一種檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒及其檢測方法。所述包括用于檢測的基因芯片和檢測體系，其中，所述基因芯片包括工作電極、參比電極和輔助電極，所述工作電極上標(biāo)記有捕獲探針；所述檢測體系包括相互獨(dú)立的DNA提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物酶液、雜交液、檢測液、空白對照、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。
【專利說明】
一種檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒 及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 尿路感染又稱泌尿系感染，是病原微生物引起的腎臟、輸尿管、膀胱和尿道等泌尿 系統(tǒng)各個(gè)部位感染的總稱。尿路感染是常見的感染性疾病，全世界每年發(fā)生尿路感染近1.5 億人次，40 %~50 %女性一生中發(fā)生過尿路感染。在我國發(fā)生的院內(nèi)感染中9.4 %~50 %來 自尿路感染。嚴(yán)重的尿路感染，如復(fù)雜性尿路感染和腎盂腎炎易引起膿毒癥，甚至引起感染 性休克。
[0003] 目前我國臨床檢測方法仍以尿培養(yǎng)為主，但由于其送檢周期長，各醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室水 平、能力不足、檢測結(jié)果和臨床一致性不高等缺陷，導(dǎo)致臨床醫(yī)生的送檢意識較為淡薄，很 多情況下的診療多停留在經(jīng)驗(yàn)用藥的層面上，而非基于病原診斷的基礎(chǔ)上，此種用藥模式 一定程度上導(dǎo)致了抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致了細(xì)菌變異事態(tài)愈發(fā)嚴(yán)峻，繼而對抗菌藥 物耐藥的菌株大幅增加和散播。據(jù)統(tǒng)計(jì)，亞太地區(qū)2012年社區(qū)獲得性單純性尿路感染對喹 諾酮類藥物耐藥性最高可達(dá)69%，復(fù)雜性尿路感染高達(dá)98% ; 2011年我國12家醫(yī)院多中心 調(diào)查發(fā)現(xiàn)來自尿液的大腸埃希菌對喹諾酮和第三代頭孢菌素的耐藥率分別為49.4%和 57.5%。
[0004] 快速的臨床微生物診斷方法可對感染性疾病做出快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷確診依 據(jù)，為臨床醫(yī)生提供治療、預(yù)防建議和咨詢服務(wù)；同時(shí)可檢測和預(yù)警感染的爆發(fā)，確定爆發(fā) 的來源并及時(shí)控制其播散、提供藥敏檢測數(shù)據(jù)，為臨床經(jīng)驗(yàn)用藥提供指導(dǎo)。因此，亟待開發(fā) 一種能夠快速、準(zhǔn)確做出病原學(xué)診斷的檢測手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，旨在解決現(xiàn) 有尿路感染致病菌的檢測存在的上述一些列問題。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測尿路感染致病菌的方法。
[0007] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，包括用于檢 測的基因芯片和檢測體系，其中，所述基因芯片包括工作電極、參比電極和輔助電極，所述 工作電極上標(biāo)記有捕獲探針；所述檢測體系包括相互獨(dú)立的DNA提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、 PCR產(chǎn)物酶液、雜交液、檢測液、空白對照、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。
[0008] 以及，一種檢測尿路感染致病菌的方法，采用上述檢測尿路感染致病菌的基因芯 片試劑盒進(jìn)行檢測，檢測方法包括以下步驟：
[0009] 提供待檢離體尿液樣品，采用所述DNA提取液進(jìn)行提取，獲得樣本DNA;
[0010]將所述樣本DNA加入PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)設(shè)置平行的陰 性對照、陽性對照和空白對照；
[0011] 將所述擴(kuò)增產(chǎn)物加入PCR產(chǎn)物酶中進(jìn)行酶解；
[0012] 將所述雜交液加入到酶解后的所述PCR產(chǎn)物中混合處理得到混合液，將所述混合 液滴加到基因芯片工作電極上進(jìn)行孵育；
[0013] 檢測所述基因芯片的電極信號。
[0014] 本發(fā)明提供的檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，可同時(shí)適用于尿液樣品中 大腸埃希菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、無乳鏈球菌、屎腸球菌、奇異變形桿 菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、咽峽炎鏈球菌、溶血葡萄球菌、摩氏摩根菌、金黃色葡萄 球菌、陰溝腸桿菌、克氏檸檬酸桿菌、魯氏不動(dòng)桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)氣腸桿菌、惡臭假單胞 菌、弗氏檸檬酸桿菌的快速檢測，且準(zhǔn)確性高，對于檢測和預(yù)警感染的爆發(fā)，確定爆發(fā)的來 源并及時(shí)控制其播散、提供藥敏檢測數(shù)據(jù)，為臨床經(jīng)驗(yàn)用藥具有積極的指導(dǎo)意義。此外，本 發(fā)明提供的檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，檢測靈敏度高，特異性好，可用于實(shí)現(xiàn) 尿路感染致病菌的高通量快速診斷。
