基于競爭性等位基因特異性pcr技術(shù)的flc1特異snp分子標(biāo)記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及基于競爭性等位基因特異性PCR技術(shù)的FLC1 特異SNP分子標(biāo)記及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白菜類作物是我國栽培面積最大的蔬菜作物，在我國菜籃子工程中的作用舉足輕 重。近年，隨著人們生活水平的提高，白菜生產(chǎn)已由保證數(shù)量供給為主轉(zhuǎn)向以提高品質(zhì)、滿 足周年生產(chǎn)供應(yīng)和高端需求為主。食用品質(zhì)優(yōu)良、能滿足多元化需求的特色大白菜品種如 春播白菜、娃娃菜和快菜等在市場中越來越走俏，使得春白菜及高寒地區(qū)的春夏白菜栽培 面積逐年擴大。先期抽薹是制約我國春大白菜及高海拔地區(qū)春夏白菜生產(chǎn)的主要限制因 素，其對白菜生產(chǎn)最重要的影響是抑制葉片中營養(yǎng)物質(zhì)積累，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。篩選抗 抽薹遺傳資源，培育抗抽薹新品種是解決白菜先期抽薹開花的根本途徑，也是目前白菜最 重要的育種目標(biāo)之一。
[0003] 抽薹開花是受復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的數(shù)量性狀，并且該網(wǎng)絡(luò)中的很多基因都受表觀 遺傳水平上的調(diào)控。FLC是控制植物開花的關(guān)鍵調(diào)控因子。白菜BrFLC家族共有BrFLCl-3 和BrFLC5四個基因，在擬南芥和大白菜中過量表達(dá)這些BrFLC均可導(dǎo)致開花延遲，這說 明BrFLC的功能與擬南芥FLC類似（Schranzetal.，2002;Kimetal.，2007 ;黃細(xì)松 等，2007)。最近研究顯示位于A02染色體的BrFLC2是調(diào)控白菜開花的重要基因（Zhaoet al.，2010;Xiaoetal.，2013);也有研究顯示，BrFLCl的可變剪切與開花時間密切相關(guān) (原玉香等，2〇〇8;Yuanetal.，2〇〇9) 〇
[0004] 在育種實踐及相關(guān)生物學(xué)研究的過程中，分子標(biāo)記起著極其重要的作用。其在目 標(biāo)資源篩選，定位調(diào)控特定農(nóng)藝性狀的基因，基因聚合，品種鑒定等方面的應(yīng)用越來越廣 泛。SNP屬于新一代分子標(biāo)記，具有豐度高、檢測易實現(xiàn)自動化等特點。不同物種全基因組 的序列測定及比較表明，SNP在基因組上的分布極其豐富，相比于目前育種中常用的SSR標(biāo) 記要廣泛得多。SNP突變率低，尤其處于編碼區(qū)的SNP是高度穩(wěn)定的，其遺傳穩(wěn)定性要比SSR 等遺傳標(biāo)記高得多，遺傳分析或基因診斷時的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性都優(yōu)于SSR。
[0005] 基于KASP(競爭性等位基因特異性PCR)的SNPline基因分型檢測是英國 LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist)有限公司開發(fā)的高通量SNP分型技術(shù)，其 具有準(zhǔn)確、靈活、低成本、高通量的特點，目前已經(jīng)成為國際上SNP分析的主流方法之一。該 方案的核心是KASP技術(shù)，即CompetitiveAllele-SpecificPCR。這項技術(shù)是基于引物末 端堿基的特異匹配來對SNP分型以及檢測InDels(InsertionsandDeletions，插入和缺 失）。
[0006] 分子標(biāo)記在基于分子標(biāo)記輔助選擇（MAS)技術(shù)的抗性育種工作中起著越來越重 要的作用。然而與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記在應(yīng)用過程中有可能受到遺傳背景的限 制，在不同的群體中需對親本的多態(tài)性進(jìn)行檢測；此外，在減數(shù)分裂過程中，該類型的分子 標(biāo)記仍然存在著因染色體發(fā)生交換而失去了與目的基因緊密連鎖關(guān)系的可能性，這使得 在目的基因鑒定過程中會出現(xiàn)錯選或漏選的情況（Hayashietal.，2006;Ingvardsenet al.，2008)。因此開發(fā)功能基因的分子標(biāo)記顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個目的是提供檢測白菜基因組中FLC1-13859895G/ASNP位點的多態(tài) 性或基因型的物質(zhì)的用途。
