專利名稱：一種從桃兒七中制備高純度鬼臼毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從植物中提取鬼臼毒素的方法，特別是一種從桃兒七中制備高 純度鬼臼毒素的方法。
鬼臼毒素(podophyllotoxin)又叫鬼臼素、鬼臼毒、鬼臼脂素，是一種 具抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，屬木脂素類化合物中的環(huán)木脂內(nèi)酯。其化學(xué)名為 [5R- (5 a ， 5 a 0 ， 8a a ， 9 a ) ]， 5， 8， 8 a ， 9-四氫-9-羥-5- (3， 4， 5-三甲氧苯基) 呋喃(3'，4': 6,7)萘并-[2，3-d]-l,3-間二氧雜環(huán)烯-6(5a H)-酮。分子式 C22H2208， 分子量414.41，結(jié)構(gòu)式為通式I :
鬼臼毒素可用于治療尖銳濕疣、抑制皰疹病毒。同時自50年代鬼臼毒素 被證實(shí)對腫瘤細(xì)胞有治療效果以后，人們加強(qiáng)了對鬼臼毒素的研究并合成了 大量的鬼臼毒素衍生物，篩選出了SP-G (鬼臼毒素葡萄糖與苯甲醛的縮合產(chǎn) 物)、SP-1 (鬼臼酸乙基酰肼)、依托泊甙(VP-16)和替尼泊甙(VM-26)等幾 種高活性抗腫瘤藥物。
目前，鬼臼毒素主要從小檗科的八角蓮屬、桃兒七屬和山荷葉屬等屬植 物中分離得到。杉UL七(Podophyllum emodi Wall. var. chi膽se Sprague) 又名大黃鬼臼、華鬼臼、桃耳七、小葉蓮，為小檗科植物，生長于山中林下陰 濕的地方，在我國資源十分豐富，主要分布在甘肅、陜西、西藏、青海等省。
背景技術(shù)：
3地下部分或果實(shí)入藥，其性溫味苦，有和血、止血、除風(fēng)濕、解毒、消腫之功 效。
目前從桃兒七中提取純化鬼臼毒素的生產(chǎn)方法大致可分為化學(xué)溶劑提取 分離法和常壓柱層析分離法兩類，傳統(tǒng)的化學(xué)溶劑提取分離方法具有操作簡 單，產(chǎn)量大的優(yōu)點(diǎn)，但提取純化過程中都需要用到苯或甲苯等毒性較大的溶劑， 給操作者造成危害較大，對環(huán)境污染嚴(yán)重，且所得產(chǎn)品純度低。常壓柱層析分 離法雖然能得到高純度的產(chǎn)品，但操作繁瑣，且產(chǎn)量低，分離效率差，生產(chǎn)周 期長，需消耗大量的洗脫劑，硅膠利用率低。
中國專利CN1253456C公告的一種從桃兒七中制備鬼臼毒素的方法，其是 將桃兒七根莖粉碎后，加入90%乙醇溶液，在70。C回流提取3次，合并提取液， 減壓濃縮，得棕紅色漿狀物；在棕紅色漿狀物，加入石油醚，攪拌使其充分萃 取，靜置分層，棄去下層棕紅色液體，將上層淡黃色液體靜置結(jié)晶，離心過濾， 得白色至淡黃色針狀晶體，此即為鬼臼毒素粗品，繼而用柱層析分離與純化， 得到鬼臼毒素精品。
在柱層析分離與純化時，先用氯仿溶解鬼臼毒素粗品，再流過裝有硅膠 的減壓層析柱；用醇類或酮類與氯仿的混合液進(jìn)行洗脫，收集部分洗脫液，減 壓濃縮至干，得白色提取物，即為純度91.1-98.75%的鬼臼毒素精品。
但是上述方法得到的鬼臼毒素精品純度略低且不太穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
