一種利用超聲波處理提取河豚魚dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用超聲波處理提取河豚魚DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 動(dòng)植物材料樣品通常采用細(xì)胞裂解緩沖液（CTAB、GuSCN或SDS)在65 °C恒溫下 振蕩溫育，進(jìn)行樣品前處理，繼而提取DNA，但要想提取的DNA產(chǎn)量高質(zhì)量好，必須對動(dòng)植物 材料樣品在裂解緩沖液溫育浸泡較長時(shí)間，充分反應(yīng)，比較費(fèi)時(shí)，通常需要過夜，達(dá)不到快 速的目的。超聲波處理能改善對生物DNA提取效果，提高產(chǎn)量與純度，但在超聲波環(huán)境中以 CTAB裂解緩沖液65°C溫育提取河豚魚DNA，迄今未見報(bào)道。
[0003] 為提高DNA提取效率，在保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，縮短DNA提取時(shí)間，本發(fā)明 以河豚魚肉為實(shí)驗(yàn)材料，對影響河豚魚特異物種成分（分i B基因)檢測的主要前處理因素， DNA提取過程中的CTAB (十六烷基三甲基溴化按，hexadecyltrimethylammonium bromide) 裂解緩沖液在65 °C恒溫常規(guī)溫育與超聲波溫育處理效果進(jìn)行比較分析，以期篩選出優(yōu)化 的前處理措施，提高河豚魚物種PCR鑒別效率，并保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，為建立河豚魚物種鑒 別的快速檢測方法提供依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用超聲波處理提取河豚魚DNA的方法，發(fā)明基于超 聲波技術(shù)的應(yīng)用，建立一種應(yīng)用超聲波處理的河豚魚DNA提取方法。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種利用超聲波處理提取河豚魚DNA的方法，所述方法步驟包括如下： 1)合成引物對；所述引物對為 HT-IF :5' -TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3' ；HT-1R : 5,-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3, 。
[0006] 2)河豚魚DNA樣品中加入CTAB裂解緩沖液，在功率100%的超聲波清洗器中65 °C 恒溫溫浴處理，處理時(shí)間為5 -25 min，各處理重復(fù)3次； 3)將獲得DNA樣品用于PCR擴(kuò)增，通過PCR產(chǎn)物電泳圖譜，鑒定處理的DNA提取結(jié)果。
[0007] 步驟2)具體為：稱取100 mg樣品于2. 0 mL離心管中，加入600 μ L 2 % CTAB溶 液和蛋白酶K 15 μ L，在超聲波清洗器中溫育處理5 -25 min及在水浴鍋中65°C常規(guī)溫浴 過夜處理；在離心管中加入600 μ L三氯甲燒，13400 r ^mirT1條件下離心15 min，取上清， 加入2倍體積的0. 5 % CTAB溶液，顛倒混勾，室溫靜置約I. 5 h ;在13400 r WirT1條件下 離心25 min，取沉淀，加入400 yL NaCl溶液，沉淀溶解完全后，加入15 yL Rnase酶37 °C條件下溫浴約I. 5 h ;加入等體積的三氯甲烷、飽和酚、異戊醇混合液，顛倒數(shù)次充分混合 后，在13400 r · rnirT1條件下離心15 min，重復(fù)此操作三次；取上清，加入0. 8倍異丙醇和 1/10體積的NaAc溶液，禍旋30 s，充分混合后，在13400 r ?mirT1下離心15 min ;取沉淀， 加入400 μ L 70 %乙醇，上下顛倒使沉淀懸于溶液中，在13400 I-Iiiirr1條件下離心洗滌 沉淀10 min;經(jīng)DNA濃縮儀干燥10 min，加 pH 8.0、100 μ L TE在65 °C條件下溶解15 min，放入4 °C冰箱保存待用。
[0008] 所述的三氯甲烷：飽和酚：異戊醇體積比為25 :24 :1。
[0009] 本發(fā)明設(shè)計(jì)5個(gè)時(shí)間段的超聲波處理與常規(guī)溫育過夜（8小時(shí))處理。其中5個(gè)超 聲波處理時(shí)間依次為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，均為65 °C恒溫溫浴處理，個(gè) 處理重復(fù)3次。數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE型，500 W、40KHZ)使用功率為100%。選擇在 超聲波清洗器中溫育處理5 min，建立了省時(shí)高效的超聲波處理DNA提取方法。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：傳統(tǒng)的DNA提取過程中的樣品CTAB裂解液65 °C恒溫常規(guī) 溫浴處理時(shí)間在1-8小時(shí)，本方法利用超聲波處理65 °C溫育只需5 min，節(jié)省時(shí)間，大幅度 提尚DNA提取效率，進(jìn)而達(dá)到快速檢測的目的。
【附圖說明】
