一種保存生物樣品的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種保存生物樣品的方法及試劑盒，廣泛應(yīng) 用于生物學(xué)、化學(xué)及醫(yī)學(xué)檢測(cè)反應(yīng)中基因疾病的診斷、監(jiān)測(cè)、生物庫(kù)的建立、分子診斷、PCR 擴(kuò)增、法醫(yī)、遺傳鑒定等。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物遺傳物質(zhì)（GM)，其中包括人或動(dòng)物的生理/病理體液（分泌物、滲出液等）； 人或動(dòng)物的細(xì)胞懸液（血液、淋巴液、滑膜液、精液、唾液等）；植物的生理/病理體液或者 細(xì)胞懸液；細(xì)菌、真菌、質(zhì)粒、病毒、寄生蟲(chóng)等的提取液或者懸液；人或動(dòng)物機(jī)體組織（肝臟、 腎臟）提取液或者組織勻漿；DNA或者RNA合成過(guò)程的中間體；化學(xué)或生化合成的DNA/RNA 的混合物；其他任何可以提供液態(tài)GM的物質(zhì)。
[0003] 核酸是生物遺傳物質(zhì)，包括脫氧核糖核酸（DNA)及核糖核酸（RNA)。核酸檢測(cè)具有 現(xiàn)有分子檢測(cè)中最高的靈敏度及特異性，被廣泛用于以下幾個(gè)方面：傳染病病原微生物的 檢測(cè)、遺傳性疾病的診斷、血液中病毒的篩查、寄生蟲(chóng)疾病的診斷及監(jiān)測(cè)（瘧疾）、人身份鑒 定如法醫(yī)DNA分析及親子鑒定、腫瘤疾病引起的血液中其他非正常細(xì)胞增殖的監(jiān)測(cè)、食品 安全及GMO檢測(cè)、健康咨詢(xún)等。
[0004] 然而上述所有的應(yīng)用均首先涉及生物樣品檢材的采集，之后將生物樣品運(yùn)輸至檢 測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸提取及檢測(cè)。在這一系列的操作中面臨的最主要的問(wèn)題是如何有效保存 待檢生物樣品中的核酸使之不被降解，同時(shí)滅活生物樣品中可能帶有的病原微生物以確保 操作者及大眾的安全。
[0005] 目前國(guó)內(nèi)外使用最廣泛的生物樣品的保存方法是通過(guò)采集血液或者唾液樣品保 存至各類(lèi)保存卡上。商品化保存卡主要有英國(guó)Whatman公司生產(chǎn)的FTA系列保存卡。FTA 卡是Whatman專(zhuān)利產(chǎn)品，為在室溫下收集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存核酸提供了穩(wěn)妥、安全、可靠的方法。 FTA卡經(jīng)過(guò)專(zhuān)利的化學(xué)配方浸漬，含有獨(dú)特的化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)樣品吸附在卡上時(shí)，細(xì)胞膜和細(xì) 胞器被裂解，蛋白質(zhì)變性，釋放出的核酸被捕獲在FTA卡纖維上，使其免受核酸酶、氧化劑 和紫外線損傷及降解，在室溫條件下長(zhǎng)期穩(wěn)定地保存。FTA卡可以快速地使有機(jī)體（包括血 液中的各種病原體）失活，并抑制細(xì)菌和其它微生物生長(zhǎng)。樣品中的傳染性病原體在FTA 卡上5秒鐘內(nèi)失活。
[0006] 近期國(guó)內(nèi)一些企業(yè)紛紛致力于國(guó)產(chǎn)采集卡的研制，較有影響力的主要有天津諾維 萊博科技有限公司的DNA存儲(chǔ)卡、長(zhǎng)春市博坤生物科技有限公司的生物樣本采集卡等，其 基本核心技術(shù)都同F(xiàn)TA技術(shù)較類(lèi)似。
[0007] 英國(guó)Whatman公司的FTA系列保存卡可以在室溫條件下長(zhǎng)期穩(wěn)定地保存DNA使其 免受降解。但其有眾多不足之處，包括：
[0008] 1、樣品轉(zhuǎn)移效率低：指示型FTA卡的樣品采集棒的設(shè)計(jì)不利于樣品的采集和轉(zhuǎn) 移，實(shí)際操作過(guò)程中樣品的轉(zhuǎn)移效率低。
[0009] 2、直接擴(kuò)增技術(shù)受限：由于FTA卡設(shè)計(jì)的初衷是以核酸分離提取為前提，而隨著 核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，直接擴(kuò)增技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始普遍應(yīng)用于法醫(yī)DNA分析中，使得FTA卡在直 接擴(kuò)增技術(shù)方面受到一定的限制。
[0010] 3、FTA卡保存過(guò)程中易褪色：目前市場(chǎng)上的大部分保存卡都設(shè)計(jì)成粉紅色，顏色 單一，其利用pH值的改變來(lái)指示樣品，當(dāng)無(wú)色的樣品如唾液，接觸到粉紅色的保存卡后，樣 品區(qū)由于pH值發(fā)生變化而產(chǎn)生顏色變化，由原來(lái)的粉紅色變成白色，從而可以用來(lái)指示樣 品區(qū)域。然而該方法仍存在一個(gè)問(wèn)題，即濾紙卡在空氣中保存的過(guò)程中隨著保存時(shí)間的延 長(zhǎng)及受保存條件、環(huán)境溫度、環(huán)境濕度、以及空氣中C02含量的影響，從而導(dǎo)致濾紙卡pH值 發(fā)生改變，粉紅色的樣品保存卡極易發(fā)生褪色現(xiàn)象。
