一種經(jīng)基因工程改造金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶及制 備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是一種重要的人獸共患病原菌，可以 引起傷口感染、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、中毒性休克綜合征等多種疾病，在奶牛場(chǎng)金黃色葡萄球 菌引發(fā)的奶牛乳房炎疾病發(fā)病率高達(dá)35-59%，極大地影響了我國(guó)奶牛的產(chǎn)奶量、所產(chǎn)牛奶 的品質(zhì)、奶牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益甚至我國(guó)牛奶質(zhì)量在國(guó)際上的競(jìng)爭(zhēng)力和聲譽(yù)。
[0003] 目前，金葡菌感染引發(fā)的奶牛乳房炎主要通過(guò)1)抗生素掛水全身注射、乳房注射 或灌注、乳頭浸潤(rùn)等方式，和2)金葡菌疫苗免疫，3)中草藥使用等方法控制和治療，雖然抗 生素能夠在一定程度上抑制了金黃色葡萄球菌引起的細(xì)菌感染，但抗生素的長(zhǎng)期使用帶來(lái) 了世界范圍內(nèi)不可逆轉(zhuǎn)的致病菌耐藥性的危害。這種危害不僅導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且 對(duì)人類(lèi)造成嚴(yán)重的健康威脅，主要包括兩方面：第一，抗生素的使用導(dǎo)致多年來(lái)不斷產(chǎn)生多 重耐藥金葡菌，如耐甲氧西林金葡菌（methicillin-resistant S. aureus，MRSA)和耐萬(wàn)古 霉素金葡菌（vancomycin-resistant S. aureus，VRSA)，而這些耐藥菌的出現(xiàn)又使得急切需 要研發(fā)新型抗菌藥物。而新型抗生素的出現(xiàn)又會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生更耐藥更難以防治的金葡菌，從 而形成了惡性循環(huán)。第二，因治療金葡菌感染所導(dǎo)致的牛奶中的抗生素殘留，帶來(lái)了嚴(yán)重的 食品安全隱患，間接危害了人類(lèi)的健康。因此，研發(fā)新型的抗菌藥物成為迫在眉睫的社會(huì)需 要和各國(guó)科學(xué)家的研宄熱點(diǎn)。
[0004] 噬菌體作為細(xì)菌專(zhuān)性寄生病毒，分為裂解性噬菌體和溶源性噬菌體，其中裂解性 噬菌體可以通過(guò)吸附、注入基因組、重新組裝病毒顆粒、裂解細(xì)菌釋放子代噬菌體病毒顆粒 完成一個(gè)病毒更新周期，同時(shí)達(dá)到將細(xì)菌裂解成碎片的目的。
[0005] 早在1915年發(fā)現(xiàn)噬菌體以來(lái)，噬菌體已經(jīng)被蘇聯(lián)、德國(guó)軍隊(duì)等用于治療士兵的痢 疾、傷口感染等的治療，并取得了較好的治療效果。近期，由于細(xì)菌耐藥菌以及超級(jí)細(xì)菌的 出現(xiàn)，噬菌體因其能裂解細(xì)菌的特性又被各國(guó)科學(xué)家們重新關(guān)注、并認(rèn)為是一種潛在的新 型抗菌藥物而成為研宄熱點(diǎn)。2007年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了李斯特菌噬菌體制劑用于禽肉和芝 士的保藏殺菌，2014年新西蘭政府批準(zhǔn)了大腸桿菌0157噬菌體用于屠宰前奶牛的凈化殺 菌。
[0006] 當(dāng)前，也有一些科學(xué)家認(rèn)為噬菌體作為活體病毒，用于細(xì)菌控制和治療添加于食 品中有一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，現(xiàn)在許多科學(xué)家轉(zhuǎn)向開(kāi)始將噬菌體中表達(dá)裂解酶的基因進(jìn)行重 組表達(dá)安全性較高的裂解酶用于細(xì)菌性疾病的治療和細(xì)菌性污染的控制。
[0007] 噬菌體裂解酶（Bacteriophage Iysin)是由雙鏈DNA噬菌體基因組編碼并在噬菌 體感染細(xì)菌后期表達(dá)的一類(lèi)細(xì)胞壁蛋白水解酶，能夠直接破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖從而使 細(xì)菌裂解。一般認(rèn)為，裂解酶具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即位于N端的具有裂解功能的結(jié)構(gòu)域和位于 C端的決定宿主特異性的結(jié)構(gòu)域。
[0008] 近年來(lái)的研宄表明，對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌，噬菌體的裂解酶能夠識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁受 體、并裂解細(xì)菌。噬菌體裂解酶作為一種新型安全的抗菌藥物具有高效快速、裂解譜廣、安 全性高、很難產(chǎn)生抗性菌、能夠有效裂解多重耐藥菌等優(yōu)點(diǎn)，得到越來(lái)越多的重視。國(guó)內(nèi)外 越來(lái)越多的體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)表明裂解酶具有很高的殺菌性、較之噬菌體具有更廣的裂解譜和 難產(chǎn)生抗性菌、對(duì)耐藥性致病菌的裂解性和其他抗菌劑協(xié)同作用的高效性，并且由體內(nèi)使 用裂解酶導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體沒(méi)有影響裂解酶的作用。因此該研宄有望將金黃色葡萄 球菌噬菌體裂解酶研發(fā)成為一種防治由金黃色葡萄球菌感染引起的疾病和控制動(dòng)物源性 食品中金葡菌的新型抗菌制劑。
[0009] 目前，關(guān)于對(duì)金葡菌有殺滅或裂解作用的噬菌體裂解酶報(bào)道不多，本實(shí)驗(yàn)室成員 張輝申報(bào)的專(zhuān)利（ZL201210157894.6)是一種來(lái)自于天然金葡菌噬菌體的裂解酶基因，未 經(jīng)過(guò)改造和重組，與本發(fā)明的噬菌體裂解酶LysSl核酸序列和氨基酸序列也不同，是兩種 不同的裂解酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶。
[0011] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供上述金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的制備方 法。
[0012] 本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供上述金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的應(yīng)用
[0013] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0014] 一種經(jīng)基因工程改造的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶，該金黃色葡萄球菌噬菌體 裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO :1。
