許評(píng)估多個(gè)蛋白質(zhì)間的氨基酸（或DM)相似性和同一性。 用于進(jìn)行序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性實(shí)例是Myers和Miller (1988)CABI0S 4:11-17的算法。運(yùn)種算法已并入ALIGN程序（2.0版），其是GCG Wisconsin Genetics Software F*ackage,版本 10 (可從 Accelrys, Inc. ,9685Scranton Rd., San Diego, CA, USA 獲得）的部分。當(dāng)用ALIGN程序進(jìn)行氨基酸序列比較時(shí)，可W使用PAM120權(quán)重余數(shù)表 (wei曲t residue t油le)，缺口長(zhǎng)度罰分12和缺口罰分4。
[002引除非另作說(shuō)明，將使用W下參數(shù)，用GAP版本10 (其使用化edleman和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3) : 443-453的算法）來(lái)測(cè)定序列同一性或相似性：核巧酸 序列的％同一性和％相似性使用缺口權(quán)重（GAP Wei曲t) 50和長(zhǎng)度權(quán)重3和nwsgap化a. cmp 評(píng)分矩陣；氨基酸序列的％同一性或％相似性使用缺口權(quán)重8和長(zhǎng)度權(quán)重3和化0SUM62評(píng) 分程序。還可W使用等同的程序。"等同的程序"指任意序列比較程序，其為所討論的任意 兩條序列產(chǎn)生運(yùn)樣的比對(duì)，當(dāng)與由GAP Version 10產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)的比對(duì)相比時(shí)，該比對(duì)具有 相同的核巧酸殘基匹配和相同的百分比序列同一性。本發(fā)明還包含變體核酸分子。5-內(nèi) 毒素編碼核巧酸序列的"變體"包含編碼本文所公開的5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)，但由于遺傳密碼 的簡(jiǎn)并性而保守地不同的那些序列，W及如上文所討論的幾乎相同的那些序列?？蒞用熟 知的分子生物學(xué)技術(shù)，如下文概述的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)和雜交技術(shù)來(lái)鑒定天然存在的等 位變體。變體核巧酸序列還包含合成衍生的核巧酸序列，其通過(guò)例如使用位點(diǎn)定向誘變產(chǎn) 生，但其仍按下文所討論編碼本發(fā)明中公開的5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)。本發(fā)明所包含的變體蛋 白質(zhì)是有生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)保持所希望的天然蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，即保留殺蟲 活性。"保留活性"是指變體可具有至少約30%、至少約50%、至少約70%或至少約80%天 然蛋白質(zhì)的殺蟲活性。測(cè)量殺蟲活性的方法為本領(lǐng)域熟知。見例如Czapla和Lang(1990) J. Econ. Elntomol. 83:2480-2485 ;An化ews 等（1988) Biochem. J. 252:199-206 sMarrone 等 (1985) J. of Economic 化tomology78:290-293 ;和美國(guó)專利號(hào)5, 743, 477,所有文獻(xiàn)在此完 整引入作為參考。
[0029] 熟練的技術(shù)人員可進(jìn)一步理解，可W通過(guò)本發(fā)明的核巧酸序列的突變來(lái)引入改 變，從而在不改變蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的情況下導(dǎo)致所編碼的5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)氨基酸序列 中的改變。因此，可W通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)核巧酸取代、添加或缺失引入本文所公開的對(duì)應(yīng)核 巧酸序列來(lái)產(chǎn)生分離變體的核酸分子，W便將一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失引入所 編碼的蛋白質(zhì)?？蒞通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如位點(diǎn)定向誘變和PCR介導(dǎo)的誘變引入突變。運(yùn)類變 體核巧酸序列也包含于本發(fā)明。
