一個(gè)影響綿羊繁殖性狀的nr5a2基因啟動(dòng)子區(qū)的分子標(biāo)記、檢測(cè)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一個(gè)影響綿羊繁殖性狀的NR5A2基因啟動(dòng)子區(qū) 的分子標(biāo)記、檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] NR5A基因家族由NR5A1和NR5A2等2個(gè)成員組成，在多能性、糖脂穩(wěn)態(tài)平衡和類固 醇生成等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。研宄發(fā)現(xiàn)NR5A家族基因敲除的小鼠類固醇生成紊亂，繁殖力 明顯下降，可見NR5A家族是動(dòng)物繁殖力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。NR5A2是NR5A家族中發(fā)現(xiàn)的第二 個(gè)成員，在哺乳動(dòng)物各種生命過程甚至是疾病發(fā)生中發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用，特別是與哺乳 動(dòng)物雌性生殖、卵泡發(fā)育、類固醇生成等關(guān)系密切。NR5A2于1993年在人類中首先被發(fā)現(xiàn)， 其在成年哺乳動(dòng)物各種組織中均有表達(dá)，主要在肝、腸和卵巢等組織中表達(dá)，特別是在卵巢 中高表達(dá)。在卵巢組織中，NR5A2選擇性地在顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞中表達(dá)，而在卵泡膜細(xì)胞 和間質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)。NR5A2基因在牛卵巢優(yōu)勢(shì)卵泡和排卵前卵泡顆粒細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平 極顯著高于小卵泡、黃體細(xì)胞，說明NR5A2在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育和優(yōu)勢(shì)化過程中發(fā)揮重要 的作用。趙永祥發(fā)現(xiàn)NR5A2基因在豬卵泡閉鎖過程中下調(diào)，敲減顆粒細(xì)胞中NR5A2基因后， 顆粒細(xì)胞凋亡率顯著增加，說明NR5A2可通過影響卵泡顆粒細(xì)胞凋亡來調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物卵泡 發(fā)育和卵泡閉鎖。NR5A2基因敲除純合型（NR5A2+)小鼠在胚胎期6. 5-7.5天死亡，雜合型 (NR5A2+/_)小鼠繁殖力明顯下降，而顆粒細(xì)胞NR5A2特異性敲除（NR5A2 ge+)雌性小鼠不育， 卵巢組織雖然存在有腔卵泡，但未見黃體，出現(xiàn)排卵障礙，說明NR5A2是哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育 和排卵必需的。卵巢黃體細(xì)胞特異性敲除NR5A2后引起卵巢功能不全，最終導(dǎo)致妊娠失敗， 而下丘腦弓狀核kisspetin神經(jīng)元特異性敲除（NR5A2 kiss+)小鼠可顯著降低產(chǎn)仔數(shù)。趙永 祥發(fā)現(xiàn)豬卵泡中NR5A2基因表達(dá)水平與卵泡液中E2含量呈極顯著正相關(guān)，而敲減顆粒細(xì)胞 中NR5A2基因后，E2合成通路中關(guān)鍵酶P450scc水平極顯著下調(diào)。Wu等證實(shí)NR5A2可通過 與CYP19A1基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)類固醇生成基因的表達(dá)，從而調(diào)控哺乳動(dòng)物卵泡顆粒細(xì) 胞中E2合成。顆粒細(xì)胞特異性敲除（NR5A2 geV〇小鼠卵巢組織中STAR等表達(dá)下降，P4含量 下降，影響黃體化。另外，在卵巢組織中，NR5A2還調(diào)控CYP11A1、STAR、HSD3B2、INHA、FDXl 等卵泡發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，而在垂體中NR5A2在前葉中表達(dá)，可調(diào)控GnRHR、LH β和FSH β 等卵泡發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)。
[0003] 湖羊是我國(guó)唯一的南方綿羊品種，在我國(guó)低繁殖力綿羊品種改良和新品系培育中 做出一定的貢獻(xiàn)。綿羊繁殖力性狀是一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，屬于數(shù)量性狀，傳統(tǒng)的表型選擇 準(zhǔn)確性低，且表型值需要在母羊成熟產(chǎn)羔后才能逐步表現(xiàn)出來，周期很長(zhǎng)，無法進(jìn)行超早期 選擇，遺傳進(jìn)展緩慢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種與湖羊繁殖性狀相關(guān)的分子位點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)所述的分子標(biāo)記的引物對(duì)。
