一種高質量果實基因組dna的提取方法及提取試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種高質量果實基因組DNA的提取方法，特別是一種高質量葡萄果實 基因組DNA的提取方法及提取試劑盒，屬于基因組學領域，可用于基因檢測領域。
【背景技術】
[0002] DNA的提取是分子生物學研究的基礎技術，提取高純度及結構完整的DNA是構建基 因文庫和遺傳圖庫等分子生物學研究的前提。
[0003] 傳統(tǒng)的DNA提取與純化，如CTAB法、SDS法是在裂解細胞的基礎上，多次Tris飽和苯 酪、氯仿等有機溶劑抽提使蛋白質變性沉淀于有機相，而核酸保留在水相，達到分離核酸的 目的；加入RNA酶除去核酸中的RNA;然后加入異丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉 淀，除去分離過程中殘留的有機溶劑和鹽離子，W免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促 反應，最后用TE溶解DNA備用。
[0004] 但是有些情況下，由于組織材料的外在性質不同W及化學成分、組織結構等內在 特點的差異，在提取基因組DNA時需要選擇不同的方法或作一些特殊的處理。葡萄果實的基 因組DNA提取過程中，就因其富含多糖、多酪、單寧、色素及其它次生代謝物質，從而導致提 取出的DNA由于多酪被氧化成棟褐色，多糖、單寧等物質與DNA會結合成粘稠的膠狀物，獲得 的DNA常出現(xiàn)產量低、純度差、易降解，影響了 DNA質量，不能被限制性內切酶酶切，嚴重的甚 至不能作為模板進行PCR擴增。

【發(fā)明內容】

[0005] 由于葡萄果實材料的特殊性，為了克服現(xiàn)有技術的不足，得到便于構建基因文庫 或遺傳圖庫等分子生物學研究利用的高質量的基因組DNA，本發(fā)明提供了一種果實的高質 量的基因組DNA的提取方法。本發(fā)明W葡萄果實作為提取材料，采用優(yōu)化改進的CTAB法進行 提取，獲得了高質量的葡萄果實的基因組DNA。
[0006] 本發(fā)明人為解決上述問題進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn):通過優(yōu)化抽提步驟，并調整 裂解試劑和提取試劑的組分和各組分的配比，能夠實現(xiàn)適用于果實樣本、尤其是葡萄果實 的高質量的基因組DNA的提取方法，從而完成了本發(fā)明。
[0007] 即本發(fā)明包括：
[000引1. 一種葡萄果實的基因組DNA的提取方法，包括如下步驟：
[0009] 步驟A:將樣本置于液氮中進行研磨，得到研磨樣本；
[0010] 步驟B:將所述研磨樣本置于裂解液中進行裂解，得到裂解產物；
[0011] 步驟C:將所述裂解產物置于第一提取液中進行抽提，得到第一抽提產物；
[001。步驟D:將所述第一抽提產物進行RNA酶消化，得到RNA酶消化產物；
[0013] 步驟E:將所述RNA酶消化產物進行蛋白酶K消化，得到蛋白酶K消化產物；
[0014] 步驟F:將所述蛋白酶K消化產物置于第二提取液中進行抽提，得到第二抽提產物；
[0015] 步驟G:將所述第二抽提產物中置于異丙醇中進行沉淀，
[0016] 其中，
[0017] 所述第一提取液由氯仿和異戊醇組成，所述氯仿和異戊醇的體積比為24:1;
[0018] 所述第二提取液由Tris飽和苯酪、氯仿和異戊醇組成，所述Tris飽和苯酪、氯仿和 異戊醇的體積比為25:24:1。