[0015] 本發(fā)明提供的檢測尿路感染致病菌的方法，通過一對16s rRNA基因的通用寡核苷 酸的特異性引物進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增，獲得多重16s rRNA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物;通過固定在工作電 極表面的特異性捕獲探針來捕獲PCR多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物;特異性捕獲探針與PCR產(chǎn)物特異性結(jié) 合，再與其各自的特異性信號探針結(jié)合，進(jìn)而通過電化學(xué)交流伏安法(ACV)的檢測產(chǎn)生電流 變化，通過比較電流值，從而達(dá)到快速檢測靶多核苷酸的目的，進(jìn)而推斷尿樣中致病微生物 的種類，為臨床用藥提供指導(dǎo)。
【附圖說明】
[0016] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒的基因芯片陣 列不意圖；
[0017] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的基因芯片雜交的空白對照檢測結(jié)果圖；
[0018] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的基因芯片雜交的陽性樣本檢測結(jié)果圖；
[0019] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的基因芯片雜交的陰性質(zhì)控品檢測結(jié)果圖；
[0020] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的基因芯片雜交的陽性質(zhì)控品檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋 本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0022] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，包括用于檢測 的基因芯片和檢測體系，其中，所述基因芯片包括工作電極、參比電極和輔助電極，所述工 作電極上標(biāo)記有捕獲探針;所述檢測體系包括相互獨(dú)立的DNA提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、PCR 產(chǎn)物酶液、雜交液、檢測液、空白對照、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。
[0023] 本發(fā)明實(shí)施例中，所述基因芯片是檢測試劑盒的關(guān)鍵組成部分，用于捕獲經(jīng)過PCR 擴(kuò)增、酶解并標(biāo)記有信號標(biāo)記物的待測基因液中的特異性基因，進(jìn)而通過檢測雜交后基因 芯片的電化學(xué)信號、判別待測樣品中是否含有對應(yīng)的尿路感染致病菌。具體的，結(jié)合附圖1， 所述基因芯片包括固相載體和固定在所述固相載體上的電極，所述電極包括工作電極(W)、 參比電極(R)和輔助電極(C)，其中，所述工作電極上標(biāo)記有寡核苷酸探針即捕獲探針（圓所 示部分）。
[0024] 本發(fā)明實(shí)施例中，所述參比電極和輔助電極均設(shè)置一個(gè)。所述工作電極可根據(jù)待 檢測樣本中可能出現(xiàn)的、或需要檢測的不同致病菌的數(shù)目進(jìn)行調(diào)控。本發(fā)明實(shí)施例所述檢 測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒可用于尿液樣品中大腸埃希菌、糞腸球菌、銅綠假單 胞菌、肺炎克雷伯菌、無乳鏈球菌、屎腸球菌、奇異變形桿菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、 咽峽炎鏈球菌、溶血葡萄球菌、摩氏摩根菌、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、克氏檸檬酸桿 菌、魯氏不動(dòng)桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)氣腸桿菌、惡臭假單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌20種樣品中的 至少一種的檢測，也可同時(shí)用于上述樣品的檢測。因此，作為優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明實(shí)施例所 述基因芯片包括4個(gè)以上工作電極，當(dāng)所述工作電極為4個(gè)時(shí)，依次為標(biāo)記有陽性對照捕獲 探針、陰性對照捕獲探針、空白對照捕獲探針和上述一種病原菌捕獲探針的工作電極。當(dāng) 然，所述工作電極的數(shù)量可進(jìn)行調(diào)整。進(jìn)一步優(yōu)選的，為了獲得更加清晰可靠的檢測結(jié)果， 每種所述捕獲探針均分別標(biāo)記在2個(gè)工作電極上，即形成兩組平行測試。更進(jìn)一步優(yōu)選的， 所述工作電極的數(shù)量4-40個(gè)。作為具體優(yōu)選實(shí)施例，所述工作電極的數(shù)量40個(gè)，分別包括下 述20種捕獲探針標(biāo)記的工作電極各2個(gè)，如附圖1所示，40個(gè)工作電極依次編號為W1-W40。