[0006] 本發(fā)明的又一目的是提供一種篩選具有良好繁殖性狀的湖羊的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] -種與湖羊繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記包含NR5A2基因啟動(dòng)子區(qū)-700 位點(diǎn)，該位點(diǎn)具有T/G多態(tài)性；所述的NR5A2基因啟動(dòng)子區(qū)序列的Genbank登錄號(hào)為 NC_019469. I ;GG型和TG型綿羊個(gè)體的產(chǎn)仔數(shù)顯著多于TT型。
[0009] 所述的繁殖性狀包括頭胎產(chǎn)仔數(shù)、二胎產(chǎn)仔數(shù)、三胎產(chǎn)仔數(shù)和平均產(chǎn)仔數(shù)。
[0010] 一種用于檢測(cè)所述的分子標(biāo)記的引物對(duì)，上游引物Pl為：SEQ ID NO :2,下游引物 P2 為：SEQ ID NO :3。
[0011] 一種檢測(cè)所述的分子標(biāo)記的方法，包含利用所述的引物對(duì)PCR擴(kuò)增湖羊基因組 DNA，得到575bp擴(kuò)增產(chǎn)物，利用Hin6I限制性內(nèi)切酶對(duì)所述的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，電泳分 型，獲得575bp片段的定義為TT型，獲得575bp、293bp、282bp三個(gè)片段的定義為TG型，獲 得293bp、282bp兩個(gè)片段的定義為GG型。
[0012] 一種篩選具有良好繁殖性狀的湖羊品系的方法，包含以下步驟：
[0013] 1)提取綿羊基因組DNA ;
[0014] 2)利用兩條特異性引物PCR擴(kuò)增NR5A2基因啟動(dòng)子區(qū)序列，得到575bp擴(kuò)增產(chǎn)物； 所述的兩條特異性引物序列為Pl :SEQ ID NO. 1，P2 :SEQ ID NO. 2 ;
[0015] 3)利用Hin6I限制性內(nèi)切酶對(duì)所述的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，電泳分型，獲得575bp片 段的定義為TT型，獲得575bp、293bp、282bp三個(gè)片段的定義為TG型，獲得293bp、282bp兩 個(gè)片段的定義為GG型；
[0016] 4) GG型和TG型綿羊個(gè)體的產(chǎn)仔數(shù)顯著多于TT型，選擇GG型和TG型個(gè)體留種。
[0017] 本發(fā)明所述的分子標(biāo)記在篩選具有良好繁殖性狀的湖羊品系中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明所述的引物對(duì)在篩選具有良好繁殖性狀的湖羊品系中的應(yīng)用。
[0019] 有益效果：
[0020] 本發(fā)明采用PCR-RFLP方法檢測(cè)NR5A2基因啟動(dòng)子區(qū)Hin6I酶切位點(diǎn)的多態(tài)性，并 將基因型與湖羊的各胎產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)NR5A2基因啟動(dòng)子區(qū)-700T/G位點(diǎn)的多 態(tài)性與湖羊的二胎產(chǎn)仔數(shù)、三胎產(chǎn)仔數(shù)和平均產(chǎn)仔數(shù)均顯著相關(guān)，GG型和TG型湖羊的產(chǎn)仔 數(shù)顯著高于TT型。該多態(tài)位點(diǎn)可用于湖羊繁殖性狀的輔助選擇，提高選擇的準(zhǔn)確性，同時(shí) 可以在綿羊出生時(shí)就通過檢測(cè)基因型進(jìn)行選擇，加快育種進(jìn)程，降低育種成本。不僅對(duì)進(jìn)一 步提高湖羊繁殖力有重要的實(shí)際意義，而且對(duì)以湖羊?yàn)樗夭拈_展的新品種（系）培育具有 重要的實(shí)踐價(jià)值。
【附圖說明】
[0021] 圖1湖羊NR5A2基因啟動(dòng)子區(qū)-700T/G突變位點(diǎn)測(cè)序圖
[0022] 圖2湖羊NR5A2基因啟動(dòng)子區(qū)包含-700T/G位點(diǎn)的575bp片段的核苷酸序列
[0023] 如圖所示，方框標(biāo)記的堿基為T/G突變位置
[0024] 圖3湖羊NR5A2基因啟動(dòng)子區(qū)-700T/G Hin6I酶切電泳圖
[0025] 如圖所示：泳道M為DLlOOOmarker，TT、TG、GG分別表示湖羊NR5A2基因啟動(dòng)子區(qū) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Hin6I酶切后分為TT、TG、GG基因型。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下述實(shí)施例中提到的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明均為常規(guī)方法，內(nèi)切酶購(gòu)自大連寶 生物有限公司，其余試劑購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司。