淀粉胚乳特異非表達(dá)啟動(dòng)子nse及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種淀粉胚乳特異非表達(dá)啟動(dòng)子NSE及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在植物基因工程中，對(duì)以種子，果實(shí)為主要收獲產(chǎn)物的植物，利用種子無(wú)表達(dá)啟動(dòng) 子驅(qū)動(dòng)目的基因僅在莖，葉等綠色組織中表達(dá)，而在種子食用部分無(wú)表達(dá)，是提高轉(zhuǎn)基因食 品安全性的有效策略。
[0003] 目前與植物種子不表達(dá)相關(guān)國(guó)內(nèi)外專利舉例如下：（1)【申請(qǐng)?zhí)枴?01210202831. 8 : 一種柑橘的綠色組織特異啟動(dòng)子；（2)【申請(qǐng)?zhí)枴?00710051443. 3 :組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子 PD540及其在水稻改良中的應(yīng)用；（3)【申請(qǐng)?zhí)枴?1823070.9 :營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)特異性啟動(dòng)子及由此 而得的基因重組植物；（4)【申請(qǐng)?zhí)枴?6104811. 5, 一種豆莢內(nèi)特異表達(dá)毒蛋白的轉(zhuǎn)基因植 物；（5) W00077223: -PROMOTER ENABLING TRANSGENE EXPRESSION IN THE WHOLE PLANT EXCEPT IN THE SEED. (6)US2004117876: - Vegetative growth-specific promoter and genetically modified plants obtained thereby. (7)
[0004] CN102417906: - rice green tissue-specific promoter PD540-544, not expressed in embryos and endosperms. (8)W02008081478: - Chimeric promoter constructed by fusion of GhrbcSP and D35SP promoters(expressed in all tissues except seed endosperm)。這些專利為轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用提供了有利啟動(dòng)子工具，但是由 于不同專利涉及不同的啟動(dòng)子，其表達(dá)譜（即具體的表達(dá)部位和表達(dá)水平）存在明顯差異； 而且同一個(gè)啟動(dòng)子應(yīng)用在不同的單，雙子葉植物，甚至不同物種間時(shí)經(jīng)常有不同的表達(dá)效 果。因此現(xiàn)有的啟動(dòng)子資源難以滿足植物基因工程的實(shí)際需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種DNA片段。
[0006] 本發(fā)明提供的DNA片段，為如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0007] 1)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0008] 2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；
[0009] 3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。
[0010] 上述嚴(yán)格條件可為在0.1 XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下 雜交并洗膜。
[0011] 含有上述DNA片段的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù) 的范圍。
[0012] 上述重組載體為將上述DNA片段替換掉表達(dá)載體pCAMBIA-1300-SGN中的CaMV35S 啟動(dòng)子，得到的重組載體。
[0013] 所述重組載體具體為將上述DNA片段取代pCAMBIA-1300-SGN的PstI和BamHI酶 切識(shí)別位點(diǎn)間的小片段（CaMV35S啟動(dòng)子）得到的重組質(zhì)粒。
[0014] 擴(kuò)增上述DNA片段的全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0015] 上述引物對(duì)由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈 DNA分子組成。
[0016] 上述DNA片段在植物中啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0017] 上述應(yīng)用中，所述目的基因表達(dá)為組織特異表達(dá)。
[0018] 上述應(yīng)用中，所述組織為除種子淀粉胚乳以外的其他植物組織。
[0019] 上述應(yīng)用中，所述除種子淀粉胚乳以外的其他植物組織為1)或2) :1)種子的胚、 糊粉層或種皮；2)植物的根、葉鞘、莖、莖節(jié)、葉或穗。
[0020] 上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水 稻；
[0021] 所述目的基因?yàn)棰荢基因。
[0022] 單子葉植物水稻種子的結(jié)構(gòu)包括種皮、胚和胚乳，其中胚乳又分為糊粉層 (aleurone layer)和淀粉胚乳（starchy endosperm)。在水稻加工成大米的過(guò)程中，種皮 和果皮、胚以及胚乳的糊粉層都被破壞，而淀粉胚乳留下食用。