[0019] 2.根據(jù)項1所述的提取方法，其特征在于，所述裂解液的組分為:2%(g/v，即質量/ 體積）的CTAB、抑為8的1 OOmM的Tri S-肥1緩沖液、1.4M的化C1溶液、20mM的抓TA、4 % (g/v，即 質量/體積）的PVP、0.5體積％的護琉基乙醇。
[0020] 3.根據(jù)項1或2任一項所述的提取方法，其特征在于，所述步驟G后還包括步驟G-1: 將目標基因組DNA進行純化。
[0021] 4.根據(jù)項1~3任一項所述的提取方法，其特征在于，所述步驟C、步驟F和/或步驟G 后還包括步驟H:將所述各步產物進行離屯、。
[0022] 5.根據(jù)項1~4任一項所述的提取方法，其特征在于，所述葡萄果實為新鮮果實。
[0023] 6. -種果實的基因組DNA的提取試劑盒，其特征在于，包括樣本裂解試劑，第一提 試劑，第二提取試劑，助沉試劑和純化試劑，其中，所述樣本裂解試劑包括CTAB、化i S-HC1溶 液、化C1、EDTA、PVP、β-琉基乙醇，所述第一提取試劑包括氯仿和異戊醇，所述第二提取試劑 包括Tris飽和苯酪、氯仿和異戊醇。
[0024] 7.-種項1-5任一項所述提取方法或項6所述提取試劑盒在提取葡萄果實基因組 DNA中的應用。
[0025] 8.根據(jù)項7所述的應用，其特征在于，所述葡萄果實為新鮮果實。
[00%] 9.-種用于二代測序的果實DNA文庫構建方法，包括如下步驟：
[0027] 步驟a:采用權利要求1-5任一項所述提取方法提取得到葡萄果實的基因組DNA;
[0028] 步驟b:將所述葡萄果實的基因組DNA打斷到希望進行測序的長度，得到希望進行 測序的DNA片段；
[0029] 步驟C:將希望進行測序的DNA片段進行末端修復，得到平末端DNA片段；
[0030] 步驟d:將所述平末端DNA片段進行3 '端加 A，得到3 '端加 A的DNA片段；
[0031] 步驟e:將所述3 '端加 A的DNA片段加接頭，得到加接頭DNA片段;和
[0032] 步驟f:將所述加接頭DNA片段進行PCR擴增，得到擴增產物。
[0033] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是:通過實施本發(fā)明記載的葡萄果實的基因 組DNA的提取方法，能夠得到高質量的果實基因組DNA，特別是葡萄果實的基因組DNA。在本 說明書中，本發(fā)明記載的高質量基因組DNA中的"高質量"是指基因組DNA的純度和濃度高。 純度高即0D260/280介于1.6~1.8之間，0D260/230介于2.0~3.2之間。例如核酸的最大吸 收波長為260nm，蛋白質的最大吸收波長為280nm，可W通過測定在260和280的0D比值來評 價核酸的純度。濃度高即每單位體積液體中所含的基因組DNA含量高，例如，在1 OOmg的樣本 起始量下，提取得到的基因組DNA的濃度不低于30ngAiL，基因組DNA的總量不低于化邑。
【附圖說明】
[0034] 圖1是本發(fā)明的實施例1的瓊脂糖凝膠電泳圖，
[0035] 其中Ml-分子量標準，1-編號1的樣本，2-編號2的樣本；
[0036] 圖2是本發(fā)明的對比例1的瓊脂糖凝膠電泳圖，
[0037] 其中，Ml-分子量標準，3-編號3的樣本，4-編號4的樣本。
【具體實施方式】
[0038] 本說明書中提及的科技術語具有與本領域技術人員通常理解的含義相同的含義， 如有沖突W本說明書中的定義為準。
[0039] 在一個方面，本發(fā)明提供了一種果實的基因組DNA的提取方法，包括如下步驟：
[0040] 步驟A:將樣本置于液氮中進行研磨，得到研磨樣本；