為了避免以往工藝的缺點(diǎn)，節(jié)約資源，簡化工序，縮短生產(chǎn)周期，直接 分離得到高純度的鬼臼毒素，并減少對操作者的危害，本發(fā)明提供了一種新的 從桃兒七中制備高純度鬼臼毒素的方法，該方法得到的鬼臼毒素純度大于99%。 對于保護(hù)日趨減少的鬼臼毒素資源，降低生產(chǎn)成本，促進(jìn)鬼臼毒素應(yīng)用，具有 極為重要的意義。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種從桃兒七中制備高純度鬼臼毒素的方法，分為原料用醇類提取得浸 膏再經(jīng)萃取得鬼臼毒素粗品和鬼臼毒素粗品高壓柱層析兩部分組成，具體步驟
為將桃兒七根莖經(jīng)超微粉碎后，在超聲波條件下用醇類溶劑加熱50-6CTC提 取三次，合并三次提取液，合并提取液濃縮醇類溶劑，得到比重為1.0-1.2的紅褐色浸膏；再加入1-2倍浸膏體積量的水得到鬼臼毒素醇水相；鬼臼毒素醇 水相用等體積的二氯甲垸萃取三次，合并三次的二氯甲垸相，濃縮得到純度為 40%-50%的淡黃色鬼臼毒素粗品；淡黃色鬼臼毒素粗品用二氯甲垸溶解，上樣 至硅膠為300-400目的高壓柱，用丙酮+二氯甲烷溶劑的混合洗脫液洗脫，收集 產(chǎn)品段洗脫液，過濾濃縮后，烘干即得到純度大于99%的鬼臼毒素精品。
為了使植物細(xì)胞中有效組分全部釋放出來，將桃兒七根莖經(jīng)超微粉碎至 粒徑IO y m以下，使其小于植物細(xì)胞的平均直徑15-25 ix m。
所用超聲波的功率為1000-10000W。
在本發(fā)明中，所述二氯甲垸相用無水硫酸鈉干燥過濾后濃縮干，6(TC干
燥，得到純度為40%-50%的淡黃色鬼臼毒素粗品。
在本發(fā)明中，所述醇類溶劑為甲醇或乙醇，優(yōu)選為甲醇。 所述高壓柱的柱壓為2. 5 3. 5MPa。內(nèi)徑為100-250mm，層析柱層徑高比為
1 : 10-20。
所述洗脫液中丙酮與氯仿的體積比為i: 20。
在本發(fā)明中，洗脫液過濾濃縮后，采用6(TC進(jìn)行鼓風(fēng)干燥。 本發(fā)明的方法克服了以前工藝的提取效率低，所用溶劑毒性大，產(chǎn)品顏 色差，純度低的缺點(diǎn)，具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、 不采用傳統(tǒng)的加熱浸泡并濃縮干的方法，而是原料經(jīng)超微粉碎，在超 聲波條件下加熱浸泡，濃縮后到一定比重再萃取浸膏的醇水相，操作簡便，提 取完全徹底，提取效率高，直接得到的產(chǎn)品純度高。
2、 去除了過去用苯等毒性較大的溶劑化學(xué)結(jié)晶的方法，而采用毒性相對 低的丙酮和二氯甲垸溶劑進(jìn)行柱層析，對人體危害更小，對環(huán)境污染低。
3、 使用特制高壓柱進(jìn)行層析，上樣量大，周期短，分離度好，產(chǎn)品純度 高，硅膠可重復(fù)利用。
4、 避免了過去高溫加熱高溫烘干工序，而采用6(TC進(jìn)行鼓風(fēng)干燥，產(chǎn)品 質(zhì)量好。
本發(fā)明得到的鬼臼毒素純度大于99% 。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明內(nèi)容通過以下的實(shí)施例作進(jìn)一步的闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