[0008] 本發(fā)明提供了檢測白菜基因組中FLC1-13859895G/ASNP位點的多態(tài)性或基因型 的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定白菜的抽薹狀態(tài)中的應(yīng)用；
[0009] 或本發(fā)明提供了檢測白菜基因組中FLC1-13859895G/ASNP位點的多態(tài)性或基因 型的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定白菜的抽薹狀態(tài)產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的是提供檢測白菜基因組中FLC1-13859895G/ASNP位點的多 態(tài)性或基因型的物質(zhì)的用途。
[0011] 本發(fā)明提供了檢測白菜基因組中FLC1-13859895G/ASNP位點的多態(tài)性或基因型 的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定白菜為早抽薹白菜或晚抽薹白菜中的應(yīng)用；
[0012] 或本發(fā)明提供了檢測白菜基因組中FLC1-13859895G/ASNP位點的多態(tài)性或基因 型的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定白菜為早抽薹白菜或晚抽薹白菜產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述檢測白菜基因組中FLC1-13859895G/ASNP位點的多態(tài)性或基因 型的物質(zhì)包括由序列1所示的單鏈DNA分子、序列2所示的單鏈DNA分子和序列3所示的 單鏈DNA分子組成的引物組。
[0014] 上述物質(zhì)可以是引物組或含有引物組的試劑或試劑盒等。
[0015] 本發(fā)明第三個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測白菜為早抽薹白菜或晚抽薹 白菜品種的方法。
[0016] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測白菜基因組FLC1-13859895G/ASNP 位點基因型為AA、GG或GA，若所述待測白菜基因組FLC1-13859895G/ASNP位點基因型 為AA，則所述待測白菜為或候選為早抽薹白菜；若所述待測白菜基因組FLC1-13859895G/ ASNP位點基因型為GG或GA，則所述待測白菜為或候選為晚抽薹白菜。
[0017] 抽薹指數(shù)0-33. 3為晚抽薹材料，77. 7-100為早抽薹材料。
[0018] 上述方法中，所述檢測待測白菜基因組FLC1-13859895G/ASNP位點基因型的方法 為如下：
[0019] 1)直接測序；
[0020] 2)用引物對待測白菜進(jìn)行等位基因特異性PCR;
[0021] 所述引物由序列1所示的單鏈DNA分子、序列2所示的單鏈DNA分子和序列3所 示的單鏈DNA分子組成。
[0022] 上述方法中，所述FLC1-13859895G/ASNP位點為序列表中序列4中第182位核苷 酸。
[0023] 本發(fā)明第四個目的是提供鑒定或輔助鑒定待測白菜抽薹的引物。
[0024] 本發(fā)明提供的引物，由序列1所示的單鏈DNA分子、序列2所示的單鏈DNA分子和 序列3所示的單鏈DNA分子組成。
[0025] 本發(fā)明第五個目的是提供鑒定或輔助鑒定待測白菜抽薹的PCR試劑。
[0026] 本發(fā)明提供的PCR試劑，為含有上述的引物的PCR試劑；所述引物中的每條引物在 所述PCR試劑中的終濃度均為10μΜ;
[0027] 本發(fā)明第六個目的是提供鑒定或輔助鑒定待測白菜抽薹的試劑盒。
[0028] 本發(fā)明提供的試劑盒，為含有上述的引物或上述的試劑盒。
[0029] 本發(fā)明第七個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測白菜為早抽薹白菜或晚抽薹 白菜品種的方法。
