專利名稱：RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶作為指標(biāo)用于檢測(cè)肝癌易感性的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是一種嚴(yán)重危害人類的疾病。西方發(fā)達(dá)國(guó)家肝癌的發(fā)病率較低，國(guó)際上對(duì)肝癌的基礎(chǔ)研究仍較為薄弱，而我國(guó)是肝癌高發(fā)國(guó)家，發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡構(gòu)成年輕化，每年用于肝癌治療的醫(yī)療支出大為增加，肝癌成了嚴(yán)重危害我國(guó)人民生命財(cái)產(chǎn)安全的頭號(hào)敵人，并且是影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一個(gè)重要因素，加大力度進(jìn)行我國(guó)肝癌的基礎(chǔ)研究具有戰(zhàn)略意義，而分離和鑒定新的肝癌相關(guān)基因是目前肝癌基礎(chǔ)研究中的前沿課題。
到目前為止，已有不下20種的基因異常表達(dá)被確定與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但已確定的肝癌相關(guān)基因在肝癌中的異常表達(dá)率并不高，肝癌的發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明，肝癌的早期診斷率仍有待提高。此外，傳統(tǒng)的肝癌手術(shù)加化療以及近年來(lái)配合使用的多種基因治療方法仍沒(méi)有明顯提高肝癌患者的生存率，因而尋找新的肝癌相關(guān)基因尤其是肝癌高表達(dá)基因?qū)τ谔接懜伟┑陌l(fā)病機(jī)制具有重要意義。
因此，為治療和診斷目的研究和開(kāi)發(fā)在肝癌中高表達(dá)的基因和/或蛋白具有重要意義。本領(lǐng)域迫切需要新的在肝癌中高表達(dá)的基因和/或蛋白。
RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶(Rho-related GTP-binding protein RhoC；H9；ARHC；Ras homologgene family，member C；Aplysia Ras related homolog9；ARH9；Oncogene Rho H9；RHOH9；Transforming protein RhoC)的Genebank登錄號(hào)為gi|132543，NCBI的登錄號(hào)為NP_786886，Swissprot登錄號(hào)為P08134，IPI號(hào)為IPI00027434.1。RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶是一種GTP酶，在很多信號(hào)通路中發(fā)揮作用，同時(shí)它的功能也很多1)調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性；2)介導(dǎo)細(xì)胞之間的粘連；3)介導(dǎo)細(xì)胞骨架的形成；4)在肌肉分型中起著關(guān)鍵性的作用；5)調(diào)節(jié)焦點(diǎn)黏附等等。
已經(jīng)有很多研究已經(jīng)表明RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的基因與許多癌癥顯著相關(guān)。美國(guó)密歇根大學(xué)的Sofia Merajver博士第一次發(fā)現(xiàn)RhoC基因與乳腺癌有關(guān)，他們還覺(jué)得其重要性可能超出這種炎性乳癌，也會(huì)包括報(bào)導(dǎo)了的其它攻擊性的乳腺腫瘤。Merajver博士及其合作者在這之前已報(bào)導(dǎo)了的RhoC基因在炎性乳癌組織中過(guò)表達(dá)。為此他們考察了過(guò)度活躍的RhoC基因是否可以將培養(yǎng)中的正常乳腺細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為腫瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示，帶有額外的RhoC基因細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比正常細(xì)胞快176倍(Am.J.Pathol.2002 Feb；160(2)579-84)。
2004年，湖南中南大學(xué)湘雅醫(yī)院楊連粵教授等研究發(fā)現(xiàn)，RhoC基因的過(guò)量表達(dá)與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，RhoC蛋白的表達(dá)量可以用于評(píng)價(jià)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后，相關(guān)論文發(fā)表在Br.J.Cancer(2004，902349)上。他們從差異表達(dá)的基因中選取RhoC基因進(jìn)一步研究其與HCC侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RhoC基因的過(guò)量表達(dá)與HCC的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，RhoC基因是通過(guò)過(guò)量表達(dá)而非突變發(fā)揮作用。研究人員進(jìn)一步研究了RhoC的表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RhoC陽(yáng)性表達(dá)組HCC患者的中位生存時(shí)間顯著低于RhoC陰性表達(dá)組。
由上所述，RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶確實(shí)與癌癥相關(guān)，但目前最多的還是在基因水平上的研究，我們的發(fā)明是完全基于蛋白水平上的研究，因此，為治療和診斷目的研究和開(kāi)發(fā)在肝癌中高表達(dá)的基因和/或蛋白更具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
