一種用于動物組織基因組dna快速提取試劑盒及提取方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于動物組織基因組DNA快速提取試劑盒及提取方法和應(yīng)用，屬 于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 全基因組是細胞或組織中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部基因信息。幾乎 所有的生命信息均可以從全基因組中發(fā)現(xiàn)，包括與動物疾病相關(guān)的基因表達與調(diào)控。目前， 病原學(xué)檢測與分子診斷是臨床檢測中常見的技術(shù)，其敏感性與特異性與DNA提取的純度和 濃度有很大關(guān)系，直接決定了檢測的結(jié)果。在動物疾病檢測與分子診斷中，高靈敏度與特異 性的分子診斷已逐步取代血清學(xué)檢查。因而，獲取高純度與高濃度的基因組DNA是動物病 原菌科研和臨床檢測中的第一步，其決定了擴增結(jié)合和診斷的特異性。
[0003] DNA提取是分子生物學(xué)研宄中常用的一種技術(shù)，目前市場上有多種DNA提取方法。 動物組織中含有大量的蛋白質(zhì)、鹽類及雜質(zhì)，其性質(zhì)與核酸的性質(zhì)非常相似，難以從提取的 DNA中分離出，在動物組織DNA提取的過程中，很容易與DNA共同沉淀，并且難以分離，往往 造成提取的DNA純度和濃度不夠，影響了后續(xù)的擴增和測序。
[0004] 為降低或清除動物組織中的蛋白質(zhì)、鹽類及雜質(zhì)，現(xiàn)有的DNA提取過程中常常有 污染，并且步驟繁瑣，提取過程時間較長。如高氯酸鈉法、SDS法和尿素法等提取方法，但這 些方法需要樣本量較大，并且苯酚類等有機物容易在DNA溶液中殘留，特別是在后續(xù)的PCR 擴增過程中會干擾擴增過程，影響擴增結(jié)果，使得該方法的應(yīng)用受到一定的限制。
[0005] 目前市場上采用的方法為：（1)采用氯仿、苯酚抽提法來去除蛋白質(zhì)、鹽類和雜 質(zhì)。苯酚和氯仿是DNA提取過程的變性劑，反復(fù)抽提可以去除蛋白質(zhì)、鹽類和雜質(zhì)。但苯酚 和氯仿對人體有較大的毒性，揮發(fā)性較強，并且整個提取過程步驟繁瑣，耗時較長，往往容 易導(dǎo)致DNA降解，并且增加能耗和試驗成本。（2)提取DNA的首要步驟為裂解樣品，目前市 場上公開的方法為多為水浴裂解法，需要15分鐘到1個小時，裂解時間較長。
[0006] 對于動物組織組織而言采用分子生物學(xué)方法來研宄其病原菌診斷，首先要進行的 就是樣品中細菌或病毒的DNA提取。能獲取不同種類的細菌DNA或不同種類病毒的DNA，以 及基因組的完整性、純度和濃度，是從動物組織中提取DNA用于動物病原菌診斷研宄的首 要目標(biāo)。因此，需要一種適于用于動物基因組DNA快速提取試劑盒，才能滿足當(dāng)前快速分子 診斷的需求，保障畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的：在于提供一種用于動物組織基因組DNA快速提取試劑盒及提取方 法和應(yīng)用，本試劑盒操作簡便、省工省時，整個提取過程只需6分鐘，可以滿足樣品較多和 快速提取DNA的需求，為動物病原菌快速診斷和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持和理論基 礎(chǔ)。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 一種用于動物組織基因組DNA的快速提取試劑盒，包括以下試劑：裂解液、沖洗液1、沖 洗液2、無水乙醇和純凈水，其中裂解液、沖洗液1、沖洗液2的組成分別為： (1) 裂解液：異硫氰酸酯的濃度為I. 5~2. 5 M，EDTA的濃度為30~50 mM，鹽酸胍的濃度 為15~35 mM，十二烷基氨基酸的濃度為10~30 mM ; (2) 沖洗液1 :濃度為65~85 mM的Tris-HCl，體積比75%的乙醇，pH 7. 0 ; (3) 沖洗液2 :濃度為1~3 mM的Tris-HCl，體積比80%的乙醇，pH 7. 5。
[0009] 所述的用于動物組織基因組DNA快速提取試劑盒中： (1) 裂解液：異硫氰酸酯的濃度為2 M，EDTA的濃度為40禮，鹽酸胍的濃度為25禮， 十二烷基氨基酸的濃度為20 mM ; (2) 沖洗液1 :濃度為75 mM的Tris-HCl，體積比75%的乙醇，pH 7. 0 ; (3) 沖洗液2 :濃度為2 mM的Tris-HCl，體積比80%的乙醇，pH 7. 5。