[0030] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：用上述的引物對待測引物進(jìn)行等位基因特異 性PCR，若所述待測白菜基因組FLC1-13859895G/ASNP位點基因型為ΑΑ，則待測白菜為或候 選為早抽薹白菜；若所述待測白菜基因組FLC1-13859895G/ASNP位點基因型為GG或G/A， 則待測白菜為或候選為晚抽薹白菜。
[0031] 上述方法中，所述等位基因特異性PCR的模板為待測白菜的基因組DNA。
[0032] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0033] 1.本發(fā)明提供的分子標(biāo)記是功能型基因分子標(biāo)記。在實踐育種工作中，與目的基 因緊密連鎖的分子標(biāo)記在應(yīng)用過程中有可能受到遺傳背景的限制。本發(fā)明所涉及的SNP分 子標(biāo)記是基于功能基因FLC的序列變異引起的。研究表明FLC是控制白采抽臺開花的關(guān)鍵 因子，因此該標(biāo)記可在很大程度上避免遺傳背景的不同對檢測結(jié)果的影響。
[0034] 2.本發(fā)明提供的分子標(biāo)記能對該SNP位點的G或Α堿基進(jìn)行特異的區(qū)分和檢測。
[0035] 3.本發(fā)明提供的分子標(biāo)記在實際應(yīng)用中，低成本、高通量。目前，檢測SNP的方法 有測序法、熒光檢測法、DNA芯片、質(zhì)譜檢測法等，而這些方法大部分成本高，速度慢。本發(fā) 明提供的分子標(biāo)記只需PCR和熒光檢測兩個步驟，成本低、通量高、加上特異性高（即準(zhǔn)確 度高），特別適用于育種實踐中。
[0036] 4.本發(fā)明提供的分子標(biāo)記準(zhǔn)確度高。利用105份不同遺傳材料組成的自然群體試 驗表明，開發(fā)的SNP標(biāo)記特異引物可以對抽薹性狀良好分型，具有良好的應(yīng)用價值，可實現(xiàn) 對抗抽薹遺傳材料的的預(yù)先選擇和輔助育種。
【附圖說明】
[0037] 圖1為是FLC1-13859895G/A位點特異性分子標(biāo)記（FLC1SNP)在105份高代自交 型材料中的基因分型鑒定圖。
[0038] 圖2為是FLC1-13859895G/A位點對照引物在105份高代自交型材料中的鑒定圖。
【具體實施方式】
[0039] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0040] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0041] 實施例1、分子標(biāo)記的獲得
[0042] 為了更好更快地篩選獲得抗抽薹資源，促進(jìn)分子標(biāo)記輔助選擇育種實踐的進(jìn)行， 通過對5個抗抽薹白菜材料和5個易抽薹白菜材料的重測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在FLC1基因 內(nèi)部第3763位的堿基有一個G/A突變的SNP位點，該位點的物理位置位于A10染色體第 13859895位堿基，該SNP位點命名為FLC1-13859895G/A位點。
[0043] 根據(jù)FLC1-13859895G/A位點，設(shè)計如下可用于KASP技術(shù)的FLC1特異的引物作為 分子標(biāo)記：上游引物FLC1-FF、上游引物FLC1-FV和下游引物FLC1-R。
[0044] 上述FLC1-FF、FLC1-FV和FLC1-R引物委托英國LGC(Laboratoryofthe GovernmentChemist政府化學(xué)家實驗室）有限公司獲得。
[0045]FLC1-FF、FLC1-FV和FLC1-R引物序列特征如下：
[0046] 上游引物FLC1-FF:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAACCATGTTTTGGCTAGCCAGa(序列 1)；
[0047] 上游引物FLC1-FV:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAACCATGITTTGGCTAGCCAGg(序列 2)；
[0048] 下游引物FLC1-R:AATCGGATCGAAACTTAAACCGTAAC(序列 3)。
[0049] 上述上游引物