通過(guò)篩選在肝細(xì)胞癌癌組織以及肝細(xì)胞癌癌旁組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，本申請(qǐng)的發(fā)明人找到了一種在肝細(xì)胞癌的癌組織和癌旁組織中存在差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(在癌組織中上調(diào)表達(dá))，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶。進(jìn)一步的免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的確在肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(dá)(在癌組織中上調(diào)表達(dá))。
基于RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶與肝細(xì)胞癌的這種相關(guān)性，以該蛋白作為一個(gè)蛋白質(zhì)分子標(biāo)記對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)可以用于檢測(cè)肝癌。
因此，本發(fā)明的首要目的即在于提供一種RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶用作檢測(cè)肝癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備檢測(cè)肝癌的制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個(gè)目的還在于提供一種抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備檢測(cè)肝癌的試劑盒的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種體外檢測(cè)肝細(xì)胞組織中RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的表達(dá)是否異常的方法，該方法包括以下步驟
A、用特異性抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的抗體檢測(cè)待測(cè)肝細(xì)胞中RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的數(shù)量；B、將步驟A測(cè)得的RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的數(shù)量與正常肝組織中的RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的數(shù)量進(jìn)行比較，如測(cè)得的蛋白數(shù)量高于正常值，則表示被檢測(cè)肝組織中RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的表達(dá)異常。
本發(fā)明的RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性的這一發(fā)現(xiàn)將為肝細(xì)胞癌的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。


圖1顯示了對(duì)RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的免疫印跡分析結(jié)果，Beta-actin為對(duì)照。
圖2顯示了對(duì)隨機(jī)抽取的36例肝癌患者血清樣品、24例乙肝而非肝癌患者的血清樣品以及36例正常人血清樣品中RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的免疫印跡分析結(jié)果，transferrin為對(duì)照；其中N代表正常人血清，I代表乙肝而非肝癌患者血清，C代表肝癌患者血清。
圖3為采用R數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)圖2的免疫印跡圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得出的蛋白質(zhì)表達(dá)量相對(duì)分布圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
本申請(qǐng)的發(fā)明人用非酶解樣品制備法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制備了肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織蛋白質(zhì)樣品，以同位素親和標(biāo)簽與凝膠增強(qiáng)的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(gel-enhanced liquid chromatography-mass spectrometry coupled with isotope-coded affinitytag，GeLC-MS-ICAT)對(duì)其中的蛋白進(jìn)行鑒定并比較其表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶在肝細(xì)胞癌癌組織中高表達(dá)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的確在肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(dá)。
因此，以RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶作為一個(gè)蛋白質(zhì)分子標(biāo)記對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)可以用于檢測(cè)肝癌，即RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶可以用作檢測(cè)肝癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記。
實(shí)施例1、肝細(xì)胞癌癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)樣品的制備本實(shí)施例中所使用的尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)均購(gòu)自Sigma公司。
