一種熱穩(wěn)定性和催化效率提高的蔗糖異構(gòu)酶突變體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性和催化效率提高的蔗糖異構(gòu)酶突變體，屬于基因工程和 酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蔗糖異構(gòu)酶（EC 5. 4. 99. 11)，又稱異麥芽酮糖合酶，蔗糖變位酶，是一種工業(yè)應(yīng)用 價(jià)值極高的異構(gòu)酶，屬于a -淀粉酶13家族，可以高效催化異構(gòu)蔗糖生成異麥芽酮糖和海 藻酮糖，異麥芽酮糖后續(xù)加氫可以生成異麥芽酮糖醇，異麥芽酮糖與異麥芽酮糖醇在醫(yī)藥 上具有極高的價(jià)值，兩者口感與蔗糖相似，特別是兩者不容易引起人體血糖的升高，非常適 合糖尿病患者的服用。利用蔗糖異構(gòu)酶酶法轉(zhuǎn)化蔗糖，與化學(xué)法合成異麥芽酮糖相比，具有 轉(zhuǎn)化率高，反應(yīng)時(shí)間短，生產(chǎn)成本低。因此，在工業(yè)生產(chǎn)中可以達(dá)到增加產(chǎn)量、提高設(shè)備利用 率、降低生產(chǎn)成本的目的。來(lái)源于Serratia plymuthica AS9鹿糖異構(gòu)酶由600個(gè)氨基酸 組成，包含了三個(gè)結(jié)構(gòu)域。在酶轉(zhuǎn)化底物生產(chǎn)產(chǎn)物時(shí)，溫度越高，可以抑制轉(zhuǎn)化過(guò)程中微生 物的生長(zhǎng)，防止酶在轉(zhuǎn)化過(guò)程中被這些微生物降解。目前報(bào)道的大部分微生物來(lái)源的蔗糖 異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性均很差，本發(fā)明中野生蔗糖異構(gòu)酶在50°C下半衰期僅為8min左右，45°C下 半衰期為40min。熱穩(wěn)定性差不利于鹿糖異構(gòu)酶在工業(yè)上進(jìn)行連續(xù)的酶轉(zhuǎn)化以及酶的儲(chǔ)藏 運(yùn)輸，因此，通過(guò)蛋白質(zhì)分子改造提高蔗糖異構(gòu)酶的穩(wěn)定性顯得尤為重要。
[0003] 在蛋白質(zhì)分子改造中，目前常用的方法有理性設(shè)計(jì)、非理性設(shè)計(jì)和半理性設(shè)計(jì)。三 種方法的主要區(qū)別在于是否充分了解酶蛋白分子結(jié)構(gòu)以及是否需要使用生物信息學(xué)軟件 進(jìn)行計(jì)算和預(yù)測(cè)。其中理性設(shè)計(jì)具有實(shí)驗(yàn)成本低、簡(jiǎn)單方便和時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。B因子（原子 取代因素）指的是由熱運(yùn)動(dòng)和位置混亂引起的原子在其平衡位置周?chē)娮用芏鹊哪：取?B因子越大，代表結(jié)構(gòu)中一個(gè)氨基酸的活動(dòng)范圍越大，反之亦然。因此，氨基酸的B因子和 其柔性具有一定的關(guān)系，B因子高的氨基酸更容易發(fā)生形狀的改變和位置的移動(dòng)，具有更好 的柔性。反之，B因子低的氨基酸具有更好的剛性，不易發(fā)生變形和位移。在受熱條件下， B因子高的氨基酸更容易受到影響而發(fā)生結(jié)構(gòu)破壞，而導(dǎo)致酶活受到影響；而剛性好的B因 子低的氨基酸則能更好地保持其構(gòu)象的穩(wěn)定，而維持酶活力。因此將蔗糖異構(gòu)酶中B因子 最高的氨基酸進(jìn)行突變，降低其B因子，有可能提高酶的熱穩(wěn)定性。Rosetta Design軟件可 以對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行穩(wěn)定性突變的預(yù)測(cè)，通過(guò)計(jì)算，將柔性較高的氨基酸（B因子值較大）替 換成剛性增強(qiáng)的氨基酸。Rosetta Design通過(guò)計(jì)算得到的氨基酸，它們的疏水原子被隱藏， 它們的極性原子具有形成氫鍵的潛能，同時(shí)Rosetta Design預(yù)測(cè)得到的蛋白質(zhì)骨架具有 更低的能量。