[0011] 圖1不同超聲波處理時(shí)間提取的河豚魚DNA電泳結(jié)果比較。1-5 :超聲波處理 時(shí)間依次為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min;6:經(jīng)65 °C常規(guī)溫浴過夜處理，M: DNA-Marker0
[0012] 圖2 6種處理提取的DNA河豚魚特異物種成分（Cyt B基因)PCR產(chǎn)物電泳圖。1-5 : 超聲波處理時(shí)間依次為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min;6:經(jīng)65 °C常規(guī)溫浴過夜處 理；7 :非河豚魚陰性對照；8 :空白（純水）對照；9 :DNA-Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 試劑來源與超聲波清洗器：10 X T^buffer與7^S|、dNTPs購自上海生工有限 公司。數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE型，500 W、40KHZ)購自昆山市超聲儀器有限公司。
[0014] 引物合成 由上海生工生物工程有限公司合成河豚魚成分檢測引物（HT-1)，引物堿基序列、PCR 產(chǎn)物片段長度與適合的退火溫度（^值）見下表。
[0015] 河豚魚成分的PCR檢測用的引物序列與退火溫度
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用超聲波處理提取河豚魚DNA的方法，其特征在于：所述方法步驟包括如 下： 1) 合成引物對； 2) 河豚魚DNA樣品中加入CTAB裂解緩沖液，在功率100%的超聲波清洗器中65 °C恒 溫溫浴處理，處理時(shí)間為5 -25 min，各處理重復(fù)3次； 3) 將獲得DNA樣品用于PCR擴(kuò)增，通過PCR產(chǎn)物電泳圖譜，鑒定處理的DNA提取結(jié)果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用超聲波處理提取河豚魚DNA的方法，其特征在于： 所述引物對為HT-IF:5'-TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3'；HT-lR: 5,-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3, 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用超聲波處理提取河豚魚DNA的方法，其特征在于： 步驟2)具體為：稱取100 mg樣品于2.0 mL離心管中，加入600 yL 2 % CTAB溶液和 蛋白酶K 15 yL，在超聲波清洗器中溫育處理5 -25 min及在水浴鍋中65°C常規(guī)溫浴過夜 處理；在離心管中加入600 y L三氯甲燒，13400 r ^mirT1條件下離心15 min，取上清，加入 2倍體積的0. 5 % CTAB溶液，顛倒混勻，室溫靜置約I. 5 h ;在13400 r ? HiirT1條件下離心 25 min，取沉淀，加入400 yL NaCl溶液，沉淀溶解完全后，加入15 yL Rnase酶37 °C條 件下溫浴約1.5 h;加入等體積的三氯甲烷、飽和酚、異戊醇混合液，顛倒數(shù)次充分混合后， 在13400 r ?mirT1條件下離心15 min，重復(fù)此操作三次；取上清，加入0. 8倍異丙醇和1/10 體積的NaAc溶液，禍旋30 s，充分混合后，在13400 r ? rnirT1下離心15 min ;取沉淀，加入 400 y L 70 %乙醇，上下顛倒使沉淀懸于溶液中，在13400 條件下離心洗滌沉淀 10 min;經(jīng)DNA濃縮儀干燥10 min，加pH 8.0、100 yL TE在65 °C條件下溶解15 min，放 入4 °C冰箱保存待用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用超聲波處理提取河豚魚DNA的方法，其特征在于： 所述的三氯甲烷：飽和酚：異戊醇體積比為25 :24 :1。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用超聲波處理提取河豚魚DNA的方法，所述方法為：1）合成引物對；2）河豚魚DNA樣品中加入CTAB裂解緩沖液，在功率100%的超聲波清洗器中65℃恒溫溫浴處理，處理時(shí)間為5-25 min，各處理重復(fù)3次；3）將獲得DNA樣品用于PCR擴(kuò)增，通過PCR產(chǎn)物電泳圖譜，鑒定處理的DNA提取結(jié)果。本發(fā)明以河豚魚肉為實(shí)驗(yàn)材料，對影響河豚魚特異物種成分檢測的主要前處理因素，DNA提取過程中的CTAB裂解緩沖液在65℃恒溫常規(guī)溫育與超聲波溫育處理效果進(jìn)行分析，以期篩選出優(yōu)化的前處理措施，提高河豚魚物種PCR鑒別效率，并保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，為建立河豚魚物種鑒別的快速檢測方法提供依據(jù)。
【IPC分類】C12N15-10
【公開號】CN104862303
【申請?zhí)枴緾N201510286408
【發(fā)明人】陳文炳, 翁國柱, 邵碧英, 繆婷玉, 江樹勛, 彭娟
【申請人】福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月30日