本實(shí)施例以非酶解樣品制備法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制備肝細(xì)胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)樣品，具體如下手術(shù)切除的新鮮組織塊迅速置于冰上，快速切成幾個(gè)肉眼可見(jiàn)、無(wú)壞死區(qū)域的小塊。用預(yù)冷的不含谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基(5％胎牛血清，0.2mM PMSF，1mM EDTA，苯甲異噁唑青霉素25mg/mL，慶大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/mL，兩性霉素B0.25mg/mL，制霉菌素50U/mL)洗滌組織小塊數(shù)次后，在液氮中快速研磨成細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀分別溶于適量裂解液(8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmmol/L DTT)中，超聲細(xì)胞破碎儀(Soniprep 150，英國(guó)，MSE)冰浴間歇超聲2min，15000r/min、4℃離心1h。取上清，以改良的Bradford法(見(jiàn)Bio-Rad公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))進(jìn)行總蛋白質(zhì)定量，制備好的肝細(xì)胞癌癌組織及相應(yīng)癌旁組織的蛋白質(zhì)樣品分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 以上述方法制備11對(duì)肝細(xì)胞癌癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)樣品。11例肝細(xì)胞癌標(biāo)本均來(lái)自東方肝膽外科醫(yī)院，由2個(gè)病理科醫(yī)生明確為肝細(xì)胞癌。均為男性，平均年齡48.5歲(31～65歲)，血清檢測(cè)hepatitis B病毒感染陽(yáng)性，11例(100％)屬臨床分級(jí)(TNM分級(jí))III級(jí)。其中，甲胎蛋白(AFP)高于25μg/L的10例(90.9％)；9例腫瘤大于5cm。11例肝細(xì)胞癌標(biāo)本的病理資料詳見(jiàn)表1。
表1、11例肝細(xì)胞癌標(biāo)本的病理資料

本實(shí)施例所用癌組織及癌旁組織樣品均為取自同一肝細(xì)胞癌患者的成對(duì)樣品，所有11例肝細(xì)胞癌病例有極相似的病例診斷指標(biāo)均為男性，平均年齡48.5歲(31～65歲)，血清檢測(cè)hepatitis B病毒感染陽(yáng)性，11例(100％)屬TNM分級(jí)III級(jí)。其中，AFP高于25μg/L的10例(93.75％)；9例腫瘤大于5cm。這種取樣方法有利于降低個(gè)體間差別對(duì)實(shí)驗(yàn)分析工作的影響。
實(shí)施例2、差異表達(dá)蛋白的篩選本實(shí)施例中使用的尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)購(gòu)自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、N，N-甲叉雙丙烯酰胺等購(gòu)自Fluka公司；cleavable ICAT試劑購(gòu)自Applied BiosystemsFramingham，MA公司。
過(guò)硫酸胺(AP)、TEMED、Tri-n-butylphosphat(TBP)、PDQuest軟件等為Bio-Rad產(chǎn)品。
Avidin親和柱購(gòu)自Applied Biosystems，F(xiàn)ramingham，MA公司。
LCQTMDeca XP system和ProteomeXTMWorkstation購(gòu)自Thermo Finnigan公司。
所使用的上樣緩沖液的組成為1mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.6ml，50％甘油5ml，10％SDS 2ml，巰基乙醇0.5ml，蒸餾水1.9ml，少量六溴酚藍(lán)。
首先采用同位素親和標(biāo)簽與凝膠增強(qiáng)的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(gel-enhanced liquidchromatography-mass spectrometry coupled with isotope-coded affinity tag，GeLC-MS-ICAT)對(duì)實(shí)施例1得到的11對(duì)蛋白質(zhì)樣品中的其中一對(duì)(病例編號(hào)為4 29)肝細(xì)胞癌的癌組織及癌旁組織中的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行篩選鑒定，方法參照2003年Steven P.Gygi發(fā)表在MCP上的文獻(xiàn)(Jiaxu Li et al.Mol Cell Proteomics.2003 Nov；2(11)1198-204.Epub.2003 Sep.23)，具體過(guò)程如下NESP法制備的一對(duì)肝細(xì)胞癌癌組織與相應(yīng)癌旁組織蛋白質(zhì)樣品(病例編號(hào)為429)，分別取100μg，先用TBP還原蛋白質(zhì)，而后分別用cleavable ICAT試劑(C12和C13)標(biāo)記(其中C12與C13分別對(duì)應(yīng)癌組織與相應(yīng)癌旁組織，標(biāo)記方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))。混合后加入適量上樣緩沖液，跑5％濃縮膠(上層膠)和7.5％～17.5％分離膠(下層膠)，電泳條件為15mA/膠30min，然后30mA/膠，保持至溴酚藍(lán)前沿入濃縮膠8cm左右。
考染染出條帶后，將整個(gè)上樣條帶平均切為8份，每份再分別切成1mm3的小塊，在100mM NH4HCO3、30％ACN中脫色，真空冷凍干燥，100μl 50mmol/L NH4HCO3(pH8.3，蛋白質(zhì)胰蛋白酶＝1∶5，W/W)中4℃放置2hr，加入50μl 50mmol/L NH4HCO3(pH8.3)，37℃酶解過(guò)夜。