5 kg超微粉碎粒徑10"m以下的桃兒七根莖用30 L甲醇50'C浸泡，用功 率為1000W超聲波提取3次，3小時每次，合并3次提取液濃縮得到4.8 L比重為 l.l的紅褐色浸膏，轉(zhuǎn)入萃取罐并加入9.6L 7jC，共用15L二氯甲垸分3次萃取， 合并3次二氯甲烷相，用無水硫酸鈉干燥過濾后濃縮干，并采用6(TC烘干得640 g淡黃色鬼臼毒素粗品粉末。淡黃色鬼臼毒素粗品粉末3L二氯甲烷溶解，濕法 上樣至填料為300-400目硅膠高壓柱，其中高壓柱的柱壓為2. 5 3.5MPa，高壓 柱內(nèi)徑為100咖，層析柱層徑高比為1 : 12，用比例為l: 20的丙酮和二氯甲烷的
混合洗脫液洗脫，收集鬼臼毒素產(chǎn)品部分，濃縮至大量產(chǎn)品析出，過濾，采用 6(TC鼓風(fēng)干燥得到鬼臼毒素精品白色粉末150 g， HPLC檢測純度為99. 22%。
實(shí)施例2
50 kg超微粉碎粒徑10ixm以下的桃兒七根莖用300 L甲醇50'C浸泡，用 功率為5000W超聲波提取3次，3小時每次，合并3次提取液濃縮得到48. 6 L比重 為l.l的紅褐色浸膏，轉(zhuǎn)入萃取罐并加入IOO L水，共用150 L二氯甲垸分3次 萃取，合并3次二氯甲垸相，無水硫酸鈉干燥過濾后濃縮干，并采用6(TC烘干 得6240 g淡黃色鬼臼毒素粗品粉末。淡黃色鬼臼毒素粗品粉末20 L二氯甲烷溶 解，濕法上樣至填料為300-400目硅膠高壓柱，其中高壓柱的柱壓為2.5 3.5MPa，高壓柱內(nèi)徑為200mm，層析柱層徑高比為l : 12.5,用比例為l: 20的丙 酮和二氯甲垸混合液洗脫，收集鬼臼毒素產(chǎn)品部分，濃縮至大量產(chǎn)品析出，過 濾，采用60。C鼓風(fēng)干燥烘干得到白色粉末1534 g， HPLC檢測純度為99. 37%。
實(shí)施例3
5 kg超微粉碎粒徑10um以下的桃兒七根莖用30 L乙醇6(TC浸泡，用功 率為1000W超聲波提取3次，3小時每次，合并3次提取液濃縮得到4. 82 L比重為 1.08的紅褐色浸膏，轉(zhuǎn)入萃取罐并加入10L水，共用15L二氯甲垸分3次萃取， 合并3次二氯甲烷相，無水硫酸鈉干燥過濾后濃縮干，并采用60'C烘干得624g 淡黃色鬼臼毒素粗品粉末。淡黃色鬼臼毒素粗品粉末3L二氯甲烷溶解，濕法上 樣至填料為300-400目硅膠高壓柱，其中高壓柱的柱壓為壓力2. 5 3. 5MPa,高
6壓柱內(nèi)徑為100mm，層析柱層徑高比為l : 12，用比例為h 20的丙酮和二氯甲烷 混合液洗脫，收集鬼臼毒素產(chǎn)品部分，濃縮至大量產(chǎn)品析出，過濾，采用60 。C鼓風(fēng)干燥烘干得到白色粉末148 g， HPLC檢測純度為99. 47%。
實(shí)施例4
50 kg超微粉碎粒徑10um以下的桃兒七根莖用300 L乙醇60。C浸泡，用 功率為5000W超聲波提取3次，3小時每次，合并3次提取液濃縮得到47. 7 L比重 為1.12的紅褐色浸膏，轉(zhuǎn)入萃取罐并加入IOO L水，共用150 L二氯甲烷分3 次萃取，合并3次二氯甲烷相，無水硫酸鈉干燥過濾后濃縮干，并采用6(TC烘 干得6212 g淡黃色鬼臼毒素粗品粉末。淡黃色鬼臼毒素粗品粉末20 L二氯甲烷 溶解，濕法上樣至填料為300-400目硅膠高壓柱，其中高壓柱的柱壓為2.5 3.5MPa，高壓柱內(nèi)徑為200隱,層析柱層徑高比為1 : 12.5，用比例為l: 20的丙 酮和二氯甲垸混合液洗脫，收集鬼臼毒素產(chǎn)品部分，濃縮至大量產(chǎn)品析出，過 濾，采用60。C鼓風(fēng)干燥烘干得到白色粉末1516 g， HPLC檢測純度為99. 48%。
