼陡, 孫海旋, 錢俊, 田浩然, 王丹怡, 唐玉國
【申請人】中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術(shù)研究所
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月10日