[0030] 例如，可W在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基處產(chǎn)生保守氨基酸取代。"非必 需"氨基酸殘基是可W在不改變生物學(xué)活性的情況下從5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的野生型序列 改變的殘基，而"必需"氨基酸殘基為生物學(xué)活性所需。"保守氨基酸取代"是用具有相似側(cè) 鏈的氨基酸殘基取代該氨基酸殘基的取代。已在本領(lǐng)域內(nèi)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘 基的家族。運(yùn)些家族包含具有堿性側(cè)鏈（例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、酸性側(cè)鏈（例如 天冬氨酸、谷氨酸）、不帶電荷的極性側(cè)鏈（例如甘氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、絲氨酸、蘇氨 酸、酪氨酸、半脫氨酸）、非極性側(cè)鏈（例如丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙 氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、P分支（P-branched)側(cè)鏈（例如蘇氨酸、鄉(xiāng)氨酸、異亮氨酸） 和芳香族側(cè)鏈（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。
[0031] 5-內(nèi)毒素一般具有5個(gè)保守序列域和3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（見例如de Maagd等 (2001)Trends Genetics 17:193-199)。第一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域由7個(gè)a螺旋組成并設(shè)及膜插 入和管孔形成。結(jié)構(gòu)域II由W希臘鑰匙構(gòu)型排列的3個(gè)P-片層組成，而結(jié)構(gòu)域III由" 薄卷餅"型的兩個(gè)反平行P -片層組成（de Maagd等，2001，上文）。結(jié)構(gòu)域II和III設(shè) 及受體識(shí)別和結(jié)合，并因此認(rèn)為它們是毒素特異性決定子。
[0032] 可W在保留功能的非保守區(qū)域中進(jìn)行氨基酸取代。一般，不對(duì)保守氨基酸殘基或 處于保守基序內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行運(yùn)類取代，其中運(yùn)類殘基是蛋白質(zhì)活性必需的。保守且 可W為蛋白質(zhì)活性必需的殘基實(shí)例包含，例如，包含于本發(fā)明的氨基酸序列比對(duì)中的所有 蛋白質(zhì)和已知的5-內(nèi)毒素序列間相同的殘基。保守但可W允許保守氨基酸取代且仍保留 活性的殘基的實(shí)例包含，例如，在包含于本發(fā)明的氨基酸序列比對(duì)中的所有蛋白質(zhì)和已知 的5-內(nèi)毒素序列間僅具有保守取代的殘基。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，功能性變體可 W在保守殘基中具有較少的保守或非保守改變。
[0033] 備選地，可W通過(guò)沿全部或部分編碼序列隨機(jī)引入突變，如通過(guò)飽和誘變來(lái)產(chǎn)生 變體核巧酸序列，并可W針對(duì)賦予5-內(nèi)毒素活性的能力篩選產(chǎn)生的突變體來(lái)鑒定保留活 性的突變體。誘變后，可W重組表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)，并可W用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)的 活性。
[0034] 可W用如PCR、雜交等的方法鑒定對(duì)應(yīng)的5-內(nèi)毒素序列，運(yùn)類序列與本發(fā)明 的序列具有基本的同一性。見例如Sambrook和Russell (2001)Molecula;r Cloning:A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY) 和 Innis 等(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press, NY) 〇
[0035] 在雜交法中，可W用全部或部分5-內(nèi)毒素核巧酸序列來(lái)篩選cDNA或基因組 文庫(kù)。構(gòu)建運(yùn)類cDNA和基因組文庫(kù)的方法一般為本領(lǐng)域已知并公開于Sambrook和 Russell, 2001，上文中。所謂的雜交探針可W是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其 他寡核巧酸，并可W用可檢測(cè)基團(tuán)如 3中或任意其他可檢測(cè)標(biāo)記，如其他放射性同位素、巧 光化合物、酶或酶輔因子標(biāo)記?？蒞根據(jù)本文所公開的已知的5-內(nèi)毒素編碼核巧酸序列， 通過(guò)標(biāo)記合成的寡核巧酸來(lái)產(chǎn)生用于雜交的探針。此外，可W使用根據(jù)核巧酸序列或所編 碼的氨基酸序列中的保守核巧酸或氨基酸殘基設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物。探針通常包含在嚴(yán)格條件 下與本發(fā)明的5 -內(nèi)毒素編碼核巧酸序列或其片段或變體的至少約12、至少約25、至少約 50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400個(gè)相鄰核巧酸雜交的核巧酸序列區(qū)域。 用于制備雜交探針的方法一般為本領(lǐng)域已知并公開于Sambrook和Russell, 2001,上文中， 其在此引用作為參考。