[0023] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明克隆得到啟動(dòng)子NSE，NSE啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因僅在淀 粉胚乳之外的部分高效表達(dá)，是國(guó)內(nèi)外首個(gè)淀粉胚乳特異非表達(dá)啟動(dòng)子，將其運(yùn)用于以淀 粉胚乳為主要收獲產(chǎn)物的作物中，對(duì)外源基因（如抗除草劑、抗病蟲(chóng)害等）進(jìn)行選擇性表達(dá)， 既能節(jié)約能量，也能提高大眾對(duì)轉(zhuǎn)基因糧食的接受。另外，水稻，玉米等作物種子的糊粉層 中不僅富含蛋白質(zhì)、B族維生素及礦質(zhì)元素（P、K、Mg)，也是赤霉素信號(hào)反應(yīng)因子及α -淀粉 酶合成的關(guān)鍵部位。NSE啟動(dòng)子在糊粉層中的高表達(dá)特性對(duì)作物育種中提高種子萌發(fā)率，改 良種子品質(zhì)等具有重要應(yīng)用意義。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)NSE:⑶S水稻的⑶S染色分析
[0025] 圖2為轉(zhuǎn)NSE:⑶S水稻種子的⑶S染色分析
[0026] 圖3為轉(zhuǎn)NSE:⑶S水稻干種子及種子萌發(fā)過(guò)程中的⑶S染色分析
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0028] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029] 實(shí)施例1、水稻NSE啟動(dòng)子的獲得
[0030] 通過(guò) CTAB 方法從水稻'日本晴'（Oryza sativa ssp. japonica cultivarNipponbare,記載在 Yuman Zhang, Yongsheng Yan, Lina Wang, Kun Yang, Na Xiao,Yunfeng Liu,Yaping Fu, Zongxiu Sun,Rongxiang Fang, Xiaoying Chen. A novel rice gene, NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth. Mol. Plant，2012, 5(1) :63-72.公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得。）葉片中提取基因 組 DNA，設(shè)計(jì) 了正、反向特異引物 NSE-S-Ns i : 5 ' -ATGCATGCCCTGGCTAGCTTCTTCATCACTTC-3 ' (序列 2) ;NSE-R-BH:5' -GGATCCGGCCTGCACCGCAAATGGCGGATTTCC-3'（序列 3)(帶下劃線的 堿基為分別引入的NsiI和BamHI限制性酶切位點(diǎn)），采用TaKaRa LA-Taq DNA聚合酶進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到2, 208bp的PCR產(chǎn)物。將該P(yáng)CR產(chǎn)物送去測(cè)序，結(jié)果將該P(yáng)CR產(chǎn)物所示的DNA 分子命名為NSE，該DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列1。
[0031] 實(shí)施例2、水稻NSE啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證
[0032] 1、重組載體的獲得
[0033] 將實(shí)施例1得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)NsiI和BamHI酶切，得到2, 208bp的酶切產(chǎn)物，將該 酶切產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)PstI(與NsiI是同尾酶)和BamHI酶切的植物表達(dá)載體pCAMBIA-1300-SGN (記載在 Yuman Zhang, Yongsheng Yan, Lina Wang, Kun Yang, Na Xiao, Yunfeng Liu, Yaping Fu, Zongxiu Sun, Rongxiang Fang, Xiaoying Chen. A novel rice gene, NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth.Mol. Plant,2012, 5(I):63-72. 公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得。該載體中驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的啟動(dòng)子為35S)連 接，得到重組載體。
[0034] 采用引物NSE-S-Nsi和NSE-R-BH對(duì)重組載體進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到2, 208bp產(chǎn)物的 為陽(yáng)性重組載體。陽(yáng)性重組載體送去測(cè)序，結(jié)果該重組載體為將序列表中序列1所示的DNA 分子NSE插入表達(dá)載體pCAMBIA-1300-SGN的PstI和BamHI酶切位點(diǎn)間（替換掉CaMV35S 啟動(dòng)子）得到的載體，命名為P130-NSE。該重組載體的部分結(jié)構(gòu)示意圖如圖IA所示，可以 看出，NSE插入⑶S基因的上游。
[0035] 2、重組菌的獲得
[0036] 將上述1得到的重組載體pl30-NSE轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105 (記載在 Yuman Zhang,Yongsheng Yan, Lina Wang, Kun Yang, Na Xiao,Yunfeng Liu, Yaping Fu, Zongxiu Sun, Rongxiang Fang, Xiaoying Chen. A novel rice gene, NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth.Mol. Plant,2012, 5(I):63-72. 公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得。）中，得到重組菌。
[0037] 提取重組菌的質(zhì)粒,送去測(cè)序,該質(zhì)粒為pl30_NSE,含