一種用于毛蚶家系鑒定的多重pcr方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)動(dòng)物家系鑒定方法，特別是涉及了一種采用多重PCR進(jìn)行毛 蚶家系鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 家系鑒定又稱為系譜分析，是對(duì)個(gè)體間親緣關(guān)系的一種判斷分析。了解一個(gè)群體 的系譜特征，不僅在群體遺傳學(xué)，保護(hù)遺傳學(xué)，生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域內(nèi)具有重要的理論意義，而且 在良種培育、種質(zhì)資源保護(hù)、人工放流苗種標(biāo)記等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 微衛(wèi)星標(biāo)記是一種共顯性的分子標(biāo)記，具有變異程度高，在基因組中分布廣泛，符 合孟德爾遺傳，易于PCR擴(kuò)增等特點(diǎn)，是家系鑒定中最常使用的分子標(biāo)記。利用微衛(wèi)星標(biāo)記 進(jìn)行家系鑒定，傳統(tǒng)的分析方法是對(duì)每個(gè)標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳分析，利用銀染的方式對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行顯色，進(jìn)而獲得所需要的目的條帶。這種方法一方 面存在處理通量低的問(wèn)題，不適合于大量樣本的分析，另一方面，基于聚丙烯酰胺凝膠電泳 的微衛(wèi)星基因型分型的精度，也滿足不了家系鑒定對(duì)基因型分型的精確要求，尤其在樣本 量較大的情況下，為避免隨機(jī)誤差造成的影響，對(duì)分析方法的要求也更為嚴(yán)格。目前，利用 多重PCR的方式，使用熒光標(biāo)記引物，結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)，提高處理通量和分型精度，實(shí) 現(xiàn)數(shù)據(jù)的自動(dòng)判讀，是目前微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用的一個(gè)主流趨勢(shì)。
[0004] 相比于凝膠電泳，毛細(xì)管電泳使用液態(tài)基質(zhì)，具有速度快，精讀高，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)上 樣的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)。毛細(xì)管電泳采用熒光標(biāo)記的方式對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分，不同的熒光染料在被激 光激發(fā)后，會(huì)釋放出不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，利用虛擬濾鏡技術(shù)，可使得不同熒光獲得區(qū)分。 這樣，在同一根毛細(xì)管中可以同時(shí)混合多個(gè)位點(diǎn)，大大增加了處理通量。
[0005] 多重PCR技術(shù)是通過(guò)一個(gè)PCR反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或者兩個(gè)以上標(biāo)記位點(diǎn)的技 術(shù)手段。相比于普通PCR，多重PCR的技術(shù)優(yōu)勢(shì)顯而易見(jiàn)，不僅可以提高檢測(cè)的速度和通 量，而且能夠有效節(jié)約時(shí)間和成本。在水產(chǎn)動(dòng)物的常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)種類中，如海鱸 japonicus、，欠菱齊QScophthalmusmaximus)，嚴(yán)存、JL見(jiàn)驗(yàn)QIetalurusPunetaus)等，均版 功的開發(fā)出了多重PCR反應(yīng)試劑盒，并在生產(chǎn)實(shí)踐中獲得了應(yīng)用。
[0006] 作為我國(guó)黃勸海的習(xí)見(jiàn)種，毛紺sMcreaate)長(zhǎng)期以來(lái)都是北方沿海 重要經(jīng)濟(jì)種類。近年來(lái)，由于資源過(guò)渡開發(fā)和利用，我國(guó)毛蚶的自然資源面臨著巨大的壓 力，毛蚶目前已經(jīng)被列為黃渤海人工增殖放流的品種之一，相關(guān)的良種培育工作也已經(jīng)開 始實(shí)施。基于上述情況，獲得足夠數(shù)目，滿足育種及放流標(biāo)記實(shí)際要求的毛蚶微衛(wèi)星多重 PCR體系具有現(xiàn)實(shí)緊迫性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種高通量、準(zhǔn)確率高的采用加尾引物進(jìn)行 毛蚶家系鑒定的多重PCR方法，可快速、準(zhǔn)確的對(duì)未知親緣關(guān)系的毛蚶親本與子代間進(jìn)行 豕系鑒定。
[0008] 本發(fā)明具體的技術(shù)方案如下： 一種用于毛蚶家系鑒定的多重PCR方法，其特征在于包括如下步驟：提取親本和子代DNA，按照下表中的序列合成正向引物，反向引物或反向加尾引物，以及帶熒光標(biāo)記的M13 (-21)通用引物；
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于毛蚶家系鑒定的多重PCR方法，其特征在于包括如下步驟：提取親本和 子代DNA ;按照下表中的序列合成正向引物，反向引物或反向加尾引物，以及帶熒光標(biāo)記的 M13(-21)通用引物；
使用合成的引物對(duì)及帶熒光標(biāo)記的M13(-21)通用引物，對(duì)提取的DNA樣本進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，獲得親本和子代基因型數(shù)據(jù)；對(duì)親本和子代進(jìn) 行親緣關(guān)系鑒定。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述正向引物的5'端添加 M13 (-21)通用引物序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述反向加尾引物的5'端添加序 列 GAGCGGATAACAATTTC。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述熒光標(biāo)記為FAM，VIC，NED， PET中的一種；熒光標(biāo)記被添加在單獨(dú)合成的M13 (-21)通用引物序列的5'端。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述多重PCR擴(kuò)增按照下表所述 的體系和條件進(jìn)行，
每組多重PCR反應(yīng)體系中，均加入帶有一種熒光標(biāo)記的M13 (-21)序列0. 15 μ Μ。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的多重PCR方法，其特征在于所述多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程 序分為兩步，前35個(gè)循環(huán)使用54°C的退火溫度，后8個(gè)循環(huán)使用53°C的退火溫度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述對(duì)親本和子代進(jìn)行親緣關(guān)系 鑒定的方法是對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管熒光電泳，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò) 軟件對(duì)親緣關(guān)系進(jìn)行分析。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的多重PCR方法，其特征在于所述的軟件為Genemapper和 Cervus0
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于毛蚶家系鑒定的多重PCR方法，該方法包括如下步驟：提取親本和子代DNA；使用11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)及帶熒光標(biāo)記的M13（-21）通用引物，對(duì)提取的DNA樣本進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，獲得親本和子代基因型數(shù)據(jù)；對(duì)親本和子代進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定。本發(fā)明的方法適用于進(jìn)行大范圍增殖放流群體親本與子代間遺傳關(guān)系的確認(rèn)，以及大規(guī)模的人工良種培育實(shí)驗(yàn)，具有快速、準(zhǔn)確、高通量的特點(diǎn)。通過(guò)微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定所獲得的譜系記錄，不僅可以為毛蚶的良種培育提供有利的輔助育種手段，而且可以為評(píng)估增殖放流效果提供有力的技術(shù)支持。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104651525
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510113198
【發(fā)明人】李琪, 陳辰, 于紅
【申請(qǐng)人】中國(guó)海洋大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年3月15日