[0025] 作為具體實(shí)施例，所述捕獲探針包括大腸埃希菌捕獲探針、糞腸球菌捕獲探針、銅 綠假單胞菌捕獲探針、肺炎克雷伯菌捕獲探針、無乳鏈球菌捕獲探針、屎腸球菌捕獲探針、 奇異變形桿菌捕獲探針、表皮葡萄球菌捕獲探針、鮑曼不動(dòng)桿菌捕獲探針、咽峽炎鏈球菌捕 獲探針、溶血葡萄球菌捕獲探針、摩氏摩根菌捕獲探針、金黃色葡萄球菌捕獲探針、陰溝腸 桿菌捕獲探針、克氏朽 1彳冡酸桿菌捕獲探針、魯氏不動(dòng)桿菌捕獲探針、粘質(zhì)沙雷菌捕獲探針、 產(chǎn)氣腸桿菌捕獲探針、惡臭假單胞菌捕獲探針、弗氏檸檬酸桿菌捕獲探針中的至少一種和 陽性對照捕獲探針、陰性對照捕獲探針、空白對照捕獲探針，且各捕獲探針的序列如下所 示：
[0026] 大腸桿菌捕獲探針CPI: 5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ；
[0027] 糞腸球菌捕獲探針CP2:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ；
[0028] 銅綠假單胞菌捕獲探針CP3:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ；
[0029] 肺炎克雷伯菌捕獲探針CP4:5 ' -TCGATGAGGTTATTAACCTTACG-3 ' ；
[0030]無乳鏈球菌捕獲探針CP5:5 ' -CACAGTGAAGCAATTGCTCCTTTTA-3 ' ；
[0031] 屎腸球菌捕獲探針CP6:5 ' -AAGGGATGAACAGTTACTCTCATC-3 ' ；
[0032] 奇異變形桿菌捕獲探針CP7:5' -TTCATCCGATAGTGCAAGGTCCGAA-3' ；
[0033] 咽峽炎鏈球菌捕獲探針CP8:
[0034] 5 '-CTACTAGCGATGCAATTGCATCTTTC-3 '；
[0035]結(jié)核桿菌捕獲探針CP9:
[0036] 5 '-GGTCCTATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAG-3 '；
[0037] 奴卡菌捕獲探針CP10:5 ' -GAGATACAGGGTCAITTAGTTGGTGGGT-3 ' ；
[0038]糞腸球菌、屎腸球菌捕獲探針CP11:
[0039] 5 '-AAACAGCAAGGTATTAACTTACT-3 '；
[0040] 銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌捕獲探針CP12:
[0041 ] 5 '-GGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGA-3 '；
[0042] 無乳鏈球菌、咽峽炎鏈球菌捕獲探針CPI 3:
[0043] 5，-CGAGTCGCAAGCCGGTGACGGCA-3,；
[0044] 表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌捕獲探針CP14:
[0045] 5 '-AAGACGTGCATAGTTACTTACACATATGTTC-3 '；
[0046] 鮑曼不動(dòng)桿菌、魯氏不動(dòng)桿菌捕獲探針CP15:
[0047] 5 '-ATCCCTTTCGAGATGTTGTCCC-3 '；
[0048] 腸桿菌通檢捕獲探針CP16:5 ' -AGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAA-3 ' ；
[0049] 細(xì)菌通檢捕獲探針CP17:
[0050] 5 '-GATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTG-3 '；
[0051 ]陽性對照捕獲探針CP18:5'-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3' ；
[0052] 陰性對照捕獲探針CP19:5'-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3' ；
[0053] 空白對照捕獲探針CP20:5' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3'，如附圖 1所示。
[0054]該優(yōu)選的所述捕獲探針的特異性強(qiáng)，捕獲靈敏度高，因此，能夠提高檢測試劑盒的 檢測效率和檢測結(jié)果的可靠性。
[0055]作為一個(gè)具體優(yōu)選實(shí)施例，所述基因芯片包括40個(gè)工作電極、1個(gè)參比電極和1個(gè) 輔助電極，其中，所述工作電極上分別標(biāo)記了上述20種捕獲探針，且每種所述捕獲探針分別 標(biāo)記在2個(gè)所述工作電極上。
