hsa-miR-1280在非小細胞肺癌中的作用及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及miRNA在癌癥診斷中的應(yīng)用，以及其用作非小細胞肺癌的診斷用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位于惡性腫瘤之首。非 小細胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)約占其80%，近些年療效雖有提高， 但長期生存率仍較偏低，絕大多數(shù)患者確診時已是癌癥晚期，只能采取姑息性治療，預(yù)后較 差。
[0003] 侵襲和轉(zhuǎn)移是癌細胞從原發(fā)性部位轉(zhuǎn)移到遠端部位形成腫瘤的過程，它是一個多 步驟、多因素參與的復(fù)雜生物學(xué)過程，是導(dǎo)致NSCLC復(fù)發(fā)和影響預(yù)后的重要因素，也是導(dǎo)致 患者死亡的主要原因，目前對NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移機制尚不清楚。一直以為腫瘤的發(fā)生是 由一系列致癌基因和抑癌基因突變逐步形成的，但隨著非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)，此傳統(tǒng)觀念被 改變。最近的研宄表明，非編碼RNA中的成員microRNA分子廣泛參與了腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過 程中的基因表達調(diào)控，這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷和治療提供了新的思路。
[0004] microRNA是由內(nèi)源基因編碼，長約19-24nt的非編碼小RNA，可通過形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA induced silencing complex, RISC)與革El基因3'端非翻譯區(qū) (untranslated region, UTR)互補結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA的切割降解，翻譯抑制或其他形式的 調(diào)節(jié)機制抑制靶基因的表達。目前已發(fā)現(xiàn)的人類microRNA已達1000多種，超過50%的 microRNA基因定位于腫瘤相關(guān)的染色體座位或其易感位點，并證實部分microRNA異常表 達與特定的腫瘤有著密切的關(guān)系，并參與了惡性腫瘤發(fā)展的多個過程，包括細胞分化、增 殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。
[0005] microRNA在NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移中起至關(guān)重要的作用。Grawford等將miRNA-126 轉(zhuǎn)染入肺鱗癌細胞系，與空白對照組及轉(zhuǎn)染入無序pre-microRNA的細胞相比，前者細胞的 侵襲和轉(zhuǎn)移能力下降。Yu等將高危險性（死亡危險比>1)的microRNA前體和保護性（死亡 危險比〈1)的microRNA前體分別轉(zhuǎn)染入低侵襲性和高侵襲性的肺癌細胞系中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入高 危險性microRNA的肺癌細胞系滲入基質(zhì)膠膜的侵襲性增強，而轉(zhuǎn)染保護性microRNA的肺 癌細胞系侵襲性降低，表明這些microRNA與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。Zhang等利用莖環(huán)狀反 轉(zhuǎn)錄實時PCR方法（stem-loop qRT-PCR)對20對NSCLC和癌旁組織的miR-21進行了定量， 并利用western blot技術(shù)檢測了 miR-21的靶基因 PTEN的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-21在NSCLC 中有較高的表達，而抑癌基因 PTEN的蛋白表達情況則相反，接著將載有miR-21轉(zhuǎn)錄抑制子 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSCLC細胞，結(jié)果顯著降低了細胞的生長和侵襲作用，表明miR-21的表達降低 了抑癌基因 PTEN的表達，促進了 NSCLC細胞的生長和侵襲。Zhu等的研宄也發(fā)現(xiàn)，miR-21 通過靶向多個腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，調(diào)控乳腺癌、肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。Wang等用microRNA芯 片技術(shù)篩選出了在肺癌和癌旁兩種細胞中有顯著表達差異的miR-183,并發(fā)現(xiàn)miR-183與 肺癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能負相關(guān)，推測其為潛在的轉(zhuǎn)移抑制因子，進一步的研宄發(fā)現(xiàn)，miR-183 的過表達抑制了肺癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。