抽提蛋白(60％ACN、0.1％TFA)，真空冷凍干燥。酶解后的每份肽段混合物經(jīng)Avidin親和柱純化出已標(biāo)記肽段后，再用LCQTMProteomeXTMWorkstation進(jìn)行液相串聯(lián)(LC-MS/MS)質(zhì)譜鑒定，Bioworks軟件(Thermo finnigan公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索并用relex軟件(Scripps Research Institute，USA)進(jìn)行數(shù)值計(jì)算。
運(yùn)用NESP法和GeLC-MS-ICAT技術(shù)，我們共鑒定到426種有定量關(guān)系的蛋白質(zhì)。其中兩倍以上量變的蛋白質(zhì)共201種，肝細(xì)胞癌癌組織高表達(dá)的有155種蛋白質(zhì)；肝細(xì)胞癌癌旁組織高表達(dá)的有46種蛋白質(zhì)。
用LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)搜索及比值計(jì)算得4個(gè)含Cys的肽段被總共鑒定到9次，與RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶(Rho-related GTP-binding protein RhoC；H9；ARHC；Ras homologgene family，member C；Aplysia Ras related homolog 9；ARH9；Oncogene Rho H9；RHOH9；Transforming protein RhoC)相符，氨基酸覆蓋率為18.65％。relex軟件計(jì)算結(jié)果顯示RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶在肝細(xì)胞癌癌組織中高表達(dá)，癌組織/癌旁組織的比值為2.531(SD＝1.797)，詳細(xì)的鑒定情況及肽段打分結(jié)果見(jiàn)表格2(表格中C*代表C13標(biāo)記的Cys)。
表2、GeLC-MS-ICAT中4個(gè)含Cys的肽段的詳細(xì)鑒定結(jié)果

實(shí)施例3、RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶差異表達(dá)的免疫印跡驗(yàn)證為確認(rèn)RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的差異表達(dá)，取10位肝細(xì)胞癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁組織蛋白質(zhì)樣品(NESP法制備，表1中除429例以外的其它10例)，用購(gòu)買的抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶抗體進(jìn)行免疫印跡分析，具體過(guò)程簡(jiǎn)述如下每個(gè)樣品取20μg蛋白質(zhì)樣品用12％SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(購(gòu)自Amersham Biosciences公司)上，一抗使用鼠抗人RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶單抗(購(gòu)自USBiological公司，1∶500稀釋)，室溫孵育2小時(shí)，用TBST(每升含Tris 2.42g，氯化鈉8g，Tween 20ml，用HCl調(diào)節(jié)pH到7.6)洗滌三次，每次5分鐘，二抗為抗鼠抗體(購(gòu)自Santa Cruz公司，1∶10000稀釋)室溫孵育1小時(shí)，再用TBST洗滌三次，每次10分鐘，最后用ECL plus試劑(Amersham Biosciences)反應(yīng)5分鐘后，以X-光片曝光檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。同時(shí)我們采用beta-actin作為等量上樣的對(duì)照(beta-actin單抗購(gòu)自abeam公司，1∶1000稀釋，二抗為小鼠)，結(jié)果如圖1所示。
圖1的免疫印跡結(jié)果顯示，10對(duì)癌組織與癌旁組織基本上是等量上樣，并且10對(duì)癌組織與癌旁組織中除兩對(duì)(317，42)不甚明顯外，其余各對(duì)均呈現(xiàn)癌組織中RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的雜交條帶的濃度都明顯高于相應(yīng)的癌旁組織的現(xiàn)象；可見(jiàn)RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶在肝細(xì)胞癌的癌組織中存在高表達(dá)，該結(jié)果與質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果一致。
為了能夠體現(xiàn)更好的應(yīng)用價(jià)值，我們隨機(jī)挑取了36例肝癌患者的血清(樣品資料見(jiàn)表3)，24例乙肝而非肝癌患者的血清(樣品資料見(jiàn)表4)，36例正常人血清(樣品資料見(jiàn)表5)，隨機(jī)進(jìn)行分組(每一組包含一例正常人血清、一例乙肝而非肝癌患者血清，一例肝癌患者血清)，每例樣品取10ug蛋白質(zhì)樣品，同樣運(yùn)用上述的免疫印跡方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用transferrin作為等量上樣的對(duì)照(transferrin單抗購(gòu)自abcam公司，1∶1000稀釋，二抗為小鼠)，結(jié)果如圖2所示。
同時(shí)，我們采用R數(shù)據(jù)分析軟件(免費(fèi)從http://www.r-project.org/下載)對(duì)圖2的免疫印跡圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出蛋白質(zhì)表達(dá)量的相對(duì)分布圖，結(jié)果如圖3所示。