[0015] 一種經(jīng)基因工程改造的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的編碼基因，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO : 2 所示。
[0016] 包含上述的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的編碼基因的質(zhì)粒也在本發(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。
[0017] 包含上述的質(zhì)粒的重組菌也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0018] 一種金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的制備方法，該方法包括如下步驟：
[0019] (1)將SEQ ID NO :2所示核苷酸序列克隆到表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒；
[0020] (2)將步驟（1)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，得到重組菌；
[0021] (3)利用重組菌表達(dá)金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶；
[0022] (4)純化步驟（3)得到的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶。
[0023] 步驟（1)中，所述的表達(dá)載體為pET32b (+)。
[0024] 步驟（2)中，所述的宿主菌為大腸桿菌TransB (DE3)。
[0025] 步驟（3)中，利用IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶，IPTG的濃 度為I. 0~I. 2mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)的溫度為20~26°C。
[0026] 利用重組菌產(chǎn)金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的具體方法如下：
[0027] 將SEQ ID NO :2所示核苷酸序列克隆到pET32b(+)質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒命名 為：pET32b-LysSl，將pET32b-LysSl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TransB (DE3)，得到的重組菌命名為 TransB(pET32b_LysSl)。
[0028] 將重組菌TransB (pET32b-LysSl)接種到含氨芐青霉素（50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)液 中，37°C振蕩培養(yǎng)12h ;按體積比為1 %轉(zhuǎn)接至IOOmL LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6cJ直 約為0. 5時(shí)，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，26°C誘導(dǎo)20h。收集菌體，超聲波破碎細(xì)胞，收 集上清上清用His親和層析鎳柱純化。將純化的裂解酶產(chǎn)物經(jīng)去毒素試劑盒進(jìn)行去毒處理 (彡0· OlEU/ μ g內(nèi)毒素）。
[0029] 上述金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的制備方法制備得到的金黃色葡萄球菌噬菌 體裂解酶在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0030] 上述金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶在制備抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的藥物中的 應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0031] 上述金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶在制備防治奶牛乳房炎藥物中的應(yīng)用在本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0032] 上述金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶在制備奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)防疫藥物中的應(yīng)用。
[0033] 上述金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶在抑制食品中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)中的應(yīng)用， 本發(fā)明制備的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶可以抑制牛奶中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)。
[0034] 有益效果：
[0035] (1)本發(fā)明將金黃色葡萄球菌裂解酶克隆到pET32M+)質(zhì)粒中，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌中，進(jìn)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)制備得到金黃色葡萄球菌裂解酶。
[0036] (2)本發(fā)明制備的金黃色葡萄球菌裂解酶對(duì)多種金黃色葡萄球菌具有裂解作用。
【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1裂解酶LysSl基因的構(gòu)建和鑒定；其中，泳道1~5為重組表達(dá)質(zhì)粒 pET32b-LysSlNde I/Xho I雙酶切鑒定，泳道6為空質(zhì)粒對(duì)照pET32b(+)Nde I/Xho I雙酶 切鑒定，Ml 為 2Kb DNA ladder，Mr 為 15Kb DNA ladder。
[0038] 圖2重組裂解酶LysSl表達(dá)產(chǎn)物的鑒定分析；泳道1為純化的重組裂解 酶LysSl，泳道2為誘導(dǎo)表達(dá)TransB(pET32b) 1.0 mmol/L IPTG，泳道3為誘導(dǎo)表達(dá) TransB (pET32b-LysSl) I. 0mmol/L IPTG，M 為蛋白分子質(zhì)量 Marker。
[0039] 圖3重組裂解酶LysSl對(duì)金黃色葡萄球菌的裂解活性分析;A :金黃色葡萄球菌 X12外滴加重組裂解酶LysSl和空載體pET32b (+)對(duì)照，B :金黃色葡萄球菌S6菌外滴加重 組裂解酶LysSl和空載體pET32b (+)對(duì)照。
[0040] 圖4重組裂解酶LysSl對(duì)金黃