[0036]例如，可W將本文所公開的整個(gè)5 -內(nèi)毒素序列或其一個(gè)或多個(gè)部分用作能夠特 異性地與對(duì)應(yīng)的5-內(nèi)毒素樣序列和信使RNA雜交的探針。為了在各種條件下達(dá)到特異性 雜交，運(yùn)類探針包含獨(dú)特且優(yōu)選長(zhǎng)度為至少約10個(gè)核巧酸或長(zhǎng)度為至少約20個(gè)核巧酸的 序列。可W用運(yùn)類探針通過(guò)PCR從所選擇的生物體擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的5-內(nèi)毒素序列。該技術(shù)可 W用來(lái)從所希望的生物體分離其他編碼序列或作為診斷測(cè)定來(lái)測(cè)定編碼序列在生物體中 的存在。雜交技術(shù)包含涂布DNA文庫(kù)的雜交篩選（隧斑或菌落；見例如Sambrook等（1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。
[0037] 運(yùn)類序列的雜交可W在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格雜交條件"是指運(yùn)樣 的條件，在該條件下，探針可與其祀序列雜交至高于與其他序列的雜交的可檢測(cè)程度（例 如超過(guò)背景至少2倍）。嚴(yán)格條件是序列依賴性的且在不同環(huán)境中可不同。通過(guò)控制雜交 和/或洗涂條件的嚴(yán)格性，可W鑒定與探針100 %互補(bǔ)的祀序列（同源探測(cè)）。備選地，可W 將嚴(yán)格性條件調(diào)整為允許序列中的一些錯(cuò)配，W便于檢測(cè)較低程度的相似性（異源探測(cè)）。 一般，探針長(zhǎng)度小于約1000個(gè)核巧酸，優(yōu)選長(zhǎng)度小于500個(gè)核巧酸。
[0038] 通常，嚴(yán)格條件可W是運(yùn)樣的條件：在抑7. 0至8. 3,鹽濃度低于約1. 5M鋼離子， 通常為約0. 01至1. 0M鋼離子濃度（或其他鹽類），溫度對(duì)短探針（例如10至50個(gè)核巧 酸）為至少約30°C，對(duì)長(zhǎng)探針（例如大于50個(gè)核巧酸）為至少約60°C。還可W用去穩(wěn)定劑 如甲酯胺的加入達(dá)到嚴(yán)格條件。示例性低嚴(yán)格性條件包含在37°C下用30-35%甲酯胺、1M 化C1、1%SDS (十二烷基硫酸鋼）的緩沖液雜交，并在50-55°C下在IX至2X SSC(20X SSC =3. 0M化C1/0. 3M巧樣酸S鋼）中洗涂。示例性中等嚴(yán)格性條件包含在37°C下在40-45% 甲酯胺、1.0M NaCl、l%SDS中雜交，并在55-60°C下在0. 5X至IX SSC中洗涂。示例性高 嚴(yán)格性條件包含在37°C下在50%甲酯胺、1M化Cl、l% SDS中雜交，并在60-65°C下在0.1 X SSC中洗涂?？蛇x地，洗涂緩沖液可W包含約0. 1 %至約1% SDS。雜交時(shí)間一般少于約24 小時(shí)，通常為約4至約12小時(shí)。
[0039] 特異性通常是雜交后洗涂的函數(shù)，臨界因子是最終洗涂溶液的離子強(qiáng)度和溫度。 對(duì)于 DNA-DNA 雜種，可 W從 Meinkoth 和 W址 1 (1984) Anal. Biochem. 138:267-284 的方程得 出近似1"值：1'。=81.51：+16.6(1〇邑1)+0.41(%0〇-0.61(%甲酯胺）-500/1;其中1是單 價(jià)鹽離子的體積摩爾濃度，％ GC是DNA中鳥巧和胞喀晚核巧酸的百分比，％甲酯胺是雜 交溶液中甲酯胺的百分比，L是W堿基對(duì)計(jì)的雜化物的長(zhǎng)度。Tm是在該溫度下50%互補(bǔ)祀 序列與完全匹配的探針雜交的溫度。對(duì)每1 %的錯(cuò)配，Tm降低約rC ;因此，可W調(diào)節(jié)Tm、雜 交和/或洗涂條件來(lái)與具有所希望的同一性的序列雜交。例如，如果尋找具有> 90%同一 性的序列，可W將Tm降低10°C。一般，在給定的離子強(qiáng)度和抑下，選擇嚴(yán)格條件為比特定 序列和它的互補(bǔ)序列的熱烙點(diǎn)（thermal melting point，Tm)低約5°C。但是，極嚴(yán)格條件 可W利用比熱烙點(diǎn)（Tm)低1、2、3或4°C下的雜交和/或洗涂；中等嚴(yán)格條件可W利用比熱 烙點(diǎn)（Tm)低6、7、8、9或10°C下的雜交和/或洗涂；低嚴(yán)格性條件可W利用比熱烙點(diǎn)（Tm)低 11、12、13、14、15或20°(：下的雜交和/或洗涂。普通技術(shù)人員可理解，利用該方程、雜交和 洗涂組合物和所希望的Tm，隱喻了雜交和/洗涂溶液的嚴(yán)格性中的變化。如果所希望的錯(cuò) 配程度導(dǎo)致低于45°C (水性溶液）或32°C (甲酯胺溶液）的Tm，則優(yōu)選提高SSC濃度，使 得可W使用較高的溫度。核酸雜交的大量指導(dǎo)見于Tijssen(1993)L油oratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, 第 I 部分，第 2 章巧Isevier,紐約）；和 Ausubel 等，編輯（1995)Qi;rrent Protocols in Molecular Biology,第 2 章（Greene Publishing and Wiley-Interscience,紐約）中。見 Sambrook等（1989)Molecular Cloning:A L油oratory Manual(第 2 版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出 版社，冷泉港，紐約（Cold Spring 化rbor L油oratory Press, Cold Spring 化rbor,化W York))〇