[0041 ]步驟B:將所述研磨樣本置于裂解液中進行裂解，得到裂解產物；
[0042] 步驟C:將所述裂解產物置于第一提取液中進行抽提，得到第一抽提產物；
[0043] 步驟D:將所述第一抽提產物進行RNA酶消化，得到RNA酶消化產物；
[0044] 步驟E:將所述RNA酶消化產物進行蛋白酶K消化，得到蛋白酶K消化產物；
[0045] 步驟F:將所述蛋白酶K消化產物置于第二提取液中進行抽提，得到第二抽提產物；
[0046] 步驟G:將所述第二抽提產物中置于異丙醇中進行沉淀。
[0047] 其中，
[0048] 所述第一提取液由氯仿和異戊醇組成，所述氯仿和異戊醇的體積比為24:1;
[0049] 所述第二提取液由Tris飽和苯酪、氯仿和異戊醇組成，所述Tris飽和苯酪、氯仿和 異戊醇的體積比為25:24:1。
[0050] 優(yōu)選的，所述裂解液的組分為：2%(g/v，即質量/體積）的CTAB、pH為8的lOOmM的 Tris-HCl緩沖液、1.4M的化C1溶液、20mM的抓TA、4% (g/v，即質量/體積）的PVP、0.5體積％ 的β-琉基乙醇。
[0化1]所述裂解液的預熱溫度為60~75°C，優(yōu)選為65°C。反應溫度為60~75°C，優(yōu)選為65 °C〇
[0052] 本發(fā)明提供的果實的基因組DNA的提取方法經過了本發(fā)明人的反復優(yōu)化及驗證， 從而解決了傳統(tǒng)CTAB提取方法(例如對比例1所述的方法)應用于葡萄果實樣本時、所得文 庫質量不高的技術難題。
[0053] 優(yōu)選的，所述步驟G后還包括步驟G-1:將目標基因組DNA進行純化。本發(fā)明中，對于 純化的方式沒有特殊限制，可W采用本技術領域的常規(guī)方法來進行，例如可W采用70%乙 醇、75%乙醇、70%異丙醇，W及高鹽溶液(化C1)等，優(yōu)選為75%的乙醇和1.4M的化C1進行 純化。
[0054] 優(yōu)選的，所述步驟C、步驟F和/或步驟G后還包括步驟H:將所述各步產物進行離屯、。 本發(fā)明中，對于離屯、沒有特殊限制，可W采用本技術領域的常規(guī)方法來進行，例如可W采用 10000~13000巧m離屯、，優(yōu)選采用12000巧m離屯、。
[0055] 優(yōu)選的，通過本發(fā)明的提取方法得到的基因組DNA可W采用本技術領域的常規(guī)方 法來進行保存，例如可W采用本領域技術人員所熟知的任何試劑溶解保存，如無菌雙蒸水， TE溶液。
[0056] 優(yōu)選的，所述葡萄果實為新鮮果實。
[0057] 在另一個方面，本發(fā)明還提供了一種果實的基因組DNA的提取試劑盒，其特征在 于，包括樣本裂解試劑，第一提取試劑，第二提取試劑，助沉試劑和純化試劑，其中，所述樣 本裂解試劑包括CTAB、Tr i S-肥1溶液、化C1、邸TA、PVP、β-琉基乙醇，所述第一提取試劑包括 氯仿和異戊醇，所述第二提取試劑包括Tris飽和苯酪、氯仿和異戊醇。
[0058] 在另一個方面，本發(fā)明還提供了所述提取方法或所述提取試劑盒在提取葡萄果實 基因組DNA中的應用。
[0059] 優(yōu)選的，所述葡萄果實為新鮮果實。
[0060] 在另一個方面，本發(fā)明還提供了一種用于二代測序的果實DNA文庫構建方法，包括 如下步驟：
[0061] 步驟a:采用權利要求1-5任一項所述提取方法提取得到葡萄果實的基因組DNA;
[0062] 步驟b:將所述葡萄果實的基因組DNA打斷到希望進行測序的長度，得到希望進行 測序的DNA片段；
[0063] 步驟C:將希望進行測序的DNA片段進行末端修復，得到平末