專利名稱：釀酒酵母線粒體核酸級分用于免疫刺激的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及佐劑。具體而言，本發(fā)明涉及具有佐劑作用的釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)線粒體核酸級分用于制備藥物組合物的用途，其中所述的藥物組合物旨在使免疫應(yīng)答朝向抗特定抗原的Thl型應(yīng)答。
背景技術(shù)：
多年來，接種技術(shù)基本上一直是將抗原(例如蛋白質(zhì)、死病毒或減毒病毒)弓丨入動物以引起針對感染性生物的免疫應(yīng)答。自從80年代末，新接種技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，其為將包含編碼該抗原的核酸序列的載體導入動物中。例如，編碼狂犬病病毒糖蛋白的活痘苗病毒已經(jīng)成功地在西歐國家用于消除陸生動物狂犬病(CLIQUET等人，消除西歐國家陸生動物犬病(Elimination of terrestrial rabies in Western European countries). Developments in biologicals. 2004，第 119 卷，第 185-204 頁)。核酸免疫的主要優(yōu)點是細胞免疫(包括⑶4+和⑶8+T細胞)和體液免疫應(yīng)答均可以被誘導，這是因為編碼的抗原可以不僅經(jīng)過內(nèi)源途徑加工也經(jīng)由外源途徑被加工，肽表位通過I類主要組織相容性復合物(MHC)以及II類復合物呈遞(HAUPT，等人.針對腫瘤相關(guān)抗原的DNA疫苗接種用于抗月中瘤療法的潛力(The Potential of DNA Vaccination against Tumor-Associated Antigens for Antitumor Therapy). Experimental Biology and Medicine. 2002,第 227 卷，第 227-237 頁)。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應(yīng)答的高效產(chǎn)生已經(jīng)為通過核酸疫苗接種預防或治療癌癥鋪平了道路。許多腫瘤細胞表達叫做TAA(腫瘤相關(guān)抗原)的特異性抗原，但是免疫系統(tǒng)(因腫瘤周圍的因子而下調(diào))對這些抗原的識別不良。用編碼TAA的核酸疫苗接種患者， 導致TAA在免疫系統(tǒng)完全有效的環(huán)境中表達，引起特異性針對該腫瘤細胞的免疫應(yīng)答。然而，盡管疫苗接種繼續(xù)為迄今最成功的干預性健康策略，但傳染病和癌癥仍是世界范圍死亡的主要原因。接種不能產(chǎn)生有效免疫的一個主要原因是缺少能夠啟動所希望免疫應(yīng)答的合適佐劑。另外，大多數(shù)常規(guī)的佐劑是成分不太明確的復雜物質(zhì)，不能滿足新一代疫苗所期望的嚴格安全性和功效標準。通過激活先天免疫起作用的新一代佐劑為開發(fā)更安全、更有效的疫苗提供了令人激動的機會。Toll樣受體(TLR)家族似乎在先天免疫系統(tǒng)中扮演著檢測病原體表達的高度保守分子的關(guān)鍵角色。為了能夠快速檢測感染，目前已知在人類中表達的10種TLR之每一種明顯地已經(jīng)進化為當如下某些類型的病原體表達分子存在時受到刺激，所述的病原體表達分子在宿主細胞中不表達，或被隔絕在TLR不可獲得它們的細胞區(qū)室中。合適病原體分子對TLR的活化充當著啟動適宜免疫防御的"報警信號"。這些TLR激活物也已經(jīng)成功地單獨用來加強對抗病原體或腫瘤細胞的天然免疫應(yīng)答。例如，CpG寡脫氧核苷酸(ODNs)是 TLR9激動劑，其作為疫苗佐劑以及在治療癌癥、感染、哮喘和變態(tài)反應(yīng)方面顯示出有希望的結(jié)果。開發(fā)了它們中之一，CPG-7909，作為單一療法以及作為佐劑與化療法和免疫療法組合用于癌癥的治療。I期和II期試驗已經(jīng)在幾種造血系統(tǒng)腫瘤和實體腫瘤中檢查了這種藥物(MURAD，等人.癌癥療法中的CPG-7909(PF-;3512676，ProMune) :toll樣受體-9激動劑(CPG-7909(PF-3512676,ProMune) toll-like receptor-9 agonist in cancer therapy). Expert opinion on biological therapy. 2007,第 7 卷，第 8 其月，第 1257-1266 頁)。免疫應(yīng)答的性質(zhì)反映了由免疫刺激的抗原特異性淋巴細胞譜(profile)。淋巴細胞、尤其T細胞，由亞群組成，這些亞群可以被不同類型抗原刺激并執(zhí)行不同效應(yīng)子功能。 例如，在病毒感染中，病毒抗原在感染的細胞中合成并且在與I類MHC分子結(jié)合的情況下呈遞，從而導致對CD8+I類MHC限制性CTL的刺激。相反，胞外微生物抗原被APC內(nèi)吞、加工并且偏好地在與II類MHC分子結(jié)合的情況下呈遞。這活化⑶4+、II類MHC限制性輔助T細胞，導致抗體產(chǎn)生和巨噬細胞活化、但是相對無效的CTL形成。甚至在⑶4+輔助T細胞群體內(nèi)，也存在應(yīng)答抗原性刺激而產(chǎn)生不同細胞因子的亞類。在初始遭遇抗原后，幼稚CD4+T 細胞主要產(chǎn)生T細胞生長因子，白細胞介素2(IL-2)。抗原性刺激可以導致這些細胞的分化，有時候分化成叫做ThO的群體，其產(chǎn)生細胞因子，并且隨后分化成叫做Thl和Th2的亞類，它們具有相對限制的細胞因子產(chǎn)生和效應(yīng)子功能譜。Thl細胞分泌γ干擾素(IFN-γ)、 白細胞介素-2 (IL-幻，其活化巨噬細胞并且是對抗胞內(nèi)微生物的細胞介導的免疫以及遲發(fā)型超敏反應(yīng)的主要效應(yīng)子。受Thl細胞刺激的抗體同種型可以有效地激活補體和調(diào)理抗原用于吞噬。因此，Thl細胞觸發(fā)吞噬細胞介導的宿主防御。胞內(nèi)微生物感染往往誘導幼稚T 細胞分化成Thl亞類，這促進吞噬細胞對微生物的清除。另一方面，Th2細胞產(chǎn)生白細胞介素-4 (IL-4)(刺激IgE抗體產(chǎn)生)、白細胞介素-5 (IL-5)(為嗜酸性粒細胞-活化因子)、和白細胞介素-10 (IL-10)與白細胞介素-13(IL-13)(與白細胞介素-4(IL-4) 一起抑制細胞介導的免疫)。因此，Th2細胞主要負責由IgE和嗜酸性粒細胞介導的不依賴吞噬細胞的宿主防御，例如針對某些蠕蟲寄生物；以及由肥大細胞和嗜堿性粒細胞的IgE依賴性激活而導致的變應(yīng)性反應(yīng)(ABBAS A. K等人，Cellular and molecular Immunology,W. B. Saunders Co.) 0Winkler 等人(WINKLER, S.，Μ. ffillheim, K. Baier,等人· 1998.在惡性瘧原蟲 (Plasmodium falciparum)瘧疾中在寄生物血癥清除期間產(chǎn)生Thl和Th2細胞因子的T 細胞白勺才目Sli周節(jié)作用(Reciprocal regulation of Thl-and Th2-cytokine-producing T cells during clearance of parasitemia in Plasmodium falciparum malaria), Infect. Immun. 66 :6040-6044.)已經(jīng)在非并發(fā)惡性瘧原蟲瘧疾患者中顯示IFN-γ在人抗瘧疾宿主防御中作為關(guān)鍵分子的作用，并且他們不支持白細胞介素-4(IL-4)直接參與惡性瘧原蟲寄生物的清除。另外，已經(jīng)顯示，對于同一種給定抗原，佐劑可以在抗體應(yīng)答期間導致朝向優(yōu)勢同種型的偏移(T0ELLNER K. -M.等人.J. Exp. Med. 1998，187 :1193)。例如，已知鋁鹽如 Alhydrogel在小鼠中誘導基本上Th2型應(yīng)答并且促進IgGl形成或甚至IgE形成(ALLISON Α. C.在《Vaccine design-The role of cytokine networks》中，第 293 卷，l_9Plenum Press 1997)，這可能在帶有變應(yīng)性素因的受試者中帶來問題。就此方面而言，目前依然需要獲得能夠使免疫應(yīng)答朝向針對抗原的Thl型應(yīng)答的佐劑。發(fā)明公開本申請人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，特定的釀酒酵母線粒體核酸級分是TLR激活物并且能夠使免疫應(yīng)答朝向針對抗原的Thl型應(yīng)答。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“Thl型應(yīng)答〃指刺激γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)和/或白細胞介素-12(IL-12)產(chǎn)生的應(yīng)答。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，除非上下文另有清楚說明，否則"一(a)“和"一個(an)"以這樣的意思使用，從而它們意指"至少一個"、“至少第一"、“一個或多個" 或"復數(shù)個"所指的組分或步驟。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，無論在本文中何處使用，“和/或”包括“和”、“或” 和“由該術(shù)語連接的要素的所有或任何其他組合”的意思。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“包含”和“包括”意指產(chǎn)品、組合物和方法包括所指的組分或步驟，但不排除其他組分或步驟。當用來定義產(chǎn)品、組合物和方法時，“基本上
由......組成”應(yīng)意指排除具有任何實質(zhì)意義的其他組分或步驟。因此，基本上由所提及
組分組成的組合物不排除痕量雜質(zhì)和可藥用載體?！坝?.....組成”應(yīng)當意指排除除痕量
要素外的其他組分或步驟。本發(fā)明涉及釀酒酵母線粒體核酸級分和抗原用于制備意在使免疫應(yīng)答朝向針對所述抗原的Thl型應(yīng)答的藥物組合物的用途，特征在于所述的釀酒酵母線粒體核酸級分由包括以下步驟的方法制備a)在允許其生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)釀酒酵母，隨后離心所述培養(yǎng)物；b)破碎a)步驟中獲得的釀酒酵母沉淀；c)離心b)步驟中獲得的混合物；d)超速離心C)步驟中獲得的上清液；e)從d)步驟中獲得的沉淀提取核酸；f)從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分。釀酒酵母(S. c.)被充分地描述(Meyen ex Ε. C. Hansen, 1883)并且是市售的(例如 S. c. DSM No. 1333 ATCC 9763 ；S. c. DSM No. 70464 NCYC1414 ；S. c. DSM No. 2155 ATCC 7754 ；S. c. DSM No. 70869 ；S. c. DSM No. 70461 NCYC 1412 ；S. c. AH109 Clontech ；S. c. Y187 Clontech ；S. c. W303Biochem)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，所用的釀酒酵母是如實施例1中所述的釀酒酵母AH109 (Clontech)。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，所用的釀酒酵母是如實施例1中所述的釀酒酵母W303 (Biochem)。用于步驟a)中培養(yǎng)釀酒酵母的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(Guthrie， C.和Fink，G.R. (1991)酵母遺傳學與分子生物學指南(Guide to yeast genetics and molecular biology)-Methods in Enzymology(Academic Press,San Diego,CA) 194 :1-932 Heslot, H.和Gaillardin，C.，編著.(1992)酵母的分子生物學與基因工程(Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts), CRC Press, he.)。允許釀酒酵母生長的培養(yǎng)基被充分地描述(例如培養(yǎng)基1017YPG培養(yǎng)基DSMZ ；培養(yǎng)基186YM培養(yǎng)基DSMZ ；培養(yǎng)基393YPD培養(yǎng)基DSMZ)并且某些是市售的(例如YPD培養(yǎng)基Clontech)。允許釀酒酵母生長的培養(yǎng)基包含至少酵母提取物、胨和葡萄糖。所用的培養(yǎng)基可以補充有一種或多種營養(yǎng)素，例如氨基酸、維生素、鹽和/或其它。它們中一些是市售的(例如與補充有腺嘌呤的YPD 培養(yǎng)基相對應(yīng)的YPDA培養(yǎng)基Clontech)。培養(yǎng)條件例如營養(yǎng)素、溫度和持續(xù)時間是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(Guthrie, C.和Fink，G. R. (1991)酵母遺傳學與分子生物學指南(Guide to yeast genetics and molecular biology)-Methods in Enzymology(Academic Press, San Diego, CA) 194 :1-932 Heslot, H.和 Gaillardin，C.，編著.(1992)酵母的分子生物學與基因工禾呈(Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts), CRC Press, Inc.) 0在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用如實施例1中所述的方法和條件，其中釀酒酵母 AH109或W303在補充有腺嘌呤(100 μ g/ml)的包含酵母提取物(1% )、胨(1% )和葡萄糖 (2% )的培養(yǎng)基中在和30°C之間的溫度培養(yǎng)。步驟a)中離心前面所獲得的釀酒酵母培養(yǎng)物可以在加速度下以適于沉淀全部釀酒酵母的時間進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定哪個速度和哪個持續(xù)時間是最合適的。對于步驟a)中離心前面所獲的釀酒酵母培養(yǎng)物，優(yōu)選地如實施例1中所述在3500轉(zhuǎn)/分鐘的加速度下進行至少15分鐘。破碎a)步驟中所獲得的釀酒酵母沉淀的步驟b)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法、手段和任意系統(tǒng)或裝置實施(例如RIEDER SE, Emr SD，釀酒酵母的亞細胞分級分離方法才既覽(Overview of subcellular fractionation procedures for the yeast Saccharomyces cerevisiae), Curr Protoc Cell Biol. 2001 年 5 月；第 3 章第 3.7 單兀； RIEDER SE, Emr SD，從釀酒酵母分離亞細胞級分(Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae), Curr Protoc Cell Biol. 2001 年 5 月；第 3 章第 3. 