[0040] 分離的帝白質(zhì)及其巧體巧片段
[0041] 5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)也包含于本發(fā)明內(nèi)。"5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)"是指具有SEQ ID N0:61-121和133-141中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。還提供其片段、生物學(xué)活性部分和變 體，且其可W用來(lái)實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0042]"片段"或"生物學(xué)活性部分"包含含有與SEQ ID N0:61-121和133-141的任一項(xiàng)中 所示的氨基酸序列幾乎相同的氨基酸序列并顯示殺蟲活性的多膚片段。5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì) 的生物學(xué)活性部分可W是長(zhǎng)度為例如1〇、25、50、100或更多個(gè)氨基酸的多膚?？蒞通過(guò)重 組技術(shù)制備運(yùn)類生物學(xué)活性部分并評(píng)估其殺蟲活性。測(cè)量殺蟲活性的方法為本領(lǐng)域熟知。 見例如 Czapla 和 Lang (1990) J. Econ. Elntomol. 83:2480-2485 ;An化ews 等（1988) Biochem. J. 252:199-206 ;Marrone 等（1985) J. of Economic 化tomology 78:290-293;和美國(guó)專利 號(hào)5, 743, 477,所有文獻(xiàn)在此完整引入作為參考。如此處所用，片段包含SEQ ID NO:61-121 和133-141的至少8個(gè)郵連氨基酸。但是，本發(fā)明包含其他片段，如大于約10、20、30、50、 100、150、200、250、300、350、400、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、 1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)中的任意片段。
[0043]"變體"是指與SEQ ID N0:61-121和133-141中任一項(xiàng)的氨基酸序列具有至少約 60%、65%、約70%、75%、約80%、85%、約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多膚。變體還包含由在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 1-60 和124-132的核酸分子雜交的核酸分子或其互補(bǔ)分子編碼的多膚。變體包含由于誘變而 在氨基酸序列中不同的多膚。本發(fā)明所包含的變體蛋白質(zhì)是有生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù) 保持所希望的天然蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，即保留殺蟲活性。測(cè)量殺蟲活性的方法為本領(lǐng)域 熟知。見例如 Czapla 和 Lang (1990) J. Econ. Elntomol. 83:2480-2485 ;An化ews 等（1988) Biochem. J. 252:199-206 sMarrone 等（1985) J. of Economic Elntomology 78:290-293 ;和 美國(guó)專利號(hào)5, 743, 477,所有文獻(xiàn)在此完整引入作為參考。
[0044] 細(xì)菌基因，如本發(fā)明的axmi基因常在靠近可讀框起點(diǎn)處具有多個(gè)甲硫氨酸起始 密碼子。通常，在一個(gè)或多個(gè)運(yùn)些起始密碼子處的翻譯起始可導(dǎo)致功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。運(yùn) 些起始密碼子可W包含ATG密碼子。但是，細(xì)菌如芽抱桿菌屬物種度acillusSP.)還將密 碼子GTG識(shí)別為起始密碼子，在GTG密碼子處起始翻譯的蛋白質(zhì)在第一個(gè)氨基酸處包含甲 硫氨酸。此外，通常不確定運(yùn)些密碼子中的哪一個(gè)是細(xì)菌中天然優(yōu)先使用的。因此，據(jù)理解， 備選甲硫氨酸密碼子之一的使用也可W導(dǎo)致編碼殺蟲活性的5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。運(yùn) 些5-內(nèi)毒素蛋白質(zhì)包含于本發(fā)明中并可W用于本發(fā)明的方法。
[0045] 針對(duì)本發(fā)明的多膚或針對(duì)其變體或片段的抗體也涵蓋于本發(fā)明。產(chǎn)生抗體的方法 為本領(lǐng)域熟知（見例如 Harlow 和 Lane (1988) Antibodies:A L油oratory Ma