一種自內(nèi)裂解大腸桿菌的裂解酶及其應用
【專利說明】
[0001]
技術領域
[0002] 本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一種自內(nèi)裂解大腸桿菌的裂解酶及其應用。
【背景技術】
[0003] 大腸桿菌是一類革蘭氏陰性細菌，因為其遺傳背景較為清楚，是分子生物學中常 用的模式菌株，也是工業(yè)上一類很重要的工程菌株。大腸桿菌是很多外源蛋白的生產(chǎn)菌株， 常被用來誘導生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)，如熒光蛋白（EGFP)，琥珀酸、Harpin蛋白，干擾素等。為了 獲得大腸桿菌胞內(nèi)表達的外源重組蛋白，通常需要離心收集宿主菌體，然后用超聲波破碎， 或者壓力破碎。這需要大型的儀器設備，同時也消耗大量的能源。因此，尋找和開發(fā)一種溫 和的大腸桿菌自裂解的方法具有非常重要的意義。
[0004] 噬菌體裂解酶是雙鏈DNA噬菌體感染宿主細菌后晚期表達的一種細胞壁水解酶。 裂解酶大小通常為25 kD~40 kD，在結(jié)構上由兩個獨立的功能域構成，N-端的催化功能域， 和一個決定細胞結(jié)合位點的C-端細胞結(jié)合功能域（CBD)，二者之間由一個小片段鏈接。序 列分析表明，同一類裂解酶的催化域高度保守，而細胞結(jié)合域可變，這為構建新的嵌合裂解 酶提供了可能。裂解酶具有很高的特異性，只能特異性的識別和裂解特定種類的細菌。此 外，裂解酶作用位點很保守，加上噬菌體與細菌共同進化的特異性，宿主菌很難對其產(chǎn)生抗 性。到目前為止，已有一些能在體外裂解大腸桿菌的天然裂解酶被報道，這些酶可以直接或 者在膜透化劑(如EDTA)的輔助下自外裂解大腸桿菌，在體內(nèi)表達時無法實現(xiàn)大腸桿菌的可 控自裂解。目前尚沒有利用裂解酶實現(xiàn)大腸桿菌可控自裂解后用于外源蛋白生產(chǎn)的報道。 因此，尋找能在大腸桿菌中穩(wěn)定、可控的表達，且表達后能高效裂解大腸桿菌的裂解酶具有 非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種能在大腸桿菌種可控表達，且表達后能導 致大腸桿菌自裂解的裂解酶，為了敘述方便，我們命名為ClyN，其編碼基因C/jW。
[0006] 本發(fā)明提供的自內(nèi)裂解大腸桿菌的裂解酶的編碼基因韻核酸序列如序列表 中 SEQ. ID. NO. 1 所示。
[0007] 本發(fā)明提供的自內(nèi)裂解大腸桿菌的裂解酶ClyN的蛋白序列如序列表中SEQ. ID. NO. 2 所示。
[0008] 本發(fā)明還公開了一種將ClyN用于外源蛋白生產(chǎn)的方法。具體方法是： 將外源蛋白克隆至PBAD24表達載體，將ClyN克隆至pET28a ( + )表達載體，然后將兩 個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)大腸桿菌BL21(DE3); 先將轉(zhuǎn)化后的菌株培養(yǎng)在含有L-阿拉伯糖的培養(yǎng)基中誘導外源蛋白的表達，然后加 入IPTG誘導ClyN的表達，ClyN的表達會導致大腸桿菌的自裂解，釋放出胞內(nèi)所表達的外 源蛋白。
[0009] 所述的外源蛋白為任何能在大腸桿菌中表達的蛋白質(zhì)，如熒光蛋白（EGFP)，琥珀 酸、Harpin蛋白，干擾素等。
[0010] 本發(fā)明有以下的突出效果和優(yōu)點： ClyN能在大腸桿菌中穩(wěn)定、可控的表達，且表達后能導致大腸桿菌的高效自裂解，釋放 出胞內(nèi)所表達的外源蛋白，具有溫和，高效、方便、無污染、低能耗等特點，可用于大腸桿菌 中外源蛋白表達后釋放。
[0011] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。
【附圖說明】
[0012] 圖1為基因PCR擴增結(jié)果。圖中M為標準分子量marker。N為擴增勺 條帶。
[0013] 圖2為ClyN誘導大腸桿菌自裂解后0D_的變化結(jié)果。實心方塊所示為 BL21 (DE3)/pET28a( + )在IPTG誘導后0D6QQ隨時間的變化趨勢，空心三角所示為BL21 (DE3) / pET-ClyN在IPTG誘導后0D_隨時間的變化趨勢。
[0014] 圖3為ClyN誘導大腸桿菌自裂解后培養(yǎng)基中ATP的變化結(jié)果?？v坐標表示用熒 光素酶試劑盒測試的培養(yǎng)基中的發(fā)光強度。