8 單元；HARJU S, Fedosyuk H, Peterson KR.，快速分離酵母基因組 DNA (Rapid isolation of yeast genomic DNA) :Bust η ' Grab, BMC Biotechnol. 2004 1 H ；4 8.)，如使用研缽及研杵的手工破碎；使用渦旋器(例如桌面渦旋混合儀Top Mix 94323 Bioblock Scientifique)在優(yōu)選具有0. 1與5mm之間直徑并且更優(yōu)選0. 7mm直徑的玻璃珠存在下破碎；使用(例如從Labnet可商業(yè)獲得的)渦旋混合儀破碎；使用(例如從Kontes 可商業(yè)獲得的)Dounce勻漿器、使用(例如從Kontes可商業(yè)獲得的)Potter-Elvehjem 勻漿器或使用SLM Aminco弗氏細胞壓碎器，通過基于液體的勻漿法破碎；使用(例如從 Brinkmann Instruments可商業(yè)獲得的)Waring Blender Polytron進對于機械破碎；通過使用超聲波儀(例如從Biologies ；Misonix ；GlenMills可商業(yè)獲得)的超聲破碎法破碎；或通過凍融法破碎。破碎a)步驟中所獲的釀酒酵母沉淀的步驟b)優(yōu)選地在4°C溫度進行。 明顯地根據(jù)待處理的a)步驟中獲得的釀酒酵母沉淀物的初始量，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定哪一種前述破碎法是最合適的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還能夠確定步驟b)中的破碎條件，例如速度和持續(xù)時間。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，破碎a)步驟中所獲的釀酒酵母沉淀的步驟 b)通過在玻璃珠存在下使用渦旋器破碎而進行。玻璃珠優(yōu)選地具有0. 1與5mm之間直徑并且更優(yōu)選地0. 7mm直徑。優(yōu)選地按1至20個循環(huán)、更優(yōu)選5個循環(huán)，每個循環(huán)30秒至2 分鐘、更優(yōu)選每個循環(huán)1分鐘，進行破碎。在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，破碎a)步驟中所獲釀酒酵母沉淀的步驟b)通過在玻璃珠存在下使用渦旋器破碎而進行，其中玻璃珠具有 0. 7mm直徑，并且其中以5個循環(huán)且每個循環(huán)1分鐘持續(xù)時間，如實施例1中所述進行破碎。破碎a)步驟中所獲得釀酒酵母沉淀可以在蛋白酶存在下通過消化作用而進行。 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選使用的蛋白酶是來自酵母細胞壁的葡聚糖酶例如(內(nèi)切或外切)β-1， 3-葡聚糖酶或(內(nèi)切或外切)β-1，4-葡聚糖酶，包括但不限于酶解酶(zymolyase)和 oxalyticase。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地調(diào)節(jié)反應(yīng)條件、溶液pH、反應(yīng)的溫度及持續(xù)時間至最適于所選蛋白酶的活性的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定這些條件(RIEDER SE, Emr SD，酵母酉良酒的亞細胞分級方法_既覽(Overview of subcellular fractionation procedures for the yeast Saccharomyces cerevisiae), Curr Protoc Cell Biol. 2001 年 5 月；第 3 章第3. 7單元；RIEDER SE, Emr SD，從酵母釀酒分離亞細胞級分(Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae), Curr Protoc Cell Biol. 2001 年5月；第3章第3.8單元)。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，破碎a)步驟中所獲得釀酒酵母沉淀的步驟b)因而在一種或多種蛋白酶、優(yōu)選酶解酶或oxalyticase或其組合的存在下消化a)步驟中所獲得的釀酒酵母沉淀而進行。離心b)步驟中獲得的混合物的步驟C)在加速度下以適于沉淀膜碎片以及細胞核的持續(xù)時間進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定哪個速度和哪個持續(xù)時間是最合適的。離心b) 步驟中獲得的混合物的步驟c)優(yōu)選地如實施例1中所述在4000轉(zhuǎn)/分鐘的加速度下進行 10分鐘。離心b)步驟中獲得的混合物的步驟c)優(yōu)選地在4°C溫度進行。超速離心C)步驟中所獲得上清液的步驟d)在加速度下以適于沉淀線粒體的持續(xù)時間進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定哪個速度和哪個持續(xù)時間是最合適的。超速離心c) 步驟中所獲得上清液的步驟d)優(yōu)選地如實施例1中所述在39000轉(zhuǎn)/分鐘的加速度下進行90分鐘。超速離心c)步驟中所獲得上清液的步驟d)優(yōu)選地在4°C溫度進行。用于提取核酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。從包含d)步驟中所獲線粒體的沉淀物中提取核酸的步驟e)可以通過例如酚-二氯甲烷提取法或酚-氯仿提取法(例如CH0MCZYNSKI P.和Sacchi N. (1987)，“通過硫氰酸胍-酚-氯仿提取的單步驟 RNA 分離法(Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Th i ο cy anat e-Pheno 1 -Ch 1 or ο f orm Extraction) "Anal. Biochem. 162 :156-159)進對于。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用如實施例1中所述的方法和條件，其中從包含d)步驟中所獲線粒體的沉淀中提取核酸的步驟e)可以通過酚-二氯甲烷提取而進行。從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分的步驟f)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的醇沉淀法(例如HARJU S，F(xiàn)edosyuk H，Peterson KR.，快速分離酵母基因組DNA(Rapid isolation of yeast genomic DNA) :Bust n' Grab,BMC Biotechnol. ip 4 1 H ；4 :8.) 進行。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用如實施例1中所述的方法和條件，其中從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分的步驟f)可以通過醇沉淀以進行。在步驟f)中回收的核酸級分包含線粒體核糖核酸(RNA)。如實施例2中顯示(圖 1)，該釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分；NA-B2級分)是RNA酶敏感的。如實施例3中顯示(表幻，該釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分；NA-B2級分)的生物學特性在RNA 酶存在下消失。就此而言，包含于本發(fā)明釀酒酵母線粒體核酸級分中的核酸優(yōu)選地是RNA。本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分；NA-B2級分)能夠與人TLR結(jié)合。 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過使用本領(lǐng)域中可獲得的技術(shù)如實施例3中所述的那些技術(shù)，確定核酸與TLR結(jié)合的能力。在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，如實施例3中所述的，本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分能夠與人TLR3、TLR4和TLR7結(jié)合。本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分；NA-B2級分)旨在使免疫應(yīng)答朝向針對抗原的Thl型應(yīng)答。更具體地，本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分意圖誘導產(chǎn)生針對抗原的Y干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)和/或白細胞介素-12(IL-12)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過使用本領(lǐng)域中可獲得的技術(shù)如實施例4和實施例6中所述的那些技術(shù)，確定核酸誘導 干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)和白細胞介素-12(IL-12)產(chǎn)生的能力。在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分意在誘導產(chǎn)生-如實施例4和實施例6中所述并且分別在圖2和圖4中顯示的，Y干擾素 (IFNi)；-如實施例6中所述并且在圖5中顯示的，白細胞介素-12(IL-12)。如實施例6中所述并且在圖6中顯示，本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分不能夠誘導α干擾素(IFN-α)產(chǎn)生。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“抗原"指含有一個或多個能刺激宿主免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生抗原特異性體液和/或細胞應(yīng)答的表位的分子。該術(shù)語與術(shù)語“免疫原”可互換地使用?？贵w，如抗獨特型抗體，或其片段和可以模擬抗原或抗原決定簇的合成性肽模擬表位也落入本文中所用的抗原定義中。根據(jù)本發(fā)明，抗原優(yōu)選地選自由腫瘤相關(guān)抗原、傳染性生物特異性抗原和變應(yīng)原特異性抗原組成的組。根據(jù)本發(fā)明的第一實施方案，抗原是腫瘤相關(guān)抗原。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“腫瘤相關(guān)抗原”(TAA)指在腫瘤細胞中比在相同組織類型的非腫瘤細胞中以更高的頻率或密度被檢測到的分子。TAA的實例包括但不限于CEA、MART-U MAGE-U MAGE-3、 GP-100、MUC-I (見例如 W092/07000 ；ΕΡ554344 ；US5, 861，381 ；US6, 054，438 ；W098/04727 ； W098/37095)、MUC-2、點突變的ras癌基因、正?；螯c突變的p53、過量表達的p53、CA-125、 PSA、C-erb/B2、BRCA I、BRCA II、PSMA、酪氨酸酶、TRP-U TRP-2、NY-ESO-U TAG72、KSA, HER-2/neu、bcr-abl、pax3-fkhr、ews-fli-l、存活蛋白(survivin)、合胞素(syncytin)(例如合胞素-1，見例如 W099/02696 ；W02007/090967 ；US6, 312，921)、間皮素(mesothelin) 和LRP。這些分子的序列已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，抗原是TAA MUC-I0實施例5描述了本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分)和MUC-I抗原用于制備治療癌癥的藥物組合物的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，抗原是傳染性生物特異性抗原。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“傳染性生物特異性抗原”指病毒、細菌、真菌或寄生物的特異性抗原。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“病毒”包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒科、小RNA病毒科(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒；腸病毒，人柯薩奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯狀病毒科(例如引起胃腸炎的病毒株)；披膜病毒科(例如馬腦炎病毒、風疹病毒)；黃病毒科(例如登革病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；冠狀病毒科(例如冠狀病毒)；彈狀病毒科(例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；線狀病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞體病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亞病毒科(例如漢坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒和納伊羅病毒)；沙粒病毒科(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(例如呼腸孤病毒、環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙RNA病毒科；嗜肝DNA 病毒科(乙型肝炎病毒)；細小病毒科(細小病毒)；乳多空病毒科(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大部分腺病毒)；皰疹病毒科(單純皰疹病毒(HSV) 1和2、水痘-帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、皰疹病毒；痘病毒科(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲豬瘟病毒)。病毒抗原包括例如來自肝炎病毒A、B、C、D和E、HIV、皰疹病毒、巨細胞病毒、水痘帶狀皰疹病毒、乳頭瘤病毒、E-B病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、柯薩奇病毒、小RNA病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞體病毒、痘病毒、鼻病毒、風疹病毒、乳多空病毒、細小病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒的抗原。