[0056]由于碳電極等通常需要經(jīng)過預(yù)處理后方能進(jìn)行檢測使用，本發(fā)明實(shí)施例中，所述 工作電極、參比電極和輔助電極均優(yōu)選為金電極。所述金電極不需要經(jīng)過預(yù)處理步驟，且經(jīng) 過實(shí)驗(yàn)證明，用于本發(fā)明實(shí)施例的可靠性強(qiáng)。進(jìn)一步的，本發(fā)明實(shí)施例所述捕獲探針的3'段 均有巰基修飾，該優(yōu)選的所述捕獲探針，可以更有效地與所述金電極偶聯(lián)固定。
[0057]本發(fā)明實(shí)施例中，所述檢測體系包括相互獨(dú)立的DNA提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、PCR 產(chǎn)物酶液、雜交液、檢測液、空白對照、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。本發(fā)明實(shí)施例所指相互獨(dú) 立是指各樣品均可獨(dú)立取出，不互相混合，可采用隔開的方式進(jìn)行歸置，也可以采用相互獨(dú) 立封裝的試劑瓶或管進(jìn)行歸置，具體方法不受限制，只需滿足能夠各樣品不混合、且能獨(dú)立 取出即可。
[0058] 作為優(yōu)選實(shí)施例，所述DNA提取液包括似0!1、1^8-?：1、了￥6611-20、即-40 40了八和 chelex-100。具體的，所述DNA提取液包括50mM/L Na0H、10mM/L Tris-HCl pH 8·0、0·5% Tween-20、0·5 % NP-40、0·5mM EDTA和5 % che1ex-100 〇
[0059] 本發(fā)明實(shí)施例中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中含有用于16s rRNA基因擴(kuò)增的寡核苷酸 引物。由于本發(fā)明實(shí)施例可檢測到的尿路感染致病菌可能含有多種，因此，為了提高效率 PCR擴(kuò)增和簡化測試操作步驟，所述引物為根據(jù)細(xì)菌16s rRNA基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成的、可 用于16s rRNA基因擴(kuò)增的通用寡核苷酸的特異性引物。具體優(yōu)選的，所述引物的序列如下：
[0060] F:5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '；
[0061 ] R:5 '-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 '。
[0062] 所述引物的濃度均為0.2mmol/L
[0063] 此外，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液還包括PCR buffer、dNTP、酶。
[0064] 本發(fā)明實(shí)施例中，所述雜交液中包括用于靶多核苷酸檢測的信號探針，所述信號 探針包括下述至少一種：
[0065] 大腸桿菌信號探針DPI: 5 ' -CTTCCTCCCCGCTGAAAGTACTTTAC-3 ' ；
[0066] 糞腸球菌信號探針DP2:5 ' -CTTGTTCTTCCTAACAACAGAGT-3 ' ；
[0067]銅綠假單胞菌信號探針DP3:
[0068] 5 '-GAAGATCCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG-3 '；
[0069] 肺炎克雷伯菌信號探針DP4:5 ' -CCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGC-3 ' ；
[0070] 無乳鏈球菌信號探針DP5:5 ' -AATAACTAACATGTGTTAATTACTC-3 ' ；
[0071] 屎腸球菌信號探針DP6:5 ' -CTTGTTCTTCCTAACAACAGAGT-3 ' ；
[0072]奇異變形桿菌信號探針DP7:
[0073] 5 '-GAGCCCCTGCTTTGGTCCGTAGACA-3 '；
[0074] 咽峽炎鏈球菌信號探針DP8:5'-
[0075] AAGCATCTAACATGTGTTACATACTG-3 '；
[0076]結(jié)核桿菌信號探針DP9:
[0077] 5 '-AGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGT-3 '；
[0078] 奴卡菌信號探針DP10:5 ' -AAGGTTTGACATCACCCGTGGACCTGTA-3 ' ；
[0079] 糞腸球菌、屎腸球菌信號探針DP11:
[0080] 5 '-CGACACCCGAAAGCGCCTTTCA-3 '；
[0081]銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌信號探針DP12:
[0082] 5，-GCTAATCCCATAAAACCGATCGT-3,；
[0083] 無乳鏈球菌、咽峽炎鏈球菌信號探針DP13:
[0084] 5 '-AGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTC-3 '；
[0085]表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌信號探針DP14:
[0086] 5 '-TTCCCTAATAACAGAGTTTTACGATCCGAAGA-3 '；
[0087]鮑曼不動(dòng)桿菌、魯氏不動(dòng)桿菌信號探針DP15:
[0088] 5 '-CCACTAATAGGCAGATTCCTAAG-3 '；