[0015] 圖4為ClyN誘導大腸桿菌自裂解效率的結(jié)果。將大腸桿菌BL21(DE3)/pET-ClyN 加入IPTG后稀釋平板計數(shù)，用沒有加IPTG的組為對照。
[0016]圖5為ClyN誘導大腸桿菌自裂解后釋放胞內(nèi)表達的EGFP效率的結(jié)果。將BL21 (DE3) /pET-ClyN/pBAD-EGFP菌株在含有L-阿拉伯糖的培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，加入0. 5 mM的IPTG誘導不同的時間，觀測培養(yǎng)液中的熒光強度，并與直接超聲破碎相比較。
[0017] 圖6為ClyN誘導大腸桿菌自裂解過程的結(jié)果。將BL21 (DE3) /pET-ClyN/pBAD-EGFP 菌株在含有L-阿拉伯糖的培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，與1mM的IPTG混合，用熒光顯微鏡監(jiān)測 菌體的變化。
【具體實施方式】
[0018] 本發(fā)明設計和人工合成一種新的嵌合裂解酶ClyN。下列實施例中所用的方法如無 特別說明均是常規(guī)的實驗方法。實驗中所用到的引物均由上海英駿公司提供。測序均在上 海英駿公司完成。
[0019] 實施例1、能誘導大腸桿菌自裂解的裂解酶的構建 (1)在南京金斯瑞生物科技有限公司全序列合成能表達裂解酶ClyN的基因DNA 序列。合成序列裝入PUC57質(zhì)粒中。以基因為模板，在目的基因的兩端分別加入Ncol 和Xhol的酶切位點，引物設計如下： 正向引物：5- ATATCCATGGGCATGCCTCCATCATTACG -3 (SEQ. ID. NO. 3) Ncol 反向引物：5- TATACTCGAGGTAGTTCAGGGTCTGGCCTG -3 (SEQ. ID. NO. 4) Xhol 以2 yl基因為模板，各加入引物1 yg進行PCR擴增，PCR擴增程序如下：1)94°C， 5 min ;2) 94 °C，30 sec，62 °C，45 sec，72 °C，45 sec，30 個循環(huán)；3)72 °C，10 min;將產(chǎn) 物進行凝膠電泳回收，電泳圖譜如圖韻基因大小為861 bp，與所設計的裂解酶的大 小一致。
[0020] (2)將基因連入表達質(zhì)粒pET28a(+)中得到重組載體pET-ClyN，然后將其轉(zhuǎn) 化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得大腸桿菌工程菌株BL21 (DE3) /pET-ClyN。
[0021] 實施例2、ClyN誘導大腸桿菌自裂解的驗證 將大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-ClyN培養(yǎng)至0D6QQ=0. 8左右，加入IPTG至0? 5 mM后用酶 標儀監(jiān)測菌液在600 nm吸收值的變化。同時，用沒有加IPTG的菌液作為負對照。最后得 到的裂解曲線見附圖2。結(jié)果顯示ClyN能誘導宿主菌株的快速自裂解從而導致在600 nm 吸收值快速降低。
[0022] 實施例3、ClyN誘導大腸桿菌自裂解后培養(yǎng)基中ATP的變化結(jié)果的驗證 將大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-ClyN培養(yǎng)至0D6QQ=0. 8左右，加入IPTG至0? 5 mM后，用熒 光素酶檢測試劑盒檢測菌液中發(fā)光值的變化。同時，用沒有加IPTG的菌液作為負對照。試 驗得到的發(fā)光曲線見附圖3。結(jié)果顯示ClyN誘導宿主大腸桿菌自裂解后能在培養(yǎng)液中檢測 到大量的ATP。
[0023] 實施例4、ClyN誘導大腸桿菌自裂解效率的結(jié)果的驗證 將大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-ClyN培養(yǎng)至0D6QQ=0. 8左右，加入IPTG至0? 5 mM后稀釋 平板計數(shù)，用沒有加IPTG的稀釋液作為負對照，所得到的結(jié)果見附圖4。結(jié)果顯示ClyN能 高效的誘導宿主大腸桿菌的自裂解，其裂解效率為99. 8%。
[0024] 實施例5、ClyN誘導大腸桿菌自裂解后釋放胞內(nèi)表達的EGFP效率的結(jié)果的驗證。