[0004] 發(fā)明人前期對(duì)來(lái)源于普城沙雷氏桿菌（S.plymuthica)的蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行了異源 表達(dá)和定點(diǎn)突變改造，獲得了兩個(gè)熱穩(wěn)定性和分泌性能得到提高的蔗糖異構(gòu)酶突變體（一 種熱穩(wěn)定性和分泌效率提高的蔗糖異構(gòu)酶突變體及其制備方法.2014102014687)。得到的 突變體K576D和K576P熱穩(wěn)定性和分泌效率都得到了一定的提高（K576D和K576P在45°C 下半衰期分別是野生酶的1. 8和1. 4倍；搖瓶發(fā)酵時(shí)兩個(gè)突變體的胞外分泌效率分別是天 然酶的4. 6和4. 7倍），但是催化效率出現(xiàn)了不同程度的降低。為了進(jìn)一步提高酶的應(yīng)用性 能，本發(fā)明將B因子分析和Rosetta Design軟件計(jì)算相結(jié)合，選擇新的突變位點(diǎn)進(jìn)行分子 改造，以進(jìn)一步提尚鹿糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性和催化效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種蔗糖異構(gòu)酶突變體，突變體與親本蔗糖 異構(gòu)酶相比有更好的熱穩(wěn)定性和催化效率。所述親本基因與普城沙雷氏桿菌（Serratia plymuthica AS9)蔗糖異構(gòu)酶基因（NCBI編號(hào)：NC_015567) -致，所述作為突變用的 質(zhì)粒模板為攜帶天然蔗糖異構(gòu)酶編碼基因的載體palI/pET24a(+)(中國(guó)專利，【申請(qǐng)?zhí)枴?2014102014687)。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種蔗糖異構(gòu)酶突變體，所述突變體在氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1的基礎(chǔ)上，將第175位置的谷氨酸突變成天冬酰胺，命名為E175N。
[0007] 編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中是SEQIDN0. 2 所示的序列。
[0008] 所述突變體，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，還包括同時(shí)將第576位的賴氨酸突變 為谷氨酸，所得突變體命名為E175N/K576D。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是一種制備所述突變體的方法，包括如下步驟：
[0010] 1)對(duì)鹿糖異構(gòu)酶晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，確定B因子較高的氨基酸，并結(jié)合Rosetta Design軟件分析確定突變成何種氨基酸可以降低B因子；
[0011] 2)設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變所用引物，以攜帶蔗糖異構(gòu)酶編碼基因的載體為模板進(jìn)行突變并 構(gòu)建兩種突變體的質(zhì)粒載體；
[0012] 3)將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞；
[0013] 4)挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，純化獲得蔗糖異構(gòu)酶突變體。
[0014] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含有所述突變體的氨基酸序列的重組質(zhì)粒載體。
[0015] 所述質(zhì)粒載體，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是pET系列、pGEX系列、pPICZ系列、 或PAN系列、或pUB中的任意一種。
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種表達(dá)所述突變體的細(xì)胞。
[0017] 所述細(xì)胞，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是細(xì)菌、酵母或者真菌。
[0018] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述突變體在生產(chǎn)異麥芽酮糖或海藻酮糖或異麥芽酮糖醇方 面的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 本發(fā)明構(gòu)建了兩個(gè)熱穩(wěn)定性和催化效率均得到了提高的蔗糖異構(gòu)酶突變體E175N 和 E175N/K576D。
[0021] (1)熱穩(wěn)定性：在pH6.0,45°C的水浴中，突變體E175N和E175N/K576D的半衰 期為90. 2min和300min左右，相比天然蔗糖異構(gòu)酶半衰期的39. 2min，分別提高了 130%、 665 % 〇