[0089] 腸桿菌通檢信號探針DP16:5 ' -GCGGACCTCATAAAGTATGTCGTA-3 ' ；
[0090] 細(xì)菌通檢信號探針DP17:
[0091 ] 5 '-ACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA-3 '；
[0092]且所述信號探針與所述捕獲探針對應(yīng)，即所述信號探針需含有工作電極上標(biāo)記的 捕獲探針對應(yīng)的致病菌的信號探針。
[0093]該優(yōu)選的所述信號探針，與所述捕獲探針結(jié)合的特異性強(qiáng)、靈敏度高，可提高檢測 的時(shí)效性和可靠性。
[0094]作為進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施例，所述信號探針的5'段均有四個(gè)Fc(二茂鐵分子)修飾。 [0095]本發(fā)明實(shí)施例中，所述雜交液具體優(yōu)選為1.0M NaCl、0.1M檸檬酸鈉 pH值7.0的雜 交液。
[0096]本發(fā)明實(shí)施例所述PCR產(chǎn)物酶液優(yōu)選包括核酸外切酶m和核酸外切酶buffer(緩 沖液）。具體的，所述PCR產(chǎn)物酶液中含有50U核酸外切酶m和2.5倍的核酸外切酶buffer。所 述核酸外切酶ΙΠ 和核酸外切酶buffer均可購于Takara公司。
[0097] 作為一個(gè)具體優(yōu)選實(shí)施例，所述檢測液為1M NaCKkpH 7.0。
[0098]作為一個(gè)具體優(yōu)選實(shí)施例，所述空白對照為雙蒸水。
[0099] 作為一個(gè)具體優(yōu)選實(shí)施例，所述陽性質(zhì)控品為lOOng/ul的大腸桿菌基因組DNA。
[0100] 作為一個(gè)具體優(yōu)選實(shí)施例，所述陰性質(zhì)控品為lOOng/ul的酵母菌基因組DNA。
[0101] 本發(fā)明實(shí)施例利用16s rRNA基因的通用寡核苷酸特異性引物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得 擴(kuò)增產(chǎn)物;并將設(shè)計(jì)的針對不同致病菌16s rRNA基因的特異性捕獲探針分別固定在特制的 印刷電路板金電極表面，制備成電化學(xué)傳感器，用于捕獲PCR多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物;特異性捕獲探 針與PCR產(chǎn)物特異性結(jié)合，再與其特異性信號探針結(jié)合;通過電化學(xué)交流伏安法(ACV)的檢 測產(chǎn)生電流變化，通過比較電流值，從而達(dá)到快速檢測靶多核苷酸的目的，進(jìn)而推斷尿樣中 致病微生物的種類，為臨床用藥提供指導(dǎo)。本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測尿路感染致病菌的基 因芯片試劑盒，可同時(shí)適用于尿液樣品中大腸埃希菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷 伯菌、無乳鏈球菌、屎腸球菌、奇異變形桿菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、咽峽炎鏈球菌、 溶血葡萄球菌、摩氏摩根菌、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、克氏檸檬酸桿菌、魯氏不動(dòng)桿 菌、粘質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)氣腸桿菌、惡臭假單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌的快速檢測，且準(zhǔn)確性高，對 于檢測和預(yù)警感染的爆發(fā)，確定爆發(fā)的來源并及時(shí)控制其播散、提供藥敏檢測數(shù)據(jù)，為臨床 經(jīng)驗(yàn)用藥具有積極的指導(dǎo)意義。此外，本發(fā)明提供的檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑 盒，檢測靈敏度高，特異性好，可用于實(shí)現(xiàn)尿路感染致病菌的高通量快速診斷。
[0102] 以及，本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種檢測尿路感染致病菌的方法，采用上述檢測尿 路感染致病菌的基因芯片試劑盒進(jìn)行檢測，檢測方法包括以下步驟：
[0103] S01.提供待檢離體尿液樣品，采用所述DNA提取液進(jìn)行提取，獲得樣本DNA;
[0104] S02.將所述樣本DNA加入PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)設(shè)置平行 的陰性對照、陽性對照和空白對照；
[0105] S03.將所述擴(kuò)增產(chǎn)物加入PCR產(chǎn)物酶中進(jìn)行酶解；
[0106] S04.將所述雜交液加入到酶解后的所述PCR產(chǎn)物中混合處理得到混合液，將所述 混合液滴加到基因芯片工作電極上進(jìn)行孵育；
[0107] S05.檢測所述基因芯片的電極信號。
[0108] 具體的，上述步驟S01中，具體的，將所述提供待檢離體尿液樣品進(jìn)行處理獲得樣 本DNA，包括以下步驟：
[0109] 將收集到的臨床尿液樣品進(jìn)行離心處理；