[0011] 4、使用成本高：FTA卡是Whatman專(zhuān)利產(chǎn)品，價(jià)格昂貴，使用成本相當(dāng)高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種操作簡(jiǎn)便、樣品轉(zhuǎn)移 效率高、能更有效殺滅細(xì)菌、病毒的生物樣品保存方法及試劑盒，可以使用直接擴(kuò)增技術(shù)廣 泛應(yīng)用于法醫(yī)市場(chǎng)DNA分析。同時(shí)由于本發(fā)明含有顏色指示劑的功能性溶液為密封保存， 保存時(shí)間不受保存條件的限制，因此可保證長(zhǎng)期保存不發(fā)生褪色現(xiàn)象。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0014] -種保存生物樣品的方法及試劑盒，將吸附有生物樣品的采集工具與功能性溶液 充分混合，將混合后生物樣品轉(zhuǎn)印至濾紙卡上保存；所述功能性溶液包括緩沖溶液、絡(luò)合 劑、抗菌劑、顏色指示劑和抗氧化劑。
[0015] 優(yōu)選的，所述緩沖溶液為pH6~10的緩沖溶液。
[0016] 優(yōu)選的，所述絡(luò)合劑為氨基羧酸鹽、羥基羧酸鹽、有機(jī)膦酸鹽或聚丙烯酸類(lèi)絡(luò)合劑 等。
[0017] 優(yōu)選的，所述抗菌劑為陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、兩性離子型表面活 性劑、非離子型表面活性劑、烷基胍表面活性劑、抗生素、防腐劑、EDTA等。
[0018] 優(yōu)選的，所述顏色指示劑為有色染料、氧化還原指示劑、金屬指示劑、鈣指示劑、天 然pH指示劑、生物指示劑等。
[0019] 優(yōu)選的，所述抗氧化劑為丁基羥基茴香醚（BHA)、二丁基羥基甲苯（BHT)、沒(méi)食子 酸丙酯（PG)、混合生育酚濃縮物及愈創(chuàng)樹(shù)脂、抗壞血酸及其鈉鹽、異抗壞血酸及其鈉鹽、硫 辛酸、維生素E，類(lèi)胡蘿卜素、枸櫞酸、EDTA、磷酸衍生物、甲基硅酮、亞硫酸及其鈉鹽。
[0020] 優(yōu)選的，所述樣品為人或動(dòng)物的生理/病理體液、細(xì)胞懸液；人或動(dòng)物機(jī)體組織提 取液或者組織勻漿；植物的生理/病理體液或者細(xì)胞懸液；細(xì)菌、真菌、質(zhì)粒、病毒、寄生蟲(chóng) 等的提取液或者懸液；DNA或者RNA合成過(guò)程的中間體；化學(xué)或生化合成的DNA或者RNA的 混合物；其他任何可以提供液態(tài)遺傳物質(zhì)。
[0021] 優(yōu)選的，所述緩沖溶液濃度< 600mM;所述絡(luò)合劑濃度為< 60mM;所述抗菌劑濃度 彡120mg/mL;所述顏色指示劑濃度為彡1%;所述抗氧化劑濃度彡180mM。
[0022] 優(yōu)選的，所述緩沖溶液濃度為240mM-480mM;所述絡(luò)合劑濃度為10mM-30mM;所述 抗菌劑濃度為45mg/mL-90mg/mL;所述顏色指示劑濃度為0. 02% ;所述抗氧化劑濃度為 30mM-60mM〇
[0023]本發(fā)明還提供一種保存生物樣品的試劑盒，包括功能性溶液，所述功能性溶液包 括緩沖溶液、絡(luò)合劑、抗菌劑、顏色指示劑和抗氧化劑。
[0024] 優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括濾紙卡和/或采集工具。
[0025] 優(yōu)選的，所述的濾紙卡為普通濾紙卡。
[0026] 優(yōu)選的，所述采集工具為醫(yī)用采集工具。
[0027] 本發(fā)明提供了一種保存生物樣品的方法，使用采集工具采集生物樣品，之后將吸 附有生物樣品的采集工具置于功能性溶液中充分混合，最后將混合后生物樣品轉(zhuǎn)印至濾紙 卡上保存，其中所述功能性溶液包括緩沖溶液、絡(luò)合劑、抗菌劑、顏色指示劑、抗氧化劑。與 現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述保存生物樣品的方法，采集的生物樣品經(jīng)過(guò)一步混合操作，再轉(zhuǎn) 印至普通濾紙卡上，即可達(dá)到快速安全有效的保存生物樣品中遺傳物質(zhì)的目的，無(wú)需使用 制作成本高、價(jià)格昂貴的FTA卡，并具有操作簡(jiǎn)便、樣品轉(zhuǎn)移效率高、能更有效殺滅細(xì)菌、病 毒的特點(diǎn)。本發(fā)明所述功能性溶液能夠與生物樣品中的細(xì)胞發(fā)生作用，抗菌劑使細(xì)胞膜破 裂、細(xì)胞核裂解，從而釋放出細(xì)胞核中的核酸，還能夠保證各類(lèi)核酸長(zhǎng)期保存，同時(shí)具有滅 菌作用，能夠及時(shí)殺滅生物樣品中可能存在的病原微生物，從而保證操作人員的安全性。此 外本發(fā)明含有顏色指示劑的功能性溶液為密封保存，保存時(shí)間不受保存條件的限制，因此 可保證長(zhǎng)期保存不發(fā)生褪色現(xiàn)象。
[0028] 本發(fā)明所述試劑盒不含有毒試劑、適用范圍廣，保存各類(lèi)生物樣品的效果優(yōu)于市 場(chǎng)上的大部分保存卡，而且成本低，適用于廣大的實(shí)驗(yàn)室和科研工作。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1示熒光定量PCR擴(kuò)增圖，其中