已知病毒抗原的一些非限制性實例包括 HIV-I 特異性抗原如 tat、nef、gpl20 或 gpl60、gp40、pM、gag、env、vif、vpr、vpu、rev 或其部分和/或組合；人皰疹病毒特異性抗原如gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE或gD或其部分和/或組合，或來自HSVl或HSV2的立即早期蛋白如ICP27、ICP47、ICP4、ICP36 ；巨細胞病毒、尤其人巨細胞病毒特異性抗原，如gB或其衍生物；E-B病毒特異性抗原如gp350或其衍生物；水痘帶狀皰疹病毒特異性抗原如gpl、ll、lll和IE63 ；肝炎病毒特異性抗原如乙型肝炎、丙型肝炎或戊型肝炎病毒抗原(例如HCV的env蛋白El或E2、核心蛋白、NS2、NS3、NS4a、NS4b、 NS5a、NS5b、p7或其部分和/或組合)；人乳頭瘤病毒特異性抗原(例如HPV6、11、16、18、 例如Li、L2、El、E2、E3、E4、E5、E6、E7或其部分和/或組合)；其他病毒病原體如呼吸道合胞體病毒(例如F和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、黃病毒(例如黃熱病病毒、登革病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒)或流感病毒感染細胞(例如HA、 NP、NA或M蛋白或其部分和/或組合)特異性抗原。本發(fā)明特別包括與p53的結(jié)合被改變或至少被顯著降低的任何HPV E6多肽的使用、和/或與Rb的結(jié)合被改變或至少被顯著降低的任何HPV E7多肽的使用(MUNGER等人.人乳頭瘤病毒E7蛋白與成視網(wǎng)膜細胞瘤腫瘤 Φfj5!jSia/fe^ WM^n ^ ) (Complex formation of human papillomavirus E7proteins with the retinoblastoma tumor suppressor gene product). The EMBO journal. 1989, 第8卷，第13期，第4099-4105頁；CR00K，等人.p53的降解可以通過與p53結(jié)合和反式激活所需要的那些HPV E6序列不同的HPV E6序列靶向.Cell. 1991，第67卷，第3期，第 547-556頁；HECK等人.結(jié)合成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白的效率與人乳頭瘤病毒E7癌蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化能力相關(guān)(E fficiency of binding the retinoblastoma protein correlates with the transforming capacity of the E7oncoproteins of the human papillomaviruses). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. . 1992，第 89 卷，第 10 期，第 4442-4446 頁；PHELPS，等人.人乳頭瘤病毒16型E7癌蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-功能分析Gtructure-function analysis of the human papillomavirus typel6E7oncoprotein). Journal of Virology. 1992,第66卷，第 4 期，第M18-2427頁)。適用于本發(fā)明目的非致癌性HPV-16E6變體缺失位于大約第118位置至大約第122位置(+1代表天然HPV-16E6多肽的第一個甲硫氨酸殘基)之間的一個或多個氨基酸殘基，特別優(yōu)選完全缺失第118至第122位殘基(CPEEK)。適用于本發(fā)明目的非致癌性HPV-16E7變體缺失位于大約第21位置至大約第沈位置(+1代表天然HPV-16E7多肽的第一個氨基酸殘基)之間的一個或多個氨基酸殘基，特別優(yōu)選完全缺失第21至第沈位殘基(DLYCYE)。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，進一步修飾用于本發(fā)明中的一種或多種HPV-16早期多肽，從而改善I類MHC和/或II類MHC呈遞作用和/或刺激抗HPV免疫。HPV E6和E7多肽是核蛋白并且先前已經(jīng)被證實膜呈遞可以改善它們的治療效力(見例如WO 99/03885)。 因而，可以有利的是，修飾至少一種HPV早期多肽，從而將其錨定至細胞膜上?？梢酝ㄟ^在 HPV早期多肽中并入膜錨定序列以及，如果該天然多肽缺少分泌序列的話，分泌序列(即， 信號肽)，容易地實現(xiàn)膜錨定作用。膜錨定序列和分泌序列是本領(lǐng)域已知的。簡而言之，分泌序列存在于膜呈遞或分泌型多肽的氨基端并且啟動它們進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。它們通常包含15至35個基本上疏水的氨基酸，所述氨基酸隨后由位于ER的特定內(nèi)肽酶去除以產(chǎn)生成熟的多肽。膜錨定序列通常是本質(zhì)上高度疏水的并且起到在細胞膜中錨定多肽的作用(見例如 Branden 等人，1991，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)導論(Introduction to Protein Structure), NY GARLAND, 1991.第202-214頁)?？梢栽诒景l(fā)明中使用的膜錨定序列和分泌序列是多種多樣的。它們可以從包含該序列的任何膜錨定或分泌性多肽(例如細胞多肽或病毒多肽)如狂犬病病毒糖蛋白、HIV病毒包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白獲得，或者可以是合成的。在根據(jù)本發(fā)明使用的各種早期HPV-16多肽中插入的膜錨定序列和/或分泌序列可以具有共同或不同來源。分泌序列的優(yōu)選插入位點是翻譯起始密碼子的氨基端下游，膜錨定序列的優(yōu)選插入位點是羧基端，例如終止密碼子的緊鄰上游。用于本發(fā)明中的HPV E6多肽優(yōu)選地通過插入麻疹病毒F蛋白的分泌信號和膜錨定信號進行修飾。用于本發(fā)明中的HPV E7多肽優(yōu)選地通過插入狂犬病病毒糖蛋白的分泌信號和膜錨定信號進行修飾。就此而言，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，抗原是人乳頭瘤病毒(HPV)特異性抗原，優(yōu)選地是HPV-16或/^PHPV-IS 特異性抗原，并且更優(yōu)選地是選自由HPV-16或/和HPV-18的E6早期編碼區(qū)、HPV-16或/ 和HPV-18的E7早期編碼區(qū)和其部分或組合組成的組中的抗原。實施例4描述了本發(fā)明釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分；NA-B2級分)和HPV16E7抗原用于制備使免疫應(yīng)答朝向針對HPV16E7抗原的Thl型應(yīng)答的藥物組合物的用途。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“細菌”包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括，但不限于巴氏桿菌屬O^asteurella)物種、葡萄球菌屬Staphylococci) 物種和鏈球菌屬(Mr印tococcus)物種。革蘭氏陰性細菌包括，但不限于大腸桿菌 (Escherichia coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種和沙門氏菌屬(Salmonella)物種。感染性細菌的具體實例包括但不限于幽門螺桿菌(Helicobacter pyloris)、伯氏疏螺方iH本(Borrelia burgdorferi)、嗜月市軍團菌(Legionella pneumophilia)、分枝桿菌屬物種(MyccAacteria sps)(例如結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌(M. avium)、胞內(nèi)分枝桿菌 (M. intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansaii)、戈登分枝桿菌(M. gordonae))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、單核細胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、 化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (Α組鏈球菌)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae) (B組鏈球菌)、鏈球菌(草綠色組)、糞鏈球菌(Sti^ptococcus faecalis)、 牛鏈球菌(Streptococcus bovis)、鏈球菌(厭氧物種)、肺炎鏈球菌、致病性彎曲桿菌屬(Campylobacter)物種、腸球菌屬(Enterococcus)物種、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽抱桿菌(Bacillus antracis)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)物禾中、紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、產(chǎn)氣英月莫梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、月市炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、多殺巴氏菌(Pasturella multocida)、擬桿菌屬(Bacteroides)物禾中、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠狀鏈桿菌(Streptobaci 1 Ius moniliformis)、蒼白密螺旋體(Tr印onema pallidium)、細弱密螺旋體(Ti^ponema pertenue)、鉤端螺旋體 (Leptospira)(Rickettsia)禾口 ^lfePj 方(Actinomyces israelii)。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“真菌”包括，但不限于新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、莢膜組織胞菜菌(Histoplasma capsulatum)、粗球抱子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙目艮衣原體(Chlamydia
12trachomatis)禾口白fi絲酵母(Candida albicans)。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“寄生物”包括但不限于以下屬瘧原蟲屬 (Plasmodium)(例如惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)、三日皰原蟲(Plasmodium malariae)、癥原蟲屬物種(Plasmodium spp.)、卵形癥原蟲(Plasmodium ovale)或間日瘧原蟲(Plasmodium vivax))、巴貝蟲屬(Babesia)(例如微小巴貝蟲(Babesia microti)、巴貝蟲屬物種(Babesia spp)或分歧巴貝蟲(Babesia divergens))、利什曼原蟲屬(Leishmania)(例如熱帶利什曼原蟲(Leishmania tropica)、利什曼原蟲某些禾中(Leishmania spp.)、巴西利什曼原蟲(Leishmania braziliensis)或杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、！i 蟲屬(Trypanosoma)(例如 _ 比亞 蟲(Trypanosoma gambiense)、錐蟲屬某些種(Trypanosoma spp.)、引起非洲睡眠病的羅德西亞錐蟲 (Trypanosoma rhodesiense)或弓丨起查格其jf病的克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)禾口弓形體屬(Toxoplasma)(例如鼠弓形體(Toxoplasma gondii))。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“變應(yīng)原”指可以在易感受試者中誘導變態(tài)或哮喘反應(yīng)的物質(zhì)。變應(yīng)原包括，但不限于花粉、昆蟲毒液、動物毛皮塵、真菌孢子和藥物(例如青霉素)。天然的動物和植物變應(yīng)原的實例包括，但不限于以下屬的特異性蛋白質(zhì) 犬屬(Canine)(家犬(Canis fami Iiaris))；塵螨屬(Dermatophagoides)(例如，塵螨 (Dermatophagoides farinae))；貓屬(Felis)(例如，家貓(Felis domesticus))；豚草屬(Ambrosia)(例如，豚草(Ambrosia artemiisfolia))；黑麥草屬(Lolium)(例如，宿根黑麥草(Lolium perenne)或多花黑麥草(Lolium multiflorum)；柳杉屬(Cryptomeria) (例如，日本柳杉(Cryptomeria japonica))；鏈格孢屬(Alternaria)(例如，鏈格孢 (Alternaria alternata))；赤楊屬(Alder)；棺木屬(Alnus)(例如，歐洲棺木(Alnus gultinoasa))；樺木屬(Betula)(例如，垂枝樺(Betula verrucosa))；櫟屬(Quercus) (例如，白櫟(Quercus alba))；木犀欖屬(Olea)(例如，油橄欖(Olea europa))；蒿屬(Artemisia)(例如，艾蒿(Artemisia vulgaris))；車前草屬(Plantago)(例如，長葉車前草(Plantago Ianceolata))；墻草屬(Parietaria)(例如，墻草(Parietaria officinalis)或歐蓍草(Parietaria judaica))；小蠊屬(Blattella)(例如，德國小蠊 (Blattella germanica)；蜜蜂屬(Apis)(例如，Apis multif lorum)；柏木屬(Cupressus) (例如，地中海柏木(Cupressus sempervirens)、綠干柏(Cupressus arizonica)禾口大果柏木(Cupressus macrocarpa))；刺柏屬(Juniperus)(例如，Juniperussabinoides、鉛筆柏(Juniperus virginiana)、普通柏(Juniperus communis)禾口阿希刺柏(Juniperus ashei))；側(cè)柏屬(Thuya)(例如，側(cè)柏(Thuya orientalis))；扁柏屬(Chamaecyparis) (例如，日本扁柏(Chamaecyparis obtusa))；大蠊屬(Periplaneta)(例如，美洲大蠊 (Periplaneta americana))；冰草屬(Agropyron)(例如，匍匍冰草(Agropyron repens))； 黑麥屬(Secale)(例如，黑麥(Secale cereale))；小麥屬(Triticum)(例如，普通小麥(Triticum aestivum))；甲鳥茅屬(Dactylis)(例如，甲鳥茅(Dactylis glomerata))； 羊茅屬(Festuca)(例如，牛尾草(Festuca elatior))；早熟禾屬(Poa)(例如，草地早熟禾(Poa pratensis)或加拿大早熟禾(Poa compressa))； 燕麥屬(Avena)(例如，燕麥(Avena sativa))；絨毛草屬(Holcus)(例如，絨毛草(Holcus Ianatus))；黃花茅屬 Anthoxanthum (例如，黃花茅(Anthoxanthum odoratum))；燕麥草屬(Arrhenatherum)(例如，燕麥草(Arrhenatherum elatius))；剪股穎屬(Agrostis)(例如，小糖草(Agrostis alba))；梯牧草屬(Phleum)(例如，梯牧草(Phleum pratense))；薦草屬(Phalaris) (例如，薦草(Phalaris arundinacea))；雀稗草屬(Paspalum)(例如，百喜草(I^aspalum notatum))；蜀黍?qū)?Sorghum)(例如,石茅高粱(Sorghum halepensis))；和雀麥屬(Bromus )(例如，無芒雀麥(Bromus inermis))。