[0110] 傾去上清，加入DNA提取液，混勻，水浴處理；
[0111] 水浴后再次離心；
[0112] 收集上清，上清中即含有基因組DNA，即可用于PCR擴(kuò)增或_20°C保存。
[0113] 上述步驟S02中，所述PCR反應(yīng)液中的引物為根據(jù)細(xì)菌16s rRNA基因保守區(qū)域設(shè)計(jì) 并合成用于16s rRNA基因擴(kuò)增的引物。
[0114] 所述樣本DNA和所述引物混合，對待側(cè)樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。優(yōu)選的，所述 PCR擴(kuò)增的條件為：
[0115] 98〇Ca5s；
[0116] 98°C，10s; 54Γ，5s; 72Γ，90s，30個(gè)循環(huán)；
[0117] 72°C，5min。
[0118] 所述陰性對照、陽性對照和空白對照的操作方法同上，即同時(shí)設(shè)置平行的陰性對 照、陽性對照和空白對照。
[0119] 上述步驟S03中，將所述擴(kuò)增產(chǎn)物加入PCR產(chǎn)物酶中進(jìn)行水浴酶解，獲得單鏈DNA。
[0120] 上述步驟S04中，將S03步驟中獲得的單鏈DNA與所述雜交液混合，單鏈DNA與所述 雜交液中的信號探針雜交;將得到的混合物滴于試劑盒中提供的基因芯片工作電極上進(jìn)行 孵育雜交，則所述基因芯片上的捕獲探針特異性地捕獲雜交后的單鏈DNA。
[0121] 上述步驟S05中，雜交后的所述基因芯片用電化學(xué)工作站掃描，獲取雜交信號并分 析雜交結(jié)果。
[0122] 本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測尿路感染致病菌的方法，通過一對16s rRNA基因的通用 寡核苷酸的特異性引物進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增，獲得多重16s rRNA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物;通過固定在 工作電極表面的特異性捕獲探針來捕獲PCR多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物;特異性捕獲探針與PCR產(chǎn)物特異 性結(jié)合，再與其各自的特異性信號探針結(jié)合，進(jìn)而通過電化學(xué)交流伏安法的檢測產(chǎn)生電流 變化，通過比較電流值，從而達(dá)到快速檢測靶多核苷酸的目的，進(jìn)而推斷尿樣中致病微生物 的種類，為臨床用藥提供指導(dǎo)。
[0123] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行說明。
[0124] 實(shí)施例1
[0125] -種檢測尿路感染致病菌的方法，采用本發(fā)明實(shí)施例檢測尿路感染致病菌的基因 芯片試劑盒進(jìn)行檢測，檢測方法包括以下步驟：
[0126] S11.提供待檢離體尿液樣品，采用所述DNA提取液進(jìn)行提取，獲得樣本DNA。具體 的，將所述提供待檢離體尿液樣品進(jìn)行處理獲得樣本DNA，包括以下步驟：
[0127] S111.將收集到的臨床尿液樣品13000g離心5min;
[0128] S112.傾去上清，加入50ul的DNA處理液，混勻，100°C水浴lOmin;
[0129] S113.水浴后13000g 離心 5min;
[0130] S114.收集上清，上清中即含有基因組DNA，即可用于PCR擴(kuò)增或-20°C保存。
[0131] 其中，DNA 提取液配方為：5〇111]\1/1他0!1，1〇111]\1/11^8-!1(：1?!18.0,0.5%了￥6611-20,0.5%NP-40,0.5mM EDTA，5%chelex-100。
[0132] S12.將所述樣本DNA加入PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)設(shè)置平行 的陰性對照、陽性對照和空白對照。
[0133] 具體的，取上述基因組提取方法提取的3ul上清即樣本DNA作為模板加入PCR反應(yīng) 液中，所述PCR反應(yīng)液配方如下表1所示，其中，PCR緩沖液、dNTP混合物、酶均購自Takara公 司。
[0134] 表1
[0136] 陰性對照、陽性對照及空白對照操作方法同上。
[0137] 將反應(yīng)管放入PCR儀中，設(shè)定的循環(huán)參數(shù)如下表2所示。
[0138] 表2
[0140] S13.將所述擴(kuò)增產(chǎn)物加入PCR產(chǎn)物酶中進(jìn)行酶解。具體的，取30ul上述PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物加入1支PCR產(chǎn)物酶液中，37 °C條件下水浴孵育5min后迅速轉(zhuǎn)移至65 °C水浴，孵育5min。其 中，所述PCR產(chǎn)物酶液配方如下表3所示，其緩沖液及酶均購自Takara公司：
[0141] 表3
[0144] S14.將所述雜交液加入到酶解后的所述PCR產(chǎn)物中混合處理得到混合液，將所述 混合液滴加到基因芯片工作電極上進(jìn)行孵育。
[0145] 具體的，取10ul雜交液加入酶解后的PCR產(chǎn)物中，單鏈DNA與所述雜交液中的信號 探針雜交;將得到的混合物滴于試劑盒中提供的基因芯片工作電極上，37°C孵育15min孵育 雜交，則所述基因芯片上的捕獲探針特異性地捕獲雜交后的單鏈DNA。