[0010] 利用所述的DNA快速提取試劑盒提取動物組織基因組的方法，包括以下步驟： (1)將固體狀的動物組織先進行研磨處理，液體狀的動物組織直接用于提??； (1) 取液體狀的動物組織20 μ 1~100 μ 1，或取研磨后成糊狀的動物組織20mg~100mg， 加500 μL裂解液，70°C水浴3-5 min，12000 rpm 30 S，分離出上清液； (2) 將上清液轉(zhuǎn)入離心管中，加500 μ 1無水乙醇，分次轉(zhuǎn)到DNA純化柱上，12000 rpm 離心30 S ;得到粗提的DNA，倒掉收集管中的廢液； (3) 用500 μ 1沖洗液1沖洗純化柱，12000 rpm離心30 S，倒掉收集管中的廢液； (4) 用600 μ 1沖洗液2沖洗純化柱，12000 rpm離心30 S，倒掉收集管中的廢液； (5) 用500 μ 1沖洗液2沖洗純化柱，12000 rpm離心30 S，倒掉收集管中的廢液； (6) 再次12000 rpm離心30 S，去除殘留在純化柱上的沖洗液； (7) 將DNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離心管，加50 μ 1純凈水，12000 rpm離心30 S，即可得到 病毒及組織基因組的DNA，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0011] 所述固體狀的動物組織為心臟、肝臟、肺臟、脾臟或腎臟；所述液體狀的動物組織 為全血、血漿、血清或動物分泌物； 所述的試劑盒在用于動物組織基因組DNA快速提取中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的積極有益效果： 本發(fā)明的動物組織基因組DNA快速提取試劑盒，可以快速提取動物組織的DNA，用于動 物病原菌的快速診斷，又可以用于分子遺傳學(xué)研宄、臨床基因診斷及動物疾病診斷。本發(fā)明 亦的試劑盒可以用于其他同類組織DNA的提取和病原菌的診斷。
[0013] 本試劑盒的樣品經(jīng)過裂解后，基因組DNA被吸附在DNA吸附柱上，然后用純凈水沖 洗即可得到全基因組DNA。操作簡便、省工省時，整個提取過程只需6分鐘，可以滿足樣品較 多和快速提取DNA的需求，為動物病原菌快速診斷和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持和理 論基礎(chǔ)。
[0014] 本發(fā)明的試劑盒用于提取動物組織(如心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟)、全血、血漿、 血清和動物分泌物(乳液、鼻液）的基因組DNA，此基因組DNA可用于RT-PCR反應(yīng)，RAPD、 AFLP、RFLP及病毒基因組擴增。
[0015] 本發(fā)明適用于所有科研單位、臨床病原檢測、分子遺傳學(xué)研宄、臨床基因診斷及動 物疾病診斷和疾病控制中心使用，具有廣闊的市場前景和較好的經(jīng)濟效益。
[0016] 說明書附圖 圖I :1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA的電泳圖。
[0017] 泳道M為DNA Marker，條帶大小自上而下分別為2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp,250 bp,100 bp〇
[0018] 泳道I為使用該試劑盒提取心臟組織基因組的電泳圖。
[0019] 泳道2為使用該試劑盒提取肝臟組織基因組的電泳圖。
[0020] 泳道3為使用該試劑盒提取肺臟組織基因組的電泳圖。
[0021] 泳道4為使用該試劑盒提取脾臟組織基因組的電泳圖。
[0022] 泳道5為使用該試劑盒提取腎臟組織基因組的電泳圖。
[0023] 泳道6為使用該試劑盒提取全血基因組的電泳圖。
[0024] 泳道7為使用該試劑盒提取血漿基因組的電泳圖。
[0025] 泳道8為使用該試劑盒提取血清基因組的電泳圖。
[0026] 泳道9為使用該試劑盒提取乳液基因組的電泳圖。
【具體實施方式】
[0027] 實施例1:一種用于動物組織基因組DNA快速提取試劑盒及提取方法 試劑盒試劑：包括裂解液、沖洗液1、沖洗液2、無水乙醇和純凈水。
[0028] 各試劑成分： (1) 裂解液：異硫氰酸酯的濃度為2 M (mol/L)，EDTA的濃度為40 mM (mmol/L)，鹽酸 胍的濃度為25 mM