根據(jù)本發(fā)明，抗原優(yōu)選地選自由肽、核酸(例如DNA或RNA或其雜合體)、脂質(zhì)、脂肽和糖(例如寡糖或多糖)組成的組。抗原也可以是能夠特異地引導免疫應(yīng)答指向針對選自下述的抗原的Thl型應(yīng)答的任何化合物腫瘤相關(guān)抗原、傳染性生物特異性抗原或變應(yīng)原特異性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，抗原包含于載體中。根據(jù)本發(fā)明，該載體優(yōu)選地選自質(zhì)?；虿《据d體。就質(zhì)粒而言，可以提到例如從pBR322 (Gibco BRL)、pUC (Gibco BRL)、 pBluescript (Stratagene)、pREP4> pCEP4 (Invitrogene)或 pPoly (LATHE,等人.用于切除完整插入物的質(zhì)粒和噬菌體載體(Plasmid and bacteriophage vectors for excision of intact inserts). Gene. 1987，第57卷，第2-3期，第193-201頁)獲得的質(zhì)粒。通常而言，質(zhì)粒是技術(shù)人員已知的，并且盡管它們許多是市售的(例如，前面提到的質(zhì)粒)，但也可以使用遺傳操作技術(shù)修飾它們或構(gòu)建它們。優(yōu)選地，可以在本發(fā)明中使用的質(zhì)粒含有確保在生產(chǎn)細胞和/或宿主細胞中起始復制的復制起點(例如，可以選擇ColEl起點用于旨在于大腸桿菌中生產(chǎn)的質(zhì)粒，且如果希望質(zhì)粒在哺乳動物宿主細胞中自我復制，則可以選擇oriP/ EBNAl系統(tǒng)，LUPT0N，等人.標定促進Epstein-Barr病毒衍生性質(zhì)粒在人細胞中染色體外維持的Epstein—Barr病毒遺傳兀件(Mapping genetic elements of Epstein-Barr virus that facilitate extrachromosomal persistence of Epstein-Barr virus-derived Plasmids in human cells). Molecular and cellular biology. 1985,第 5 卷，第 10 期， 第2533-42頁.；YATES，等人.從Epstein-Barr病毒衍生的質(zhì)粒在多種哺乳動物細胞中的穩(wěn)定復制· Nature. 1985，第313卷，第6005期，第812-815頁)。質(zhì)?？梢灶~外地包含能夠選擇或鑒定轉(zhuǎn)染細胞的選擇基因(彌補營養(yǎng)缺陷型突變、編碼抗生素耐藥性的基因等)。 自然地，質(zhì)?？梢院懈纳破湓诮o定細胞中的維持和/或其穩(wěn)定性的額外元件(促進質(zhì)粒以單體形式維持的cer序列(SUMMERS等人.高拷貝數(shù)質(zhì)粒的多聚化造成不穩(wěn)定=ColEl 編碼對質(zhì)粒單體化和和穩(wěn)定性必需的決定因子(Multimerization of high copy number plasmids causes instability :ColE lencodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability). Cell. 1984，第 36 卷，第 4 期，第 1097-1103 頁)，用于整合至細胞基因組內(nèi)的序列)。就病毒載體而言，可以提及例如從痘病毒、從腺病毒、從逆轉(zhuǎn)錄病毒、從皰疹病毒、 從甲病毒、從泡沫病毒或從腺相關(guān)病毒獲得的病毒載體。可以使用有復制能力的或復制缺陷的病毒載體?！坝袕椭颇芰Φ牟《据d體”指在任何反式互補作用不存在的情況下能夠在宿主細胞中復制的病毒載體。“復制缺陷型病毒載體”指在沒有某種形式的反式互補的情況下不能夠在宿主細胞中復制的病毒載體。另外，優(yōu)選使用不整合的載體。就這個方面而言，腺病毒載體和從痘病毒獲得的載體特別適于實施本發(fā)明。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，病毒載體從痘病毒、優(yōu)選地從痘苗病毒并且更優(yōu)選地從改良安卡拉痘苗病毒(MVA)或其衍生物獲得?！把苌铩敝高@樣的病毒，其顯示與保藏株具有基本上相同的復制特征，但是在其基因組的一個或多個部分中顯示差異。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“痘苗病毒”(VV)包括但不限于VV株Dairen I、IHD-J, L-IPV、LC16M8、LC16M0、Lister、LIVP, Tashkent、WR 65-16、ffyeth, Ankara、 Copenhagen、Tian Tan、Western Reserve (WR)及其衍生物，例如包含缺陷型F2L基因的 VV(見 W02009/065M7)和包含缺陷型 I4L 和 / 或 F4L 基因的 VV(見 W02009/065M6)。VV 含有一個大的雙鏈體DNA基因組(187千堿基對)，是在感染細胞的細胞質(zhì)中復制的唯一已知DNA病毒家族的成員。VV在歐洲專利EP83286中充分描述。VV哥本哈根株的基因組已經(jīng)作圖并測序(Goebel 等人·，1990，Virol. 179,247-266 和 517-563 Johnson 等人·，1993， Virol. 196,381-401)。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“改良安卡拉痘苗病毒(MVA) ”指通過VV安卡拉株 (CVA)在CEF上連續(xù)傳516代產(chǎn)生的高度減毒的VV病毒(Mayr, A.，等人。Infection 3， 6-14,1975)及其衍生物。MVA病毒以保藏號N602I-721在法國國家培養(yǎng)物與微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM))保藏。MVA載體禾口產(chǎn)生此類載體的方法在歐洲專利EP 83^6A和EP 206920A、在國際申請W007/147528中以及在SUTTER，等人.非復制型疫苗載體高效表達重組基因(Nonr印Iieating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes) · Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. · 1992,第 89 卷，第22期，第10847-10851頁中充分描述。MVA的基因組已經(jīng)作圖并測序(Antoine等人.，1998，Virol. 244，365-396)。根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，抗原可以在MVA載體的缺失區(qū) I、II、III、IV、V和VI中并且甚至更優(yōu)選在缺失區(qū)III中插入(MEYER等人.標定高度減毒的痘苗病毒MVA的基因組中的缺失區(qū)和它們對毒力的影響(Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence). The Journal of general virology. 1991，第 72 卷，第 Pt5 其月，第 1031—1038 頁；SUTTER等人.從宿主范圍受限和高度減毒的痘苗病毒MVA株中衍生的重組載體在小
(A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus) · Vaccine. 1994,第 12 卷，第 11 期， 第1032-1040頁)。實施例5描述了本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分)和 MUC-I抗原用于制備治療癌癥的藥物組合物的用途，其中MUC-I抗原包含于MVA載體中。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，病毒載體從腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、甲病毒或泡沫病毒或其衍生物獲得。根據(jù)本發(fā)明使用的腺病毒載體優(yōu)選地是這樣的腺病毒載體，其缺少對復制必需的、選自E1、E2、E4和L1-L5區(qū)的至少一個區(qū)域的全部或部分以避免該載體在宿主生物或環(huán)境中增殖。優(yōu)選缺失El區(qū)。然而，它可以與(一或多種)其他修飾_/缺失組合，其中所述的其他修飾_/缺失影響尤其是E2、E4和/或L1-L5區(qū)的全部或部分，從而使得借助互補性細胞系和/或輔助病毒可以反式地彌補這些缺陷型必需功能。在這個方面，可以使用本領(lǐng)域的第二代載體(見，例如國際申請?zhí)?4/28152和WO 97/04119)。舉例來說，缺失E4轉(zhuǎn)錄單位和El區(qū)的主要部分是特別有利的。出于增加克隆容量的目的，腺病毒載體可以額外地缺失非必需E3區(qū)的全部或部分。根據(jù)另一個備選方案，可以利用最小腺病毒載體，所述的最小腺病毒載體保留對衣殼化所必需的序列，即5'和3' ITR(倒置末端重復序列)和衣殼化區(qū)域。多種腺病毒載體和用于制備這些載體的技術(shù)是已知的(見，例如GRAHAM，等人 Methods in molecular biology. MURREY 編著· The human press inc,第 109-128 頁)。 從物種來看和從血清型來看，本發(fā)明腺病毒載體的來源可以是多種多樣的。該載體可以從人或動物(犬、禽、牛、小鼠、綿羊、豬、猴等)來源的腺病毒的基因組獲得，或從包含至少兩種不同來源的腺病毒基因組片段的雜合體獲得?？梢愿绕涮峒暗氖?，犬源CAV-I或CAV-2 腺病毒、禽源DAV腺病毒或牛源Bad 3型腺病毒(ZAKHARCHUK等人.減蛋綜合征(EDS-76) 腺病毒DNA的物理作圖和同源性研究(Physical mapping and homology studies of egg drop syndrome (EDS-76) adenovirus DNA). Archives of virology. 1993,第 128卷，第 1-2 期，第171-6頁；SPIBEY等人.兩個犬腺病毒2型毒株的分子克隆和限制性核酸內(nèi)切酶作圖(Molecular cloning and restriction endonuclease mapping of two strains of canine adenovirus type 2). The Journal of general virology. 1989，第 70 卷，第 Pt 1期，第165-72頁J0UVENNE等人.犬腺病毒1和2型基因組的克隆、物理作圖和交叉雜交(Cloning, physical mapping and cross-hybridization of the canine adenovirus types land 2genomes). Gene. 1987，第 60 卷，第 1 期，第 21-8 頁；MITTAL 等人.開發(fā)基于牛腺病毒3 型白勺表達載體(Development of a bovine adenovirus type 3-based expression vector). The Journal of general virology. 1995，第 76 卷，第 Pt 1 其月，第 93—102 頁)。 然而，優(yōu)選人源腺病毒載體，該載體優(yōu)選從C血清型腺病毒、尤其2或5型C血清型腺病毒獲得。根據(jù)本發(fā)明也可以使用有復制能力的腺病毒載體。這些有復制能力的腺病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在這些載體當中，特別優(yōu)選在編碼55kD P53抑制物的Elb區(qū)中缺失的腺病毒載體，如在0NYX-015病毒中(BISCH0FF等人.在p53缺陷型人腫瘤細胞中個生MfU白勺(An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells). Science. 1996,第 274 卷，第 5286 其月，第 373-376 頁； HEISE等人.展示強力和選擇性全身抗腫瘤效力的腺病毒ElA突變體(An adenovirus ElA mutant that demonstrates potent and selective systemic anti-tumoral efficacy). Nature Medicine. 2000，第 6 卷，第 10 期，第 1134-1139 頁；W094/18992)。因此，這種病毒可以用來選擇性感染和殺死P53缺陷型贅生細胞。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可以根據(jù)已建立的技術(shù)，突變并破壞腺病毒5或其他病毒中的p53抑制物基因。也可以在本發(fā)明中使用ElA Rb結(jié)合區(qū)內(nèi)缺失的腺病毒載體。例如，△ M病毒是ElA區(qū)中攜帶M個堿基對缺失的突變體腺病毒(FUEY0，等人.靶向Rb途徑的突變?nèi)芰鱿俨《驹隗w內(nèi)產(chǎn)生抗膠質(zhì)瘤作用(A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo) · Oncogene. 2000，第19卷，第1期，第2-12頁)。Δ M在Rb結(jié)合區(qū)中具有缺失并且不與Rb結(jié)合。因此，該突變體病毒的復制在正常細胞中被Rb抑制。然而，如果Rb失活并且細胞變成致瘤性，則△ M不再被抑制。取而代之，突變體病毒高效地復制并且裂解Rb缺陷型性細胞。本發(fā)明的腺病毒載體可以通過連接或同源性重組(見，例如國際申請?zhí)?6/17070) 或通過在互補性細胞系中重組，而在大腸桿菌(E.coli)中體外產(chǎn)生。
逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染并且在大多數(shù)情況下整合到正在分裂的細胞中的屬性，并且在這個方面是特別適合對癌癥使用的。本發(fā)明的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒通常含有LTR序列、衣殼化區(qū)、和處于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR或內(nèi)部啟動子(如下文所述那些啟動子)控制下的本發(fā)明核苷酸序列。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒可以從任何來源(小鼠、靈長類、貓、人等)的逆轉(zhuǎn)錄病毒并且尤其從MoMuLV (Moloney小鼠白血病病毒)、MVS (小鼠肉瘤病毒)或Friend小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒 (Fb29)獲得。它在能夠反式地供應(yīng)在病毒粒子構(gòu)成時所必需的病毒多肽gag、pol和/或 env的衣殼化細胞系中增殖。此類細胞系在文獻中描述(PA317，Psi CRIP GP+Am_12等)。 本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以含有修飾，尤其在LTR(將啟動子區(qū)替換為真核啟動子)或衣殼化區(qū)域(替換為異源衣殼化區(qū)，例如VL30型)中，如US 5747323中所述。
根據(jù)本發(fā)明，載體還包含在抗原是核酸時對于抗原表達所必需的元件。對表達必需的元件可以為能夠使核酸序列轉(zhuǎn)錄成RNA并且使mRNA翻譯成多肽的全部元件。這些元件尤其包括可以是調(diào)節(jié)型或組成型的啟動子。自然，啟動子對所選擇的載體和宿主細胞是合適的?？梢蕴岬降膶嵗荘GK(磷酸甘油酸激酶)基因、MT基因(金屬硫蛋白； MCIV0R.人嘌呤核苷磷酸化酶和腺苷脫氨酶通過使用重組雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移基因至培養(yǎng)細胞禾口小鼠造血干細胞中(Human purine nucleoside phosphorylase and adenosine deaminase :gene transfer into cultured cells and murine hematopoietic stem cells by using recombinant amphotropic retroviruses). Molecular and cellular biology. 1987，第7卷，第2期，第838-46頁)、α -1抗胰蛋白酶基因、CFTR基因、表面活性蛋白基因、免疫球蛋白基因、肌動蛋白基因(ΤΑΒΙΝ等人.將逆轉(zhuǎn)錄病毒修改為傳遞單純皰疫病毒胸苷激酶基因的真核載體(Adaptation of a retrovirus as a eucaryotic vector transmitting the herpes simplex virus thymidine kinase gene). Molecular and cellular biology. 1982，第 2 卷，第 4 期，第似6-36 頁)和 SR α 基因(ΤΑΚΕΒΕ 等人· SR α啟動子一種由猴病毒40早期啟動子和人T細胞白血病病毒1型長末端重復序列的R-U5 節(jié)段組成的高效和通用型哺乳動物cDNA表達系統(tǒng)(SR alpha promoter an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40early promoter and the R-U5segment of human T—cell leukemia virus type llong terminal repeat). Molecular and cellular biology. 1988，第 8 卷，第 1 期，第 466-472 頁)的真核啟動子、SV40病毒(猴病毒)的早期啟動子、RSV(勞氏肉瘤病毒)的LTR、HSV-I TK啟動子、CMV病毒(巨細胞病毒)早期啟動子、痘苗病毒p7. ^(、pH5R、pKlL、p^*pll啟動子、和 ElA和MLP腺病毒啟動子。啟動子也可以是在腫瘤或癌細胞中刺激表達的啟動子?？梢跃唧w提到以下基因的啟動子在乳腺癌和前列腺癌中過量表達的MUC-I基因(CHEN，等人.由含有DF3/MUC1啟動子的重組腺病毒介導的乳腺癌選擇性基因表達和療法(Breast cancer selective gene expression and therapy mediated by recombinant adenoviruses containing the DF3/MUC lpromoter). The Journal of clinical investigation. 1995, 第96卷，第6期，第2775-82頁)、在結(jié)腸癌中過量表達的CEA (癌胚抗原)基因(SCHREWE， 等人.克隆癌胚抗原的完整基因其啟動子分析顯示一個賦予細胞類型特異性表達的區(qū)域(Cloning of the complete gene for carcinoembryonic antigen analysis of its promoter indicates a region conveying cell type-specific expression). Molecular and cellular biology. 1990，第10卷，第6期，第2738-48頁)、在黑素瘤中過量表達的酪氨酸酶基因(VILE，等人.通過直接腫瘤內(nèi)注射DNA而利用單純皰疹病毒胸苷激酶基因的組織特異性表達抑制建立的小鼠黑素瘤的生長(Use of tissue-specific expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene to inhibit growth of establishedmurine melanomas following direct intratumoral inj ection of DNA). Cancer res. 1993，第53卷，第17期，第3860-4頁)、在乳腺癌和胰腺癌中過量表達的ERBB-2基因 (HARRIS，等人.使用腫瘤特異性前藥激活作用的癌癥基因療法(Gene therapy for cancer using tumour-specific prodrug activation). Gene therapy. 1994，第 1 卷，第 3 期，第 170-5頁)、和/或在肝癌中過量表達的甲胎蛋白基因(KANAI，等人.通過腺病毒介導的胞苷脫氨酶基因轉(zhuǎn)移而體內(nèi)基因治療產(chǎn)生甲胎蛋白的肝細胞癌(In vivo gene therapy for alpha-fetoprotein-producing hepatocellular carcinoma by adenovirus-mediated transfer of cytosine deaminase gene). Cancer res，1997，第 57 卷，第 3 期，第 461-5 頁)。巨細胞病毒(CMV)早期啟動子是極特別優(yōu)選的。然而，當使用從痘苗病毒衍生的載體(例如MVA載體)時，特別優(yōu)選胸苷激酶7. 基因的啟動子。必需元件可以進一步包括改善本發(fā)明核苷酸序列在宿主細胞中的表達或其維持的額外元件。具體可以提到內(nèi)含子序列、分泌信號序列、核定位序列、用于再啟動IRES型易位的內(nèi)部位點、轉(zhuǎn)錄終止polyA序列、 三聯(lián)前導序列和復制起點。這些元件是技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的藥物組合物(并且更尤其地是佐劑組合物和疫苗組合物)還可以包含一種或多種改善釀酒酵母線粒體核酸級分和/或抗原的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì)。述物質(zhì)優(yōu)選地選自由脂質(zhì)、脂質(zhì)體、亞微水包油乳液、微粒子、ISCOM和聚合物組成的組。組合物的多種組分可以在寬比率范圍內(nèi)存在。例如，本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分和改善釀酒酵母線粒體核酸級分和/或抗原的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì)可以按約1 200至 200 1、優(yōu)選1 100至100 1、更優(yōu)選約1 50至50 1、甚至更優(yōu)選約1 10至 10 1、甚至更優(yōu)選約1 3至3 1并且最優(yōu)選約1 1比率(體積/體積(ν/ν)和/ 或重量/重量(w/w))使用。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“脂質(zhì)”包括中性、兩性、陰離子和/或陽離子脂質(zhì)。脂質(zhì)包括，但不限于磷脂(例如天然或合成性磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰絲氨酸)、甘油酯(例如二酰甘油或三酰甘油)、膽固醇、神經(jīng)酰胺類或腦苷脂類。優(yōu)選的脂質(zhì)是陽離子脂質(zhì)。多種陽離子脂質(zhì)是本領(lǐng)域已知的，并且其中一些是市售的(例如 BALASUBRAMANIAM 等人.(1996) Gene Ther.，3 :163-172 ；GAO 和 HUANG (1995) Gene Ther.，2 7110-7122 ；US 4，897，355專利；EP 90146 專利和更優(yōu)選pcTG90)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，脂質(zhì)是陽離子脂質(zhì)并且更優(yōu)選地是如EP 90146 專利中所述的陽離子脂質(zhì)并且甚至更優(yōu)選地如EP 901463B專利中所述pcTG90。本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分和脂質(zhì)可以按約1 200至200 1、優(yōu)選1 100至100 1、更優(yōu)選約1 50至50 1、甚至更優(yōu)選約1 10至10 1、甚至更優(yōu)選約1 3至3 1并且最優(yōu)選約1 1比率(體積/體積(v/V)和/或重量/重量(w/V))使用。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“脂質(zhì)體"指由雙層包圍的囊泡，其中所述的雙層由如下組分形成，所述組分通常包括脂質(zhì)，任選地與非脂質(zhì)組分(例如硬脂胺 (Stearylamine))組合。用來形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)體形成組分可以包括中性、兩性、陰離子和/或陽離子脂質(zhì)。優(yōu)選的脂質(zhì)體是陽離子脂質(zhì)體。陽離子脂質(zhì)體廣泛記錄在技術(shù)人員可獲得的文獻中并且其中一些是市售的(例如，F(xiàn)ELGNER，等人.陽離子脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染(Cationic liposome mediated transfection). Proceedings of the Western Pharmacology Society. 1989，第 32 期，第 115-2 頁；HODGSON，等人.病毒體陽離子月旨質(zhì)體增強逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(Virosomes :cationic liposomes enhance retroviral transduction). Nature biotechnology. 1996，第 14 卷，第 3 期，第 339-42 頁；REMY，等人·采用一系列親脂性DNA結(jié)合分子的基因轉(zhuǎn)移(Gene transfer with a series of lipophilic DNA-binding molecules). Bioconjugate chemistry. 1994,第 5 卷，第 6 期， 第647- 頁)。陽離子脂質(zhì)體(如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用)包括，但不限于二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(D0TMA)、1， 2-雙(油酰氧)-3-(三甲基銨基)丙烷(DOTAP)、1，2-雙(十六烷基氧)_3_三甲基氨基丙烷(BisHOP)、3[i3][N-(N' N' -二甲基氨基乙烷)_氨甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)或脂質(zhì)體兩性霉素_8(其在商標入1111^8011^@下從611盼(1 kiences可商業(yè)地獲得)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，脂質(zhì)體是陽離子脂質(zhì)體，更優(yōu)選地選自二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、 N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)和脂質(zhì)體兩性霉素-B或其組合。本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分和脂質(zhì)體可以按約1 200至200 1、優(yōu)選 1 100至100 1、更優(yōu)選約1 50至50 1、甚至更優(yōu)選約1 10至10 1、甚至更優(yōu)選約1 3至3 1并且最優(yōu)選約1 1比率(體積/體積(ν/ν)和/或重量/重量(w/ w))使用。脂質(zhì)體兩性霉素-B是在商標AmMsome (Gilead Sciences)下可商業(yè)獲得的。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，優(yōu)選地如實施例2中所述按約1 3至1 l(v/v); ι 100 (w/w)的比率，使用釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA-B2級分)和Ambkome 。本發(fā)明的優(yōu)選陽離子脂質(zhì)體組合是二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(D0TMA)。比率1 1 (w/w)的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)是在商標 Lipofectin anvitrogen，目錄號18292-011或目錄號1擬92_037)下可商業(yè)獲得的。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，優(yōu)選地如實施例1 (NA級分)和實施例2 (NA-B2級分)中所述， 釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分；NA-B2級分)和Lipofectin 為ι ι (ν/ν和/或 w/w)的比率。本發(fā)明的另一個優(yōu)選組合是二油酰磷脂酰乙醇胺(D0PE)、N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)和脂質(zhì)體兩性霉素-B。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分、Lipofectin 和脂質(zhì)體兩性霉素-B之間的哪個比率是最合適的。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“亞微水包油乳液”(submicron oil-in-water emulsion)包含無毒可代謝油和商業(yè)乳化劑。無毒可代謝油包括，但不限于植物油、魚油、 動物油或合成制備的油。商業(yè)乳化劑包括，但不限于基于失水山梨糖醇的非離子表面活性劑(例如失水山梨糖醇三油酸酯或聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)或衍生自例如月桂基、乙酰基、硬脂基和油基醇的聚氧乙烯脂肪酸醚。亞微水包油乳液廣泛記錄在技術(shù)人員可獲得的文獻中(例如WO 90/14837 ；TAMILVANAN S.，水包油脂質(zhì)乳液對于腸胃外和眼部: 系 充白勺意義(Oil-in-water lipid emulsions amplications for parenteral and ocular delivering systems), Prog Lipid Res. 2004年 11 月；43 (6) :489-533)。本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分和亞微水包油乳液可以按約1 200至200 1、優(yōu)選1 100至 100 1、更優(yōu)選約1 50至50 1、甚至更優(yōu)選約1 10至10 1、甚至更優(yōu)選約1 3 至3 1并且最優(yōu)選約1 1比率(體積/體積(ν/ν)和/或重量/重量(w/w))使用。