[0146] S15.檢測所述基因芯片的電極信號。
[0147] 將所述基因芯片的電極浸入檢測液中，使用電化學(xué)工作站PalmSens 3.0,應(yīng)用ACV 檢測目標(biāo)信號，其中，ACV參數(shù)設(shè)置如下表4所示：
[0148] 表4
[0150]本發(fā)明實(shí)施例獲得的基因芯片雜交的空白對照、陽性樣本、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì) 控品的檢測結(jié)果圖依次如圖2-5所示。
[0151]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，其特征在于，包括用于檢測的基因芯 片和檢測體系，其中，所述基因芯片包括工作電極、參比電極和輔助電極，所述工作電極上 標(biāo)記有捕獲探針;所述檢測體系包括相互獨(dú)立的DNA提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、PCR產(chǎn)物酶液、 雜交液、檢測液、空白對照、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。2. 如權(quán)利要求1所述的檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述基因 芯片包括4個(gè)以上工作電極，所述工作電極上分別標(biāo)記有捕獲探針，所述捕獲探針包括大腸 埃希菌捕獲探針、糞腸球菌捕獲探針、銅綠假單胞菌捕獲探針、肺炎克雷伯菌捕獲探針、無 乳鏈球菌捕獲探針、屎腸球菌捕獲探針、奇異變形桿菌捕獲探針、表皮葡萄球菌捕獲探針、 鮑曼不動(dòng)桿菌捕獲探針、咽峽炎鏈球菌捕獲探針、溶血葡萄球菌捕獲探針、摩氏摩根菌捕獲 探針、金黃色葡萄球菌捕獲探針、陰溝腸桿菌捕獲探針、克氏檸檬酸桿菌捕獲探針、魯氏不 動(dòng)桿菌捕獲探針、粘質(zhì)沙雷菌捕獲探針、產(chǎn)氣腸桿菌捕獲探針、惡臭假單胞菌捕獲探針、弗 氏檸檬酸桿菌捕獲探針中的至少一種和陽性對照捕獲探針、陰性對照捕獲探針、空白對照 捕獲探針，且各捕獲探針的序列如下所示： 大腸桿菌捕獲探針CPI: 5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ； 糞腸球菌捕獲探針CP2:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ； 銅綠假單胞菌捕獲探針CP3:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ； 肺炎克雷伯菌捕獲探針CP4:5 ' -TCGATGAGGTTATTAACCTTACG-3 ' ； 無乳鏈球菌捕獲探針CP5:5 ' -CACAGTGAAGCAATTGCTCCTTTTA-3 ' ； 屎腸球菌捕獲探針CP6:5 ' -AAGGGATGAACAGTTACTCTCATC-3 ' ； 奇異變形桿菌捕獲探針CP7:5 ' -TTCATCCGATAGTGCAAGGTCCGAA-3 ' ； 咽峽炎鏈球菌捕獲探針CP8: 5 '-CTACTAGCGATGCAATTGCATCTTTC-3 '； 結(jié)核桿菌捕獲探針CP9: 5 '-GGTCCTATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAG-3 '； 奴卡菌捕獲探針CP10:5 ' -GAGATACAGGGTCAITTAGTTGGTGGGT-3 ' ； 糞腸球菌、屎腸球菌捕獲探針CP11: 5 '-AAACAGCAAGGTATTAACTTACT-3 '； 銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌捕獲探針CP12: 5，-GGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGA-3，； 無乳鏈球菌、咽峽炎鏈球菌捕獲探針CP13: 5，-CGAGTCGCAAGCCGGTGACGGCA-3，； 表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌捕獲探針CP14: 5 '-AAGACGTGCATAGTTACTTACACATATGTTC-3 '； 鮑曼不動(dòng)桿菌、魯氏不動(dòng)桿菌捕獲探針CP15: 5 '-ATCCCTTTCGAGATGTTGTCCC-3 '； 腸桿菌通檢捕獲探針CP16:5 ' -AGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAA-3 ' ； 細(xì)菌通檢捕獲探針CP17: 5 '-GATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTG-3 '； 陽性對照捕獲探針CP18:5'-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3' ； 陰性對照捕獲探針CP19:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 ' ； 空白對照捕獲探針CP20:5 ' -TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3 '。3. 如權(quán)利要求2所述的檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述工作 電極、參比電極和輔助電極均為金電極，所述捕獲探針的3'段均有巰基修飾。4. 