用于擴增襀翅目昆蟲線粒體coi基因的特異性引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一對用于擴增櫝翅目昆蟲線粒體細胞色素 C氧化酶I (cytochrome c oxidase I ;C0I)基因的特異性引物。
【背景技術】
[0002] 櫝翅目（Plecoptera)又稱石蠅，該類昆蟲在除南極以外的世界各大陸上均有分 布，但主要分布于東洋區(qū)、古北區(qū)及新北區(qū)，尤以橫跨古北和東洋兩大動物地理區(qū)的我國種 類最為豐富。櫝翅目昆蟲較廣泛地分布在多種類型的水域中，是重要的水質(zhì)監(jiān)測指標生物， 加強該類群的分類研宄，可以更好地為水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測提供服務。
[0003] 從系統(tǒng)學和進化學的角度來看，櫝翅目是一個關鍵的類群。雖然櫝翅目系統(tǒng)發(fā)育 被廣泛研宄，但仍需要通過其他更多的特征來證明。而通過分子手段獲得的資料將更有助 于推斷櫝翅目各科間的親緣關系以及和其他目的親緣關系。我國有關櫝翅目原顎類昆蟲的 研宄僅限于傳統(tǒng)形態(tài)學，分子學研宄目前仍是空白。深入了解櫝翅目昆蟲的起源、進化和系 統(tǒng)發(fā)育關系，對重建櫝翅目系統(tǒng)發(fā)育乃至研宄昆蟲綱的進化關系都具有重要意義。這就需 要借助快速而準確的分子手段對櫝翅目昆蟲進行相關領域的研宄。
[0004] 近年來，利用分子技術對物種進行分類和系統(tǒng)發(fā)育分析已成為一種普遍而且有效 的方法，其中線粒體COI基因由于具有較高的進化速率已成為區(qū)分物種和研宄物種進化關 系的一種理想基因。因此，利用COI基因?qū)吵崮坷ハx進行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析是一 種較好的方法，目前，昆蟲遺傳研宄過程中，擴增昆蟲線粒體COI基因一般是采用已報道的 通用引物，但由于其通用性較強，特異性較弱，在實際研宄過程中，擴增昆蟲COI基因的同 時，也往往能擴增出昆蟲體表及體內(nèi)雜菌的COI基因片段且擴增片段長度較短。這將導致 某些昆蟲，如對櫝翅目昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育研宄的作用不理想，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條帶往 往為雙條帶甚至多條帶，測序峰圖多為雙峰。這給對櫝翅目昆蟲進行大規(guī)模的系統(tǒng)發(fā)育進 化研宄分析帶來了阻礙。目前國際上沒有專門針對擴增櫝翅目昆蟲COI基因的特異性引物 的相關報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種櫝翅目昆蟲線粒體COI基因擴增的特異性引物，它能滿足 現(xiàn)有技術的上述需求。
[0006] -對用于櫝翅目昆蟲線粒體COI基因序列擴增的引物，其序列如SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 2 所示。
[0007] 本發(fā)明還公開了一種櫝翅目昆蟲線粒體COI基因序列擴增方法，是采用上述的引 物，用50 μ I PCR體系在特定PCR擴增條件下進行目標片段擴增。
[0008] 所述的 50 μ I PCR體系是：5 μ I 10Xbuffer(+Mg2+)，2· 5 μ I dNTP(2. 5mM)，3 μ 1 引物 LeC0I-F(10yM)，3yl 引物 LeC0I-R(10yM)，0.5yl rTaq 酶（5μ/μ1)，2μ1 DNA 模 板（IOOng)，34 μ 1 雙蒸水。
[0009] 所述的PCR擴增條件是：94°C預變性5分鐘，94°C變性1分鐘15秒，51°C退火溫度 1分鐘15秒，72°C延伸1分鐘5秒，共35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
[0010] 本發(fā)明根據(jù)櫝翅目COI基因序列較保守和非特異性擴增引物擴增效率低的特性， 通過比對櫝翅目不同科物種的COI基因序列設計出擴增引物。采用本發(fā)明的櫝翅目線粒體 COI基因的擴增引物，可以有效地擴增出櫝翅目不同科物種的COI基因序列，填補了櫝翅目 COI基因沒有專門的擴增引物的空白，對櫝翅目不同科和屬的昆蟲進行大規(guī)模的COI測序， 準確鑒定某些形態(tài)上難于鑒別的近緣物種，為我國櫝翅目昆蟲的分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、種群 遺傳結(jié)構(gòu)和地理種群鑒別提供了重要工具。本發(fā)明涉及的擴增引物較過去通用引物有較大 的優(yōu)勢，具體表現(xiàn)為：本引物能有效擴增出近2000bp的COI基因片段，完全覆蓋COI基因全 長，而過去通用引物有效擴增長度一般為500-800bp，且擴增片段大多為保守區(qū)域，不利于 上述研宄的數(shù)據(jù)分析。利用本引物對櫝翅目昆蟲進行大規(guī)模的系統(tǒng)發(fā)育進化分析，能顯著 降低實驗成本，縮短實驗周期，提高實驗的準確性。
【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明引物對櫝翅目9科昆蟲COI基因的擴增效果圖。1為卷櫝；2為鈕 櫝；3為扣櫝；4為鉤櫝；5為襟櫝；6為新櫝；7為刺櫝；8為網(wǎng)櫝；9為綠櫝。
[0012] 圖2是通用引物對櫝翅目9科昆蟲COI基因擴增效果圖。1為卷櫝；2為鈕櫝；3 為扣櫝；4為鉤櫝；5為襟櫝；6為新櫝；7為刺櫝；8為網(wǎng)櫝；9為綠櫝。
【具體實施方式】