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如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“微粒子”(microparticle)指從可消毒的無毒且生物可降解材料(如，但不限于聚(α-羥酸)(例如聚丙交酯或聚(D，L-丙交酯共乙交酯)))、聚羥基丁酸、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐、聚乙烯醇和乙烯-乙酸乙烯酯)形成的直徑約IOOnm至約150 μ m的粒子。微粒子廣泛記錄在技術(shù)人員可獲得的文獻中(例如RAVI KUMAR Μ. N. V.，作為受控grud送遞裝置的納米粒子和微粒子(Nano and microparticles as controlled grud delivery devices), J. Pharm. Pharmaceut. Sci 3(2) :234-258,2000 ； WO 07/084418)。本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分和微粒子可以按約1 200至200 1、 優(yōu)選1 100至100 1、更優(yōu)選約1 50至50 1、甚至更優(yōu)選約1 10至10 1、甚至更優(yōu)選約1 3至3 1并且最優(yōu)選約1 1比率(體積/體積(ν/ν)和/或重量/重量(w/w))使用。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“ISC0M”指糖苷類物質(zhì)如三萜皂甙(尤其QuilA) 與含有疏水區(qū)的抗原之間所形成的免疫原性復合物。ISCOM廣泛記錄在技術(shù)人員可獲得的文獻中(例如BARR I.J.和GRAHAM F. Μ.，“ISC0M(免疫刺激復合物)前十年回顧 (ISCOMs (immunostimulating complexes) :The first decade") Immunology and Cell Biology (1996) 74，8-25 ；WO 9206710)。本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分和ISCOM可以按約1 200至200 1、優(yōu)選1 100至100 1、更優(yōu)選約1 50至50 1、甚至更優(yōu)選約1 10至10 1、甚至更優(yōu)選約1 3至3 1并且最優(yōu)選約1 1比率(體積/體積 (ν/ν)和/或重量/重量(w/w))使用。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“聚合物”包括，但不限于多聚賴氨酸、多聚精氨酸、多聚鳥氨酸、精胺和亞精胺。本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分和聚合物可以按約 1 200至200 1、優(yōu)選1 100至100 1、更優(yōu)選約1 50至50 1、甚至更優(yōu)選約 1 10至10 1、甚至更優(yōu)選約1 3至3 1并且最優(yōu)選約1 1比率(體積/體積 (ν/ν)和/或重量/重量(w/w))使用。本申請人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，與單獨施用本發(fā)明釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分；NA-B2級分)和單獨施用脂質(zhì)體兩性霉素-B(即Ambkome )所致的應(yīng)答相比，與脂質(zhì)體兩性霉素-B(即Ambkome )組合施用的本發(fā)明釀酒酵母線粒體核酸級分(即 NA級分；NA-B2級分)統(tǒng)計學顯著地提高Thl型應(yīng)答(即、干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-2 (IL-2)和/或白細胞介素-12 (IL-12)的產(chǎn)生)，其中由單獨施用本發(fā)明釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分；NA-B2級分)所致的應(yīng)答高于由單獨施用脂質(zhì)體兩性霉素-B (即 Ambkome :)所致的應(yīng)答。該效應(yīng)一般地稱作(如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用)‘協(xié)同效應(yīng)(synergic effect)，或(synergistic effect)，。因組合施用NA-B2級分和脂質(zhì)體兩性霉素-B(即Ambkome )所致的協(xié)同效應(yīng)在實施例6中描述并且在圖4( γ干擾素 (IFN-Y))和圖5(白細胞介素-12(IL-12))中顯示。就此方面而言，本發(fā)明也涉及具有協(xié)同效應(yīng)的佐劑組合物，其包含(i)由包括以下步驟的方法制備的釀酒酵母線粒體核酸級分a)在允許其生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)釀酒酵母，隨后離心所述培養(yǎng)物；b)破碎a)步驟中獲得的釀酒酵母沉淀；c)離心b)步驟中獲得的混合物；d)超速離心C)步驟中獲得的上清液；
e)從d)步驟中獲得的沉淀提取核酸；f)從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分；和(ii)脂質(zhì)體兩性霉素-B。就此方面而言，本發(fā)明也涉及具有協(xié)同效應(yīng)的疫苗組合物，其包含(i)由包括以下步驟的方法制備的釀酒酵母線粒體核酸級分a)在允許其生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)釀酒酵母，隨后離心所述培養(yǎng)物；b)破碎a)步驟中獲得的釀酒酵母沉淀；c)離心b)步驟中獲得的混合物；d)超速離心C)步驟中獲得的上清液；e)從d)步驟中獲得的沉淀提取核酸；f)從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分；(ii)脂質(zhì)體兩性霉素-B ；和(iii)抗原。本申請人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，與由單獨施用本發(fā)明釀酒酵母線粒體核酸級分(即 NA級分；NA-B2級分)和單獨施用二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)與N-[l_(2，3_ 二油酰氧) 丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)(即Lipofectin )所致的應(yīng)答相比，隨二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)(即 Lipofectin )組合施用的本發(fā)明釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分；NA-B2級分)統(tǒng)計學顯著地提高Thl型應(yīng)答(即γ干擾素(IFN-Y)、白細胞介素-2(IL-2)和/或白細胞介素-12 (IL-U)的產(chǎn)生)，其中由單獨施用本發(fā)明釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分； NA-B2級分)所致的應(yīng)答高于由單獨施用二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)與N_[l_(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)(即Lipofectin )所致的應(yīng)答。該效應(yīng)一般稱作(如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用)‘協(xié)同效應(yīng)(synergic effect)，或‘ (synergistic effect)，。由組合施用NA-B2級分和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)與N_[l_(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)(即Lipofectin )所致的協(xié)同效應(yīng)在實施例 6中描述并且在圖5(白細胞介素-12(IL-12))中顯示。就此方面而言，本發(fā)明也涉及具有協(xié)同效應(yīng)的佐劑組合物，其包含(i)由包括以下步驟的方法制備的釀酒酵母線粒體核酸級分a)在允許其生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)釀酒酵母，隨后離心所述培養(yǎng)物；b)破碎a)步驟中獲得的釀酒酵母沉淀；c)離心b)步驟中獲得的混合物；d)超速離心C)步驟中獲得的上清液；e)從d)步驟中獲得的沉淀提取核酸；f)從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分；和(ii) 二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)。就此方面而言，本發(fā)明也涉及具有協(xié)同效應(yīng)的疫苗組合物，其包含(i)由包括以下步驟的方法制備的釀酒酵母線粒體核酸級分a)在允許其生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)釀酒酵母，隨后離心所述培養(yǎng)物；
b)破碎a)步驟中獲得的釀酒酵母沉淀；c)離心b)步驟中獲得的混合物；d)超速離心C)步驟中獲得的上清液；e)從d)步驟中獲得的沉淀提取核酸；f)從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分；(ii) 二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)；和(iii)抗原。本發(fā)明也涉及試劑盒(kit of part)。該試劑盒可以是將全部組分(即本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分；抗原；改善釀酒酵母線粒體核酸級分和/或抗原的轉(zhuǎn)染效率和/ 或穩(wěn)定性的物質(zhì))容納在一起的單一容器，或它可以是分別地容納組分的單個劑量的多個容器，如泡罩包裝(blister pack)。試劑盒也可以具有用于說明不同組分的施用時間的說明書。說明書將指導受試者在適宜時間服用所述組分。例如，用于送遞組分的合適時間可以為癥狀出現(xiàn)時。備選地，用于施用組分的合適時間可以按常規(guī)時間表如按月或按年進行。 不同的組分可以同時或分開地施用，只要它們在時間上足夠接近地施用以產(chǎn)生協(xié)同免疫應(yīng)答即可。根據(jù)第一個優(yōu)選的實施方案，試劑盒包含含有至少一種本發(fā)明釀酒酵母線粒體核酸級分的容器和含有至少一種抗原的容器，以及用于說明施用所述組分的時間的說明書。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，試劑盒包含含有至少一種本發(fā)明釀酒酵母線粒體核酸級分的容器、含有至少一種抗原的容器、含有至少一種改善釀酒酵母線粒體核酸級分和 /或抗原的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì)(所述的物質(zhì)更優(yōu)選地是脂質(zhì)體兩性霉素-B和 /或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N, N-三甲基氯化銨 (DOTMA))的容器，和用于說明施用所述組分的時間的說明書。本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分可以用于制備藥物組合物(并且更尤其是佐劑組合物和疫苗組合物)，所述的藥物組合物旨在對哺乳動物預防和/或治療本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何疾病，例如癌癥、傳染病、變態(tài)反應(yīng)和/或自身免疫病。術(shù)語“癌(cancer)”、“瘤(neoplasm)”、“腫瘤(tumor)”和“癌瘤(carcinoma) ” 在本文中可互換地用來指這樣的細胞，它們顯示相對自主的生長，從而表現(xiàn)出以細胞增殖明顯失控為特征的異常生長表型。通常，本申請中待預防或治療的細胞包括癌前的(例如良性)、惡性、轉(zhuǎn)移前、轉(zhuǎn)移的和非轉(zhuǎn)移的細胞?！鞍?如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用)包括，但不限于肺癌(例如小細胞肺癌和非小細胞肺癌)、支氣管癌、食管癌、咽癌、頭頸癌(例如喉癌、唇癌、鼻腔與副鼻竇癌和咽喉癌)、口腔癌(例如舌癌)、胃癌(例如stomach cancer), 腸癌、胃腸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)直腸癌、肛門癌、肝癌、胰腺癌、尿道癌、膀胱癌、甲狀腺癌、 腎癌、癌瘤、腺癌、皮膚癌(例如黑素瘤)、眼癌(例如成視網(wǎng)膜細胞瘤)、腦癌(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細胞瘤和腦星形細胞瘤)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、淋巴瘤(例如皮膚B-細胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、霍奇金綜合征和非霍奇金淋巴瘤)、骨癌、白血病、乳腺癌、生殖道癌、 子宮頸癌(例如子宮頸上皮內(nèi)瘤變)、子宮癌(例如子宮內(nèi)膜癌)、卵巢癌、陰道癌、外陰癌、 前列腺癌、睪丸癌?！鞍币仓覆《菊T導的腫瘤，包括但不限于乳頭瘤病毒誘導的癌瘤、皰疹病毒誘導的腫瘤、EBV誘導的B細胞淋巴瘤、乙型肝炎病毒誘導的腫瘤、HTLV-I誘導的淋巴瘤和HTLV-2誘導的淋巴瘤。