權(quán)利要求
1. 一種從桃兒七中制備高純度鬼臼毒素的方法，分為原料用醇類提取得浸膏再經(jīng)萃取得鬼臼毒素粗品和鬼臼毒素粗品高壓柱層析兩部分組成，具體步驟為將桃兒七根莖經(jīng)超微粉碎后，在超聲波條件下用醇類溶劑加熱50-60℃提取三次，合并三次提取液，合并提取液濃縮醇類溶劑，得到比重為1.0-1.2的紅褐色浸膏；再加入1-2倍浸膏體積量的水得到鬼臼毒素醇水相；鬼臼毒素醇水相用等體積的二氯甲烷萃取三次，合并三次的二氯甲烷相，濃縮得到純度為40％-50％的淡黃色鬼臼毒素粗品；淡黃色鬼臼毒素粗品用二氯甲烷溶解，上樣至硅膠為300-400目的高壓柱，用丙酮+二氯甲烷溶劑的混合洗脫液洗脫，收集產(chǎn)品段洗脫液，過濾濃縮后，烘干即得到純度大于99％的鬼臼毒素精品。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中將桃兒七根莖經(jīng)超微粉碎至粒徑10um 以下。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所用超聲波的功率為1000-10000W。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述二氯甲垸相用無水硫酸鈉干燥過 濾后濃縮干，6(TC干燥，得到純度為40%-50%的淡黃色鬼臼毒素粗品。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述醇類溶劑為甲醇或乙醇。
6. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述高壓柱的柱壓為2. 5 3. 5MPa。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述高壓柱內(nèi)徑為100-250mm,層析柱 層徑高比為l : 10-20。
8. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述洗脫液中丙酮與氯仿的體積比為i: 20。
9. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中洗脫液濃縮過濾后，采用60'C進(jìn)行鼓 風(fēng)千燥。
全文摘要
一種從桃兒七中制備高純度鬼臼毒素的方法，分為原料用醇類提取得浸膏再經(jīng)萃取得鬼臼毒素粗品和鬼臼毒素粗品高壓柱層析兩部分組成，具體步驟為將桃兒七根莖經(jīng)超微粉碎后，在超聲波條件下用醇類溶劑加熱提取三次，合并三次提取液，合并提取液濃縮醇類溶劑，得到比重為1.0-1.2的紅褐色浸膏；再加入1-2倍浸膏體積量的水得到鬼臼毒素醇水相；鬼臼毒素醇水相用等體積的二氯甲烷萃取三次，合并三次的二氯甲烷相，濃縮得到純度為40％-50％的淡黃色鬼臼毒素粗品；淡黃色鬼臼毒素粗品用溶解，上樣至硅膠為300-400目的高壓柱，用丙酮+二氯甲烷溶劑的混合洗脫液洗脫，收集產(chǎn)品段洗脫液，濃縮過濾后，烘干即得到純度大于99％的鬼臼毒素精品。
文檔編號A61P35/00GK101503410SQ20091004769
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日
發(fā)明者仝澤彬, 張偉中, 張愛平, 王權(quán)勇, 蔡志香, 卅 高 申請人:上海金和生物技術(shù)有限公司