[0022] (2)催化效率：酶動(dòng)力學(xué)分析顯示，E175N和E175N/K57D的Km值分別比天然酶下 降了 6. 6%和11%;催化效率Keat/Km分別提高了 38%和19%。催化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖 時(shí)，突變體的異麥芽酮糖最大轉(zhuǎn)化率分別比天然酶提高了 1.8%和1.6%。
[0023]因此，蔗糖異構(gòu)酶突變體比親本更適合蔗糖異構(gòu)酶的運(yùn)輸保藏和在催化蔗糖生成 異麥芽酮糖過(guò)程中的應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1 :天然蔗糖異構(gòu)酶三維模擬結(jié)構(gòu)；
[0025] 圖2:天然酶與突變體在45°C、pH 6. 0保溫20min后的殘留酶活比較；
[0026] 圖3:天然蔗糖異構(gòu)酶及三種突變體純酶SDS-PAGE凝膠電泳；其中，M代表蛋白分 子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為天然蔗糖異構(gòu)酶，泳道2為突變體E175N;泳道3為突變體K576D;泳道 4 為突變體 E175N/K576D;
[0027] 圖4:天然蔗糖異構(gòu)酶及其突變體的酶學(xué)性質(zhì)比較，其中（a)為最適溫度，（b)為 45 °C下的熱穩(wěn)定性；
[0028] 圖5 :天然蔗糖異構(gòu)酶及其突變體30°C下制備異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化率。
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1:蔗糖異構(gòu)酶定點(diǎn)突變體的制備[0030] (1)蔗糖異構(gòu)酶定點(diǎn)突變體的構(gòu)建
[0031] 來(lái)源于S. plymuthica的蔗糖異構(gòu)酶2種定點(diǎn)突變體E175N和E175N/K576D:
[0032] 本發(fā)明中，以相似度最高的Protaminobacter rubrum CBS 574. 77鹿糖異構(gòu)酶 (SmuA)晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID: 3GBD)為模板，通過(guò)EMBI-EBL在線服務(wù)器構(gòu)建了 S. plymuthica AS9蔗糖異構(gòu)酶（Pall AS9)的三維模擬結(jié)構(gòu)（圖1)。通過(guò)氨基酸一級(jí)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SmuA 和Pall AS9兩者之間只有一個(gè)氨基酸不同，相似度達(dá)到99. 86%，因此可以認(rèn)為Pall AS9 有著SmuA近乎相同的三維結(jié)構(gòu)和B因子參數(shù)?；谏鲜龇治觯x擇Pall AS9中6個(gè)具有 較高的B因子的氨基酸殘基（表1)，之后利用Rosetta Design軟件將它們替換成剛性增強(qiáng) 的理想目標(biāo)氨基酸。根據(jù)軟件分析預(yù)測(cè)的結(jié)果，利用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法分別構(gòu)建除 之前已成功構(gòu)建的K576D的剩下5種突變體N577K、S575D、K174D、E175N和G176D。
[0033] 5種定點(diǎn)突變體的制備方法，根據(jù)S. plymuthica鹿糖異構(gòu)酶的序列（氨基酸序列 如SEQ ID NO. 1所示，核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示），分別設(shè)計(jì)并合成引入定點(diǎn)突變的 引物，對(duì)蔗糖異構(gòu)酶N577、S575、K174、E175和G176位置進(jìn)行定點(diǎn)突變，測(cè)定DNA編碼序列， 分別測(cè)序確認(rèn)蔗糖異構(gòu)酶突變體的編碼基因是否正確；將突變體基因連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載 體中并導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到5種蔗糖異構(gòu)酶定點(diǎn)突變體。
[0034] 定點(diǎn)突變體編碼基因的PCR擴(kuò)增：利