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，如實施例5中所述，本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分可以用于制備藥物組合物，所述的藥物組合物旨在用于對哺乳動物預防和/或治療腎癌。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“傳染病”指由傳染性生物引起的任何疾病。傳染性生物包括，但不限于，病毒(例如單鏈RNA病毒、單鏈DNA病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、 甲、乙和丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒(HSV)、巨細胞病毒(CMV)、呼吸道合胞體病毒(RSV)、 Epstein-Barr病毒(EBV)或人乳頭瘤病毒(HPV))、寄生物(例如原生動物和后生動物病原體如瘧原蟲屬(Plasmodia)物種、利什曼屬(Leishmania)物種、血吸蟲屬(Schistosoma) 物種或錐蟲屬(Trypanosoma)物種)、細菌(例如分枝桿菌，尤其結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、大腸桿菌或葡萄球菌)、真菌(例如假絲酵母屬(Candida)物種或曲霉屬 (Aspergillus)物種)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)和朊病毒。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，如實施例4中所述，本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分可以用于制備藥物組合物，所述的藥物組合物用于對哺乳動物預防和/或治療人乳頭瘤病毒(HPV)。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“變態(tài)反應(yīng)”指由變應(yīng)原(例如本發(fā)明前面所提及的變應(yīng)原)引起的任何變態(tài)反應(yīng)。如完整申請書通篇范圍內(nèi)所用，“自身免疫病”可以分成兩個一般類型“系統(tǒng)性自身免疫病”(即，損害眾多器官或組織的病癥)和‘局限化自身免疫病’(即，僅損害單一器官或組織的病癥)。然而，“局限化自身免疫病”的影響可以因間接影響其他身體器官和系統(tǒng)而是系統(tǒng)性的?！跋到y(tǒng)性自身免疫病”包括但不限于類風濕關(guān)節(jié)炎，其可以影響關(guān)節(jié)并可能影響肺、皮膚；狼瘡，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，其可以影響皮膚、關(guān)節(jié)、腎臟、心臟、腦、 紅細胞以及其他組織和器官；硬皮病，其可以影響皮膚、腸和肺；Sjogren綜合征，其可以影響唾液腺、淚腺和關(guān)節(jié)；Goodpasture綜合征，其可以影響肺和腎臟；韋格納肉芽腫，其可以影響鼻竇、肺、腎；風濕性多肌痛，其可以影響大肌肉群；以及顳動脈炎/巨細胞動脈炎，其可以影響頭部和頸部的動脈?！熬窒藁陨砻庖卟　卑ǖ幌抻?型糖尿病，其影響胰島； 橋本甲狀腺炎和Grave病，其影響甲狀腺；乳靡病(Celiac Disease)、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，其影響胃腸道；多發(fā)性硬化癥(MQ和Guillain-Barre綜合征，其影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)； Addison病，其影響腎上腺；原發(fā)性膽道硬化，硬化性膽管炎，和自身免疫性肝炎，其影響肝臟；以及雷諾現(xiàn)象，其可以影響手指、腳趾、鼻、耳。包含本發(fā)明釀酒酵母線粒體核酸級分的藥物組合物(并且更尤其地是佐劑組合物和疫苗組合物)還可以包含可藥用載體。該可藥用載體優(yōu)選地是等滲的、低滲的或略微高滲的并且具有相對低的離子強度，例如蔗糖溶液。另外，這種載體可以含有任意溶劑，或水性或部分水性的液體，如無熱原無菌水。另外，調(diào)節(jié)并且緩沖該藥物組合物的PH，從而滿足體內(nèi)使用的要求。所述藥物組合物(并且更尤其地是佐劑組合物和疫苗組合物)也可以包括可藥用的稀釋劑、助劑或賦形劑，以及增溶劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。對于注射施用，優(yōu)選在水溶液、非水溶液或等滲溶液中的制劑。該制劑可以按單個劑量或按多個劑量，以液體或干燥(粉末、凍干物和其他)形式提供，所述干燥形式可以在使用時用適宜稀釋劑重構(gòu) (reconstituted)0本發(fā)明也涉及使哺乳動物中的免疫應(yīng)答朝向針對抗原的Thl型應(yīng)答的方法，包含施用抗原和由本發(fā)明方法制備的釀酒酵母線粒體核酸級分至該哺乳動物。在一個實施方案中，該方法包括同時地施用該抗原和本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分。備選地，該方法包括依次地施用該抗原和本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分。術(shù)語“依次的”意指在一個時間段內(nèi)相繼地施用所述組分給受試者。因而，依次施用可以允許一種組分在另一種組分后數(shù)分鐘或數(shù)小時范圍內(nèi)施用。例如，實施例5描述了本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分(即 NA級分)和MUC-I抗原用于制備治療癌癥的藥物組合物的用途，其中釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分)晚于MUC-I抗原1小時注射。施用本發(fā)明的藥物組合物(并且更尤其地是佐劑組合物和疫苗組合物)，并且更尤其地施用所述組合物的不同組分(即本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分；抗原；改善釀酒酵母線粒體核酸級分和/或抗原的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì))，可以通過熟練技術(shù)人員已知的任何手段實現(xiàn)。優(yōu)選的施用途徑包括但不限于皮內(nèi)、皮下、口服、腸胃外、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腫瘤內(nèi)、舌下、氣管內(nèi)、吸入、眼、陰道和直腸。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，皮下或皮內(nèi)送遞本發(fā)明的藥物組合物(并且更尤其地是佐劑組合物和疫苗組合物)，并且更尤其地送遞所述組合物的組分。根據(jù)甚至更優(yōu)選的本發(fā)明實施方案，在相同部位施用本發(fā)明的抗原和釀酒酵母線粒體核酸級分。例如，實施例5描述了本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分)和MUC-I抗原用于制備治療癌癥的藥物組合物的用途，其中釀酒酵母線粒體核酸級分 (即NA級分)和MUC-I抗原在相同的部位皮下施用。施用可以以單一劑量進行，或按某個時間間隔重復一次或多次劑量。期望地，藥物組合物，并且更尤其地所述藥物組合物的組分，按每周間隔施用1次至10次。例如，實施例 5描述了本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分)和MUC-I抗原用于制備治療癌癥的藥物組合物的用途，其中釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分)和MUC-I抗原按每周間隔施用3次?？乖┯玫膭┝恳彩强勺兊模⑶铱梢噪S多種參數(shù)進行調(diào)整，所述的參數(shù)尤其是施用模式；使用的藥物組合物；宿主生物的年齡、健康和重量；癥狀的本質(zhì)和程度；并行療法的類型；治療頻率；和/或?qū)︻A防或治療的需求。進一步微調(diào)計算結(jié)果以確定適宜的治療劑量可以由執(zhí)業(yè)醫(yī)生在考慮相關(guān)情況下常規(guī)地進行。作為一般指導，包含MVA的組合物的合適劑量從約IO4至IOuiPfu(蝕斑形成單位)，有利地約IO5至l(fpfu ；包含腺病毒的組合物從約IO5至1013iu (感染單位)，有利地約IO7至1012iu。基于載體質(zhì)粒的組合物可以按10 μ g至20mg、有利地100 μ g至^iig的劑量施用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，藥物組合物以包含5X IO5Pfu至5Xl(fpfu MVA載體的劑量施用。例如，實施例5描述了本發(fā)明的釀酒酵母線粒體核酸級分(即NA級分)和 MUC-I抗原用于制備治療癌癥的藥物組合物的用途，其中包含于MVA載體中的MUC-I抗原以 5 X 107pfu 施用。當本發(fā)明的用途、方法、佐劑組合物、疫苗組合物或試劑盒用于治療癌癥時，本發(fā)明的用途、方法、佐劑組合物、疫苗組合物或試劑盒可以與一種或多種常規(guī)治療方法(例如放療法、化療法和/或手術(shù))聯(lián)合實施。多種治療手段的使用為患者提供更寬的介入。在一個實施方案中，本發(fā)明方法可以在手術(shù)介入之前或之后。在另一個實施方案中，它可以在放療(例如，Y放療)之前或之后。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地配置可以使用的適宜放療方案和參數(shù)(例如，見PEREZ，放射腫瘤學原理與實踐(Principles and practice of radiation oncology).第2版LIPPINC0TT，1992 ；如本領(lǐng)域技術(shù)人員易于明了的，使用適宜的調(diào)整和改動)。本發(fā)明還涉及用于改善對癌癥患者的治療的方法，所述的癌癥患者正在用化療藥進行化療，所述方法包括用如上所公開的方法一起共同治療該患者。本發(fā)明還涉及用于改善細胞毒性藥物或放療的細胞毒性效力的方法，所述方法包括對需要該治療的患者，聯(lián)合如上所公開的方法進行共同治療。當本發(fā)明的用途、方法、佐劑組合物、疫苗組合物或試劑盒用于治療傳染病時，本發(fā)明的用途、方法、佐劑組合物、疫苗組合物或試劑盒可以隨其他治療性化合物如抗生素、 抗真菌化合物、抗寄生物化合物和/或抗病毒化合物的應(yīng)用一起實施。本發(fā)明還涉及用于改善抗生素、抗真菌藥物、抗寄生物藥物和/或抗病毒藥物的治療效力的方法，所述方法包括對需要該治療的患者，聯(lián)合如上所公開的方法進行共同治療。在另一個實施方案中，本發(fā)明的用途、方法、佐劑組合物、疫苗組合物或試劑盒按照初免-加強免疫(prime-boost)治療模式實施，其包括相繼地施用一種或多種初免組合物和一種或多種加強免疫組合物。一般，初免組合物和加強組合物使用包含或編碼至少一個共同抗原結(jié)構(gòu)域的不同載體(vehicle)。初免組合物首先施用至宿主生物并且加強組合物相繼地在1日至12個月的時間之后施用至相同的宿主生物。本發(fā)明的方法可以包括初免組合物的1至10個依次施用，后續(xù)加強組合物的1至10個依次施用?？赡芷谕?，注射間隔期是大約1周至6個月。另外，可以在相同部位或在不同部位，通過相同的施用途徑或通過不同的施用途徑，施用初免組合物和加強組合物。附圖簡述

圖1 在IxTAE (Tris-乙酸鹽-EDTA)緩沖液中在瓊脂糖凝膠(1 % )內(nèi)的NA級分、 NA-Bl級分和NA-B2級分，伴有或不伴有RNA酶處理。圖2:由皮下注射(第0日；第7日和第14日)HPV16E7抗原(IOyg)與NA級分 (25 μ g)或NA-B2級分(0. 4 μ g)所產(chǎn)生的體內(nèi)ELISpot γ干擾素(IFN- y )。圖3 皮下施用(在第4日、第11日和第18日)5X l(fpfu表達MUCl抗原和hIL_2 的MVA株(MVA9931)和(1小時后)NA級分(50 μ g)對B6D2小鼠的腫瘤體積的影響，其中所述的B6D2小鼠皮下注射了 3 X IO5個RenCa-MUC-I細胞(在第1日)。腫瘤內(nèi)(I. T.)施用(在第4日、第Ii日和第18日)NA+Lipofectin (50 μ g+50 μ g)的影響。一周2次測量腫瘤體積。圖4:在用 NA-B2 級分(0.4 μ g 或 1. 2 μ g)、AmWsome (120 μ g)或 NA-B2+Ambisome (ο. 4 μ g+120 μ g或ι. 2 μ g+120 μ g)處理的人未成熟的單核細胞衍生的樹突細胞(moDC)中γ干擾素(IFN-γ)的誘導。圖5 在用 NA-B2 級分(0. 2 μ g)、！Jpofectin (10 μ g) Ambisome (80 μ g， 120 μ g 或 160 μ g)、！VA-B2+Lipofectin (ο· 2 μ g+io μ g)和NA-B2+Ambisome
(0. 2 μ g+120 μ g)處理的人未成熟moDC中白細胞介素-12(IL-12)的誘導。圖6 在用 NA-B2 級分(0. 4 μ g 或 1. 2 μ g)、AmWsome (120 μ g 或 240 μ g) 和 NA-B2+Ambisome (ο· 4 μ g+120 μ g、o. 4 μ g+240 μ g、ι· 2 μ g+120 μ g 或 1. 2 μ g+240 μ g)處理的人未成熟moDC中α干擾素(IFN- α )的誘導。