[0006] microRNA的研宄不僅為腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的探明提供了新的思路和方法，而且在 臨床診療和預(yù)后評估方面顯示了很高的應(yīng)用價值。microRNA參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階 段，每一個階段都有相應(yīng)的microRNA發(fā)生變化。而且，microRNA具有很好的組織特異性， 經(jīng)篩查檢測48個microRNA確定腫瘤的組織來源準確率達90%。同時，microRNA又具有腫 瘤發(fā)生的階段特異性，同一種腫瘤在發(fā)生發(fā)展不同分期階段具有不同的microRNA表達譜。 因此，microRNA可以作為一種有效的腫瘤標志物用于癌癥的早期診斷、惡性分級、個性化診 療和預(yù)后判斷等，甚至可以作為腫瘤治療的靶點，指導(dǎo)臨床用藥。
[0007] 雖然腫瘤組織microRNA表達譜與腫瘤發(fā)病及預(yù)后相關(guān)，但是檢測技術(shù)復(fù)雜、創(chuàng)傷 大，難以真正用于臨床診斷，而外周血血清較易獲得和檢測，臨床應(yīng)用便捷，利于推廣，并且 microRNA在血清中能夠長期穩(wěn)定存在，不易被RNA酶降解，煮沸、反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境、長期 保存等極端條件均不會造成血清microRNA的損失。更重要的是，血清中microRNA表達譜 的變化與腫瘤的組織密切相關(guān)，能夠提示腫瘤的狀態(tài)。Chen等的研宄顯示，在非小細胞肺癌 血清中，miR-25和miR-223表達顯著上調(diào)。Ng等以血清miR-92作為分子標志物，可以診斷 I~IV期的結(jié)直腸癌，靈敏度可達89%，特異性達到70%。這充分體現(xiàn)了血清microRNA在 腫瘤診療中的應(yīng)用價值。
[0008] 本發(fā)明旨在利用hsa-miR-1280在癌組織和遠端正常組織敏感性和特異性方面的 比較，評估其作為臨床上非小細胞肺癌的早期診斷的可行性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明通過建立NSCLC患者病理和術(shù)后隨訪資料庫，建成組織樣本庫和血清樣本 庫200余例。其中有30例已經(jīng)取得術(shù)前、術(shù)后和復(fù)發(fā)后血清，每三個月進行回訪，并記錄 相應(yīng)隨訪資料。在已完成10對NSCLC癌及癌旁標本的microRNA芯片分析的基礎(chǔ)上，本研 宄將篩選具有差異表達的microRNA，并基于生物信息學(xué)分析以及RIP實驗技術(shù)確定其靶基 因，探明microRNA在NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機制，同時，篩查NSCLC患者不同的病理階 段時，血清中NSCLC轉(zhuǎn)移特異的microRNA標志物，為NSCLC轉(zhuǎn)移提供早期有效的監(jiān)控手段。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種miRNA，即hsa-miR-1280,其可用于在非小細胞肺癌 的檢測。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0012] (1)篩選NSCLC組織與對應(yīng)癌旁組織差異表達的microRNA ;
[0013] (2)生物信息學(xué)預(yù)測并鑒定microRNA的靶基因；
[0014] (3)考察差異microRNA對細胞生長的影響；
[0015] (4)研宄差異microRNA及其對應(yīng)靶基因在NSCLC腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。
[0016] (5)驗證NSCLC血清與非癌對照血清差異表達的microRNA，評估其作為血清NSCLC 候選標志物，用于NSCLC早期轉(zhuǎn)移診斷、療效監(jiān)控的可能性。
[0017] 更進一步地，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0018] (1)鞏固和完善NSCLC數(shù)據(jù)庫
[0019] A建立和整理NSCLC患者病理資料和術(shù)后隨訪資料數(shù)據(jù)庫，收集和整理患者的病 理檔案、術(shù)后治療方案及效果、術(shù)后生存情況等數(shù)據(jù)；
[0020] B建立和整理NSCLC組織樣本庫（已完成200例NSCLC組織樣本收集）；
[0021] C建立和整理NSCLC患者及對照人群的血液樣標本庫。
[0022] (2) NSCLC及癌旁組織差異microRNA的篩選
[0023] A樣本收集：選取臨床確診的NSCLC患者10例，取癌及對應(yīng)的癌旁組織，共20例 標本；
[0024] B樣本總RNA提?。翰捎每俁NA提取方法提取20例標本的總RNA ;
[0025] C利用microRNA提取試劑盒分離提取總RNA中的microRNA ;
[0026] D利用哺乳動物microRNA芯片（Affymetrix)，對收集到的20例標本的microRNA 樣品進行篩選實驗，共做20張芯片；
[0027] E應(yīng)用芯片統(tǒng)計分析軟件，分析癌組織和癌旁組織差異的microRNA。
[0028] (3)擴大樣本實驗驗證和microRNA的進一步篩選
[0029] A利用Real-timePCR技術(shù)驗證芯片實驗中癌與癌旁組織差異顯著的microRNA 結(jié)果，對這些microRNA進行生物信息學(xué)分析，選取8-10個與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的 microRNA，擴大肺癌組織樣本到100對進行驗證；
[0030] B根據(jù)上述NSCLC病例的病理學(xué)資料，對選取的8-10個microRNA進行分析，考察 在不同的病理分期的NSCLC患者中的表達量分布情況。
[0031] (4) RIP技術(shù)確定差異microRNA的靶基因，生物信息學(xué)查詢并參照文獻報道，預(yù)測 microRNA的功能，選取1-2個與NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的microRNA進行后續(xù)研宄。
[0032] (5)microRNA的Ientivirus過