[0013] 本發(fā)明的櫝翅目COI基因的擴增引物篩選方法共分兩個步驟：1.以已經(jīng)測得的櫝 翅目昆蟲的線粒體基因組序列中COI基因的序列為基礎，通過比對找出COI基因兩端相對 保守的序列片段，不依賴已有的昆蟲通用引物，設計櫝翅目專用引物；2.將合成的引物對 櫝翅目昆蟲COI基因進行擴增，檢測其在櫝翅目中的通用性和擴增效率；3.在過程中曾設 計出多對引物，經(jīng)實驗結(jié)果驗證表明本發(fā)明的引物最優(yōu)
[0014] 下面結(jié)合實例對發(fā)明做進一步說明：
[0015] 1.樣品準備：樣品均使用存放于揚州大學應用昆蟲研宄所標本室內(nèi)存放于100% 酒精的櫝翅目不同科的昆蟲，包括綠櫝科、鉤櫝科、扁櫝科、叉櫝科等科的櫝翅目昆蟲。
[0016] 2. DNA提取：Axygen試劑盒提取DNA，具體步驟參照說明書。
[0017] 3.數(shù)據(jù)來源：數(shù)據(jù)來源于美國國立生物技術信息中心（NCBI, http:/www. ncbi. nlm. gov/) 〇
[0018] 4.序列比對：利用ClustalX軟件將櫝翅目昆蟲的線粒體基因組全序列中COI基 因兩端的序列進行比對，找出比較保守、堿基變異度最小的序列片段。
[0019] 5.弓丨物合成：根據(jù)上述的比對結(jié)果，利用引物設計軟件Primer Premier 5在堿基 變異度最小的序列片段設計出1對引物。引物序列為LeC0I-F:5' AAACTAATAGCCTTCAAAG 3'（SEQ ID NO. I) ;LeC0I-R:5'TATWTGGAGCTTAAATCCAT 3'（SEQ ID N0.2)。為了驗證本發(fā) 明引物的特異性，我們同時使用了過去mtDNA COI的通用引物作為對照。其具體序列為： forward :5' -CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3'（SEQ ID NO. 3) ;reword :5' -TCCATGCACTAATCT GCCATATTA-3'（SEQ ID N0.4)。
[0020] 6.引物擴增：將上述擴增引物分別應用于PCR擴增所采集的樣本。設置 TouchdownPCR熱循環(huán)退火溫度范圍為40-60 °C。
[0021] 7.擴增結(jié)果檢測：擴增引物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結(jié)果顯示，該引物 可以有效地擴增櫝翅目昆蟲的線粒體COI基因，擴增效率達100%。利用此對引物擴增出 的DNA片段長度約為2000bp，覆蓋櫝翅目昆蟲線粒體COI基因的全長（全長為1500bp左 右），且瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶較為單一（圖1)。相反，通用引物擴增出的DNA片段長度 約為1000 bp(圖2)，小于本發(fā)明引物的擴增長度，而且，瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶較差（圖 2)。很明顯，該通用引物不適合用于部分櫝翅目昆蟲COI基因的擴增，且結(jié)果不準確。而本 發(fā)明引物可以有效地擴增出櫝翅目不同科物種的COI基因序列，且測序結(jié)果較準確。
[0022] 8.引物擴增條件：上述引物 50μ1 PCR 體系為：5μ1 10Xbuffer(+Mg2+)，2.5yl (1階？(2.51111)，3 4 1引物1^0)1-卩(1(^]\〇,3 4 1引物1^0)1-1?(1(^]\〇,0.5 4 11^&9酶（5 4/ μ 1)，2 μ I DNA 模板（IOOng)，34 μ 1 雙蒸水。
【主權(quán)項】
1. 一對用于櫝翅目昆蟲線粒體COI基因序列擴增的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2 所示。2. -種櫝翅目昆蟲線粒體COI基因序列擴增方法，其特征是采用權(quán)利要求1所述的的 引物，用50 y I PCR體系在特定PCR擴增條件下進行目標片段擴增。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的50 y I PCR體系是：5 y 1含Mg2+的 10Xbuffer，2.5yl 2.5mM 的 dNTP，3yl IOyM 的上游引物，3yl IOyM 的下游引物， 〇? 5 y I 5 y / y 1 的 rTaq 酶，2 y I IOOng 的 DNA 模板，34 y 1 雙蒸水。4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的特定的PCR擴增條件是：94°C預變性5 分鐘，94°C變性1分鐘15秒，51°C退火溫度1分鐘15秒，72°C延伸1分鐘5秒，共35個循 環(huán)，最后72 °C延伸10分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于擴增襀翅目昆蟲線粒體細胞色素c氧化酶I(cytochrome c oxidase I，COI)基因序列的引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。采用本發(fā)明的擴增引物，可以有效地擴增出多種襀翅目物種的COI基因，有助于準確鑒定某些形態(tài)上難于鑒別的近緣物種，為我國襀翅目昆蟲的分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳結(jié)構(gòu)和地理種群鑒別提供了重要工具。
【IPC分類】C12N15/11, C12N15/53
【公開號】CN104946645
【申請?zhí)枴緾N201510443567
【發(fā)明人】杜予州, 陳志騰, 陸明星
【申請人】揚州大學
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月24日