25實施例為舉例說明本發(fā)明，提供以下實施例。所述實施例不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1 釀酒酵母線粒體核酸級分(NA級分)的制備將等份樣的冷凍釀酒酵母(S. c.) AH109 (Clonetech)鋪展在由酵母提取物， 1% Bacto 胨、2%葡萄糖、2%瓊脂(BD Sciences)和 100 μ g/ml 腺嘌呤(Fluka 01830-5G) 組成的YPG平板上。在至30°C培育2日，用刮勺取得等份樣的釀酒酵母S. c. AH109以接種傾入一只500ml瓶中的IOOml液體YPG/腺嘌呤培養(yǎng)基。在攪拌下QOO轉(zhuǎn)/分鐘)28°C 過夜孵育后，分別地將15ml這種預培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有500ml YPG/腺嘌呤培養(yǎng)基的6只 2000ml瓶中。這些培養(yǎng)物(總計3升)在攪拌下QOO轉(zhuǎn)/分鐘)28°C孵育過夜。在600nm 處測量的光密度(OD6J為2+/-0. 5時，將培養(yǎng)物以3500轉(zhuǎn)/分鐘(Sorvall離心機，500ml 管)于4°C離心15分鐘。細胞沉淀用蒸餾水洗滌一次，例如每份從3升培養(yǎng)物衍生的沉淀用1升蒸餾水。在離心(SorVall，3500轉(zhuǎn)/分鐘，在4°C持續(xù)15分鐘)后，將細胞沉淀溶解于PBS中，使所得懸液的0D600是約100 (例如從3升培養(yǎng)物衍生的細胞沉淀溶解于40ml PBS中)。從該步驟起，樣品總是維持在冷溫)將30ml所述細胞懸液轉(zhuǎn)移到125ml聚對苯二甲酸乙二酯(PETG)瓶中并且與30ml無菌玻璃珠(直徑0. 7mm)混合。將混合物以最大速度持續(xù)1分鐘渦旋并交替以冰上孵育1分鐘，進行5次渦旋(桌面渦旋混合儀TOPMIX 94323 BI0BL0CK Scientifique)。細胞裂解物使用借助1000 μ 1藍色吸頭延長以避免抽吸玻璃珠的5ml玻璃吸管回收，并且連同用來洗滌玻璃珠的IOml PBS—起轉(zhuǎn)移到50ml離心管(Corning)中。將細胞裂解物在4000轉(zhuǎn)/分鐘于4°C (Sorvall)離心10分鐘以使膜殘片以及細胞核沉淀。獲得的上清液在12ml管中以39000轉(zhuǎn)/分鐘在4°C于SW40轉(zhuǎn)頭(105000g)中超速離心90分鐘，以沉淀線粒體。沉淀溶解于冷的PBS中(例如，從初始9升釀酒酵母培養(yǎng)物獲得的沉淀溶解于100ml PBS中)。所得的線粒體級分命名為SN。獲得的SN級分用酚處理以從蛋白質(zhì)和脂質(zhì)中提取核酸。為此，將等體積的Tris 緩沖的酚(Amresco)添加至該懸液，以最大速度在室溫(RT)渦旋混合1分鐘并且離心(例如，50ml Falcon管在室溫于Hareus離心機中以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘)。將上層水相分離并轉(zhuǎn)移在一只新管中。酚提取過程重復三次。3次酚提取后回收的上層水相隨后用二氯甲烷(P.A. ；Merck)提取兩次添加等體積的二氯甲烷并且將混合物在室溫渦旋混合 30秒并離心(例如，50ml Falcon管在室溫于Hareus離心機中以5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘)?；厥账嗖⑶抑貜投燃淄樘幚?。通過乙醇沉淀法從分離的上清液回收核酸以上清液體積的1/10添加3M乙酸鈉 PH 5以及添加2體積的乙醇(無水乙醇)。在4°C過夜孵育后，將溶液離心(例如，50ml Falcon管在4°C于Hareus離心機中20分鐘)。沉淀用冷的70%乙醇洗滌。在完全干燥之后，沉淀溶解于TE pH7. 5中(例如從d)步驟中獲得的IOOml懸液中衍生的沉淀溶解于 20-25ml TE pH7. 5中，形成如由260nm處的光密度所度量的約1 μ g/ μ 1核酸濃度)。所得的線粒體核酸級分命名為NA級分。已經(jīng)根據(jù)所述方法進行了從9升釀酒酵母培養(yǎng)物開始的3次獨立大規(guī)模釀酒酵母核酸級分(即NA級分)制備。這3個制備物導致相當?shù)奶卣?。全?個制備物中由LAL 測定法測量的內(nèi)毒素水平是低的且相當?shù)?在0. 5和0. 7EU/ml之間)。也已經(jīng)進行從釀酒酵母W303 (Biochem)開始的釀酒酵母核酸級分(即NA級分) 制備。為產(chǎn)生NA級分-Lipofectin (其將在以下實施例中測試)，將NA級分(iyg/ μ 1)與Lipofectin (1μ g/μ I ； Invitrogen,目錄號 18292-011 或目錄號 18292-037)以比率1 l(v ν和w w)混合。實施例2 從NA級分(ΝΑ-Β2級分)分離線粒體RNA在IxTAE (Tris-乙酸鹽-EDTA)緩沖液中在1 %瓊脂糖凝膠上跑根據(jù)實施例1中所述方法制備的NA級分。圖1中所示結(jié)果顯示與DNA標記X-HindIII/PhiX174-HaeIII (在圖1中叫做M) 相比，可以清楚地區(qū)分3組核酸(1) 一條遷移在20Kbp附近的清晰條帶，叫做NA-Bl級分；(2) 一條遷移在4Kbp附近的清晰條帶，叫做NA-B2級分；和(3)在1000和約IOObp之間遷移的彌散分子，叫做NA小級分。隨后，使用輕微UV和手術(shù)刀片從瓊脂糖凝膠切下各條帶或條帶群，以進行NA-Bl 級分，NA-B2級分和NA小級分的純化。將切下的瓊脂糖塊轉(zhuǎn)移到一個“雙管結(jié)構(gòu)體”(= 0. 5ml管插在切下蓋的2ml管中，其中所述的0. 5ml管在底部帶有通過施加熱針而產(chǎn)生的孔，孔中塞有棉花充當過濾器)中，在低于-60°C冷凍，在室溫于臺面離心機中以5000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心15分鐘(直至材料徹底融化)，隨后以14000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘。在下部管中回收的溶液轉(zhuǎn)移到新管中。如實施例1中所述使用乙酸鈉和乙醇沉淀核酸。沉淀溶解于TE PH7.5中。一般，從瓊脂糖凝膠上的:3mg NA級分開始，回收約8 μ g的NA-B2級分，通常在 TE ρΗ7· 5中溶解至20ng/ μ 1濃度。伴有或不伴有RNA酶處理(100mg/ml ；Qiagen)，NA級分、NA-B1級分和NA-B2級分隨后在IxTAE (Tris-乙酸鹽-EDTA)緩沖液中在瓊脂糖凝膠上跑膠。如圖1中所示的結(jié)果表明(I)NA-Bl級分證明是HaeIII-敏感且RNA酶A不敏感的，說明NA-B1級分是DNA ；(2)NA-B2級分和NA小級分是HaeIII不敏感且RNA酶A敏感的，說明這些分子是 RNA。相同結(jié)果已經(jīng)用從釀酒酵母AH109 (Clonetech)得到的級分和從釀酒酵母 W303 (Biochem)得到的級分獲得。為產(chǎn)生NA-B2級分-Lipofectin (其將在以下實施例中測試)，將NA-B2級分 OOng/μ 1)與 Lipofectin (I μ g/μ I ； Invitrogen,目錄號 18292-011 或目錄號 18292-037)以比率 1 1 (ν ν)混合。為產(chǎn)生ΝΑ-Β2級分-Ambkome (其將在以下實施例中測試)，將NA-B2級分 OOng/μ 1)與 Ambisome g/μ ι ;Gilead Sciences)以比率 1 : 1 或1 3 (ν ν)混合。實施例3 =NA級分和ΝΑ-Β2級分刺激人Toll樣受體(TLR)的能力細胞人胚腎細胞^3(HEK)用允許組成型表達1種或2種人源Toll樣受體(hTLR)的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。產(chǎn)生的細胞系 ^3/hTLR2-CD14J93/hTLR3、293/hTLR4-MD2-CD14J93/ hTLR5、293/hTLR2/6、293/hTLR7、293/hTLR8 和 293/hTLR9 購自 InvivoGen (San Diego、CA、 美國)。全部細胞系均在殺稻瘟素3(1(^8/!111，^^&06611)存在下于補充有10%胎牛血清、 40μ g/ml慶大霉素、2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸鈉(Sigma)和Ix非必需氨基酸(NEAA，Gibco) 的 Dulbecco 極限 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。在 ^3/hTLR2_CD14 和 293/hTLR4_MD2_CD14 的情況下，添加潮霉素B至100 μ g/ml濃度。全部8個細胞系用NF-kB誘導型報道質(zhì)粒 PNiFty(InvivoGen)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。pNiFty編碼在工程化ELAMl啟動子控制下的螢火蟲螢光素酶基因，其中所述的工程化ELAMl啟動子組合5個NF-kB位點和近端ELAM啟動子。在 100 μ g/ml Zeocin(InvivoGen)存在下選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。出現(xiàn)的克隆“hTLRx-luc”就相對于相應(yīng)對照TLR配體的EC50和倍數(shù)誘導進行了表征。選擇具有最低EC50和高倍數(shù)誘導及良好/可接受生長行為的克隆。在表1中列出所保留的克隆和它們的特征。表1:
權(quán)利要求
1.釀酒酵母線粒體核酸級分和抗原用于制備使免疫應(yīng)答朝向針對所述抗原的Thl型應(yīng)答的藥物組合物的用途，特征在于所述的釀酒酵母線粒體核酸級分由包括以下步驟的方法制備a)在允許其生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)釀酒酵母，隨后離心所述培養(yǎng)物；b)破碎a)步驟中獲得的釀酒酵母沉淀；c)離心b)步驟中獲得的混合物；d)超速離心c)步驟中獲得的上清液；e)從d)步驟中獲得的沉淀提取核酸；f)從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中核酸是核糖核酸(RNA)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中抗原選自由腫瘤相關(guān)抗原(TAA)、傳染性生物特異性抗原和變應(yīng)原特異性抗原組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中抗原選自由肽、核酸、脂質(zhì)、脂肽和糖組成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中TAA是MUC-I。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中傳染性生物特異性抗原是人乳頭瘤病毒(HPV)特異性抗原，優(yōu)選地是HPV-16或/和HPV-18特異性抗原，并且更優(yōu)選地是選自由HPV-16或 /和HPV-18的E6早期編碼區(qū)、HPV-16或/和HPV-18的E7早期編碼區(qū)和其部分或組合組成的組中的抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中抗原被包含于載體中，所述載體優(yōu)選地選自質(zhì)?；虿《据d體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中病毒載體從痘病毒、優(yōu)選地從痘苗病毒并且更優(yōu)選地從改良安卡拉痘苗病毒(MVA)或其衍生物獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中病毒載體從腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、甲病毒或泡沫病毒或其衍生物獲得。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中載體還包含在抗原是核酸時表達該抗原所必需的元件。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中藥物組合物還包含一種或多種改善釀酒酵母線粒體核酸級分和/或抗原的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì)，所述物質(zhì)優(yōu)選地選自由脂質(zhì)、脂質(zhì)體、亞微水包油乳液、微粒子、ISCOM和聚合物組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中脂質(zhì)體是陽離子脂質(zhì)體，優(yōu)選地選自二油酰磷脂酰乙醇胺(D0PE)、N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)和脂質(zhì)體兩性霉素-B或其組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中所述組合是二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和 N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，用于制備預防和/或治療癌癥、傳染病、變態(tài)反應(yīng)和/ 或自身免疫病的藥物組合物。
15.具有協(xié)同效應(yīng)的佐劑組合物，包含(i)由包括以下步驟的方法制備的釀酒酵母線粒體核酸級分a)在允許其生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)釀酒酵母，隨后離心所述培養(yǎng)物；b)破碎a)步驟中獲得的釀酒酵母沉淀；c)離心b)步驟中獲得的混合物；d)超速離心c)步驟中獲得的上清液；e)從d)步驟中獲得的沉淀提取核酸；f)從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分；和 ( )脂質(zhì)體兩性霉素-B
16.具有協(xié)同效應(yīng)的疫苗組合物，包含(i)由包括以下步驟的方法制備的釀酒酵母線粒體核酸級分a)在允許其生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)釀酒酵母，隨后離心所述培養(yǎng)物；b)破碎a)步驟中獲得的釀酒酵母沉淀；c)離心b)步驟中獲得的混合物；d)超速離心c)步驟中獲得的上清液；e)從d)步驟中獲得的沉淀提取核酸；f)從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分； ( )脂質(zhì)體兩性霉素-B;和(iii)抗原。
17.具有協(xié)同效應(yīng)的佐劑組合物，包含(i)由包括以下步驟的方法制備的釀酒酵母線粒體核酸級分a)在允許其生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)釀酒酵母，隨后離心所述培養(yǎng)物；b)破碎a)步驟中獲得的釀酒酵母沉淀；c)離心b)步驟中獲得的混合物；d)超速離心c)步驟中獲得的上清液；e)從d)步驟中獲得的沉淀提取核酸；f)從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分；和( ) 二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)。
18.具有協(xié)同效應(yīng)的疫苗組合物，包含(i)由包括以下步驟的方法制備的釀酒酵母線粒體核酸級分a)在允許其生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)釀酒酵母，隨后離心所述培養(yǎng)物；b)破碎a)步驟中獲得的釀酒酵母沉淀；c)離心b)步驟中獲得的混合物；d)超速離心c)步驟中獲得的上清液；e)從d)步驟中獲得的沉淀提取核酸；f)從e)步驟中獲得的上清液回收核酸級分；( ) 二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和N-[l-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)；禾口 (iii)抗原。
19.試劑盒，其包含含有至少一種釀酒酵母線粒體核酸級分的容器和含有至少一種抗原的容器，和用于說明施用所述組分的時間的說明書。
20.試劑盒，其包含含有至少一種釀酒酵母線粒體核酸級分的容器、含有至少一種抗原的容器，包含至少一種改善釀酒酵母線粒體核酸級分和/或抗原的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定性的物質(zhì)的容器，和用于說明施用所述組分的時間的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及釀酒酵母線粒體核酸級分和抗原用于制備使免疫應(yīng)答朝向針對所述抗原的Th1型應(yīng)答、更尤其地用于預防和/或治療癌癥、傳染病和變態(tài)反應(yīng)的藥物組合物的用途。也提供了具有協(xié)同效應(yīng)的佐劑組合物、具有協(xié)同效應(yīng)的疫苗組合物和試劑盒。也提供了治療個體的方法。
文檔編號A61K39/00GK102281892SQ201080004457
公開日2011年12月14日 申請日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者K·里特納 申請人:特朗斯吉有限公司