從圖2和圖3我們可以看出，所有樣品的上樣量基本相同(從圖3的transferrin中可以得出此結(jié)論)，但是RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶在肝癌患者血清中的表達(dá)量明顯的高于正常人血清中的量，可見(jiàn)RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶在肝細(xì)胞癌患者的血清中高表達(dá)，該結(jié)果與質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果一致。
綜上所述，RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶在肝細(xì)胞癌的癌組織及癌旁組織中存在差異表達(dá)，顯然與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性，因此，以RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶作為一個(gè)蛋白質(zhì)分子標(biāo)記對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)可以用于檢測(cè)肝細(xì)胞癌。相應(yīng)的，特異性抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的抗體，包括各種抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的單克隆抗體和多克隆抗體，由于其能夠用于檢測(cè)RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的表達(dá)量，因而可以用于檢測(cè)肝癌，或者用于制備檢測(cè)肝癌的制劑或試劑盒等，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
雖然有關(guān)RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶動(dòng)態(tài)的生物學(xué)功能及腫瘤相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但是將其作為檢測(cè)肝癌的標(biāo)記物卻是肯定的。RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶可作為肝細(xì)胞癌的潛在標(biāo)志，而其在胞內(nèi)的生物學(xué)功能提示RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶可能作為肝癌的預(yù)后分子標(biāo)記和臨床治療的靶分子。
表3、肝癌血清樣品資料

表4、乙肝血清樣品資料

表5、正常血清樣品資料

權(quán)利要求
1.一種RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的應(yīng)用，其特征在于，用作檢測(cè)肝癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用作檢測(cè)肝癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記是檢測(cè)該蛋白在肝細(xì)胞組織中的表達(dá)量。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)該蛋白在肝細(xì)胞組織中的表達(dá)量是檢測(cè)該蛋白在肝細(xì)胞組織中是否存在上調(diào)表達(dá)。
4.一種抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的抗體的應(yīng)用，其特征在于，用于制備檢測(cè)肝癌的制劑。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
6.一種抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的抗體的應(yīng)用，其特征在于，用于制備檢測(cè)肝癌的試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
8.一種體外檢測(cè)肝細(xì)胞組織中RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的表達(dá)是否異常的方法，其特征在于包括以下步驟A、用特異性抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的抗體檢測(cè)待測(cè)肝細(xì)胞中RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的數(shù)量；B、將步驟A測(cè)得的RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的數(shù)量與正常肝組織中的RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的數(shù)量進(jìn)行比較，如測(cè)得的蛋白數(shù)量高于正常值，則表示被檢測(cè)肝組織中RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的表達(dá)異常。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述所述抗RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)篩選在肝細(xì)胞癌的癌組織和癌旁組織中存在差異表達(dá)的蛋白，找到了一種在肝細(xì)胞癌的癌組織中高表達(dá)的蛋白，免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶的確在肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(dá)。鑒于RhoC三磷酸鳥(niǎo)苷酶與肝細(xì)胞癌的這種相關(guān)性，該蛋白可以用作檢測(cè)肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1952661SQ20061011588
公開(kāi)日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2006年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月26日
發(fā)明者曾嶸, 周曉, 李辰, 袁新雨 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院