[0025] 以EGFP作為外源蛋白的代表，將EGFP基因克隆至表達質(zhì)粒pBAD24中得到 pBAD-EGFP質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-ClyN中得到EGFP工程菌株 BL21 (DE3) /pET-ClyN/pBAD-EGFP。將菌株 BL21 (DE3) /pET-ClyN/pBAD-EGFP 過夜培養(yǎng)在含 有0. 2% L-阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基中，誘導EGFP基因的表達。次日，將菌體重懸至新鮮 LB中。取等體積的該菌液數(shù)份(每份100 ml)，分別加入0. 5 mM的IPTG后繼續(xù)培養(yǎng)0. 5， 1，2 h。培養(yǎng)結(jié)束后測定培養(yǎng)液上清中的熒光強度。為了方便比較，實驗中設立兩個對照， 一個為重懸后培養(yǎng)液中的熒光強度（即培養(yǎng)0 h時的熒光強度，此為空白對照)。另一份重 懸后直接超聲破碎(超聲3 s，停5 s，共超聲處理30 min)，測定上清中的熒光強度(此為陽 性對照)。通過比較培養(yǎng)液上清中的熒光強度來衡量ClyN誘導自裂解效率與傳統(tǒng)的超聲破 碎效率。試驗得到的鑒定結(jié)果見附圖5。結(jié)果顯示ClyN能高效的誘導EGFP的釋放，其釋放 效率相當于超聲破碎效率的89%。
[0026] 實施例6、ClyN誘導大腸桿菌自裂解過程的結(jié)果的驗證 將用L-阿拉伯糖誘導過夜的BL21 (DE3)/pET-ClyN/pBAD-EGFP細菌收集后加IPTG至1 mM，然后將菌液滴在1% LB-瓊脂固體上，將LB-瓊脂固體切成小方塊，用高分辨率熒光顯微 鏡對細菌的狀態(tài)進行實時監(jiān)測，觀察細菌裂解的動態(tài)過程。試驗得到的鑒定結(jié)果見附圖6。 結(jié)果顯示ClyN能在誘導表達后15 min誘導宿主細菌的自裂解和胞內(nèi)EGFP蛋白的釋放。
【主權項】
1. 一種自內(nèi)裂解大腸桿菌的裂解酶ClyN，其蛋白序列如序列表中SEQ.ID.NO. 2所示。
2. 編碼權利要求1所述自內(nèi)裂解大腸桿菌的裂解酶的基因C/j水其核酸序列如序列表 中SEQ.ID.NO. 1 所示。
3. 將權利要求1所述的裂解酶ClyN應用于大腸桿菌的自內(nèi)裂解的方法，其特征在于， 將ClyN的基因?qū)氪竽c桿菌內(nèi)，以表達的ClyN蛋白質(zhì)作為自內(nèi)裂解大腸桿菌的手段。
4. 將權利要求1所述的裂解酶ClyN用于外源蛋白生產(chǎn)的方法，其特征在于： 將外源蛋白克隆至PBAD24表達載體，將ClyN克隆至pET28a( + )表達載體，然后將兩 個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)大腸桿菌BL21(DE3); 先將轉(zhuǎn)化后的菌體培養(yǎng)在含有L-阿拉伯糖的培養(yǎng)基中誘導外源蛋白的表達，然后加 入IPTG誘導ClyN的表達，ClyN的表達會導致大腸桿菌的自裂解，釋放出胞內(nèi)所表達的外 源蛋白。
5. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的外源蛋白為熒光蛋白、琥珀酸、 Harpin蛋白或干擾素。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種自內(nèi)裂解大腸桿菌的裂解酶及其應用。本發(fā)明采用基因拼接的手段，構建了一個全新的裂解酶ClyN，該酶在大腸桿菌中表達后能導致宿主大腸桿菌的自裂解，釋放出胞內(nèi)表達的ATP和蛋白質(zhì)。重組蛋白ClyN表達質(zhì)粒能很好的在大腸桿菌BL21(DE3)中復制，在IPTG的誘導下表達15 min后即可觀察到明顯的誘導大腸桿菌自裂解的現(xiàn)象，誘導裂解效率為99.8%。當宿主細菌中表達有異源增強型綠色熒光蛋白（EGFP）時，EGFP會在大腸桿菌裂解后釋放到溶液中，且其釋放效率是直接超聲破碎效率的89%。因此，ClyN能用于異源蛋白在大腸桿菌中表達后的提取與釋放，具有廣大的應用前景。
【IPC分類】C12N9-88, C12N15-60, C12N15-70
【公開號】CN104762285
【申請?zhí)枴緾N201510197003
【發(fā)明人】危宏平, 楊航, 余軍平
【申請人】武漢賽思銳微生物技術有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月23日