如權(quán)利要求2或3所述的檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述 捕獲探針均分別標(biāo)記在2個(gè)工作電極上。5. 如權(quán)利要求1所述的檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述PCR 擴(kuò)增反應(yīng)液中含有用于16s rRNA基因擴(kuò)增的寡核苷酸引物，所述引物的序列如下： F:5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '； R:5 '-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 '。6. 如權(quán)利要求5所述的檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述PCR 擴(kuò)增反應(yīng)液還包括PCR buffer、dNTP、酶。7. 如權(quán)利要求2所述的檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述雜交 液中包括用于靶多核苷酸檢測的信號探針，所述信號探針包括下述至少一種： 大腸桿菌信號探針DPI: 5 ' -CTTCCTCCCCGCTGAAAGTACTTTAC-3 ' ； 糞腸球菌信號探針DP2:5 ' -CTTGTTCTTCCTAACAACAGAGT-3 ' ； 銅綠假單胞菌信號探針DP3: 5，-GAAGATCCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG-3，； 肺炎克雷伯菌信號探針DP4:5 ' -CCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGC-3 ' ； 無乳鏈球菌信號探針DP5:5 ' -AATAACTAACATGTGTTAATTACTC-3 ' ； 屎腸球菌信號探針DP6:5 ' -CTTGTTCTTCCTAACAACAGAGT-3 ' ； 奇異變形桿菌信號探針DP7: 5 '-GAGCCCCTGCTTTGGTCCGTAGACA-3 '； 咽峽炎鏈球菌信號探針DP8:5 ' -AAGCATCTAACATGTGTTACATACTG-3 '； 結(jié)核桿菌信號探針DP9: 5 '-AGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGT-3 '； 奴卡菌信號探針DP10:5 ' -AAGGTTTGACATCACCCGTGGACCTGTA-3 ' ； 糞腸球菌、屎腸球菌信號探針DPI 1: 5，-CGACACCCGAAAGCGCCTTTCA-3，； 銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌信號探針DP12: 5，-GCTAATCCCATAAAACCGATCGT-3，； 無乳鏈球菌、咽峽炎鏈球菌信號探針DP13: 5'-AGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTC-3'； 表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌信號探針DP14: 5 '-TTCCCTAATAACAGAGTTTTACGATCCGAAGA-3 '； 鮑曼不動(dòng)桿菌、魯氏不動(dòng)桿菌信號探針DP15: 5，-CCACTAATAGGCAGATTCCTAAG-3，； 腸桿菌通檢信號探針DP16:5 ' -GCGGACCTCATAAAGTATGTCGTA-3 ' ； 細(xì)菌通檢信號探針DP17: 5 '-ACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA-3 '； 且所述信號探針與所述捕獲探針對應(yīng)。8. 如權(quán)利要求7所述的檢測尿路感染致病菌的基因芯片試劑盒，其特征在于，所述信號 探針的5 '段均有四個(gè)Fc修飾。9. 一種檢測尿路感染致病菌的方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求1-8任一所述檢測尿 路感染致病菌的基因芯片試劑盒進(jìn)行檢測，檢測方法包括以下步驟： 提供待檢離體尿液樣品，采用所述DNA提取液進(jìn)行提取，獲得樣本DNA; 將所述樣本DNA加入PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)設(shè)置平行的陰性對 照、陽性對照和空白對照； 將所述擴(kuò)增產(chǎn)物加入PCR產(chǎn)物酶中進(jìn)行酶解； 將所述雜交液加入到酶解后的所述PCR產(chǎn)物中混合處理得到混合液，將所述混合液滴 加到基因芯片工作電極上進(jìn)行孵育； 檢測所述基因芯片的電極信號。10. 權(quán)利要求9所述的檢測尿路感染致病菌的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的條件 為： 98。。，15s; 98 °C，10s; 54 °C，5s; 72 Γ，90s，30 個(gè)循環(huán)； 72〇C,5min〇
【文檔編號】C12Q1/14GK105969854SQ201610318778
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】李穎, 肖婧, 胡曉艷, 于洪宇, 吳宇亮, 陳汗英
【申請人】北京大學(xué)深圳醫(yī)院, 南方科技大學(xué)