焦慮癥生物標(biāo)記物、篩選方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及焦慮癥生物標(biāo)記物、篩選方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 廣泛焦慮障礙（GAD)是一種以對(duì)許多事件或情境過(guò)分的和不可控制的擔(dān)憂(yōu)為特 征的慢性疾病，同時(shí)伴有軀體癥狀，例如坐立不安，肌緊張，易激惹，注意集中困難和睡眠障 礙等。GAD在普通人群中的年患病率為0.8-2. 7%，已成為主要的公眾健康問(wèn)題。此外， GAD通常還伴有其他精神障礙（如：抑郁、其他焦慮障礙等）和軀體疾?。ㄈ纾盒难芗膊　?神經(jīng)系統(tǒng)疾病等）。50%的焦慮癥患者合并其它精神障礙，例如抑郁。
[0003] 已有研宄表明，焦慮癥病人若能早期明確診斷并及時(shí)得到有效治療，可以顯著改 善患者的心理、生理、社會(huì)功能以及工作效率，并大大減少治療費(fèi)用。然而，目前對(duì)焦慮癥的 診斷仍是依靠其臨床癥狀的主觀評(píng)估，缺乏有效的客觀診斷"金標(biāo)準(zhǔn)"，因而在臨床上誤診、 誤治時(shí)有發(fā)生。另一方面，由于事先未知患者對(duì)哪種藥物敏感，臨床上不得不用"試錯(cuò)法"給 藥，這不僅影響患者的治療效果，而且降低其服藥依從性，并造成巨大的資源浪費(fèi)。因此，有 必要研發(fā)一種具有敏感性和特異性的生物標(biāo)志物，來(lái)提高焦慮癥的診斷科學(xué)性，并對(duì)其亞 型加以區(qū)分，以便于有針對(duì)性地進(jìn)行藥物干預(yù)和開(kāi)展臨床科學(xué)研宄。
[0004]miRNA是一種小分子的非編碼RNA，長(zhǎng)度為大約為22個(gè)堿基。miRNA的生成包括 兩步剪切：首先細(xì)胞核內(nèi)的miRNA基因轉(zhuǎn)錄成pri-miRNA，由細(xì)胞核內(nèi)的酶DroshaRNase將 其剪切成miRNA前體pre-miRNA。核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，然后在細(xì) 胞質(zhì)中的另一種酶Dicer把miRNA前體剪切成雙鏈miRNA，通過(guò)部分或完全地與靶mRNA的 3'非翻譯區(qū)（3'UTR)互補(bǔ)配對(duì)，阻止其翻譯或使其降解，從而起到基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的作用。 約有50%的蛋白質(zhì)編碼基因受到miRNA的精確調(diào)控，多個(gè)miRNA分子可以共同調(diào)節(jié)一個(gè)基 因的表達(dá)，一個(gè)miRNA分子亦可調(diào)控?cái)?shù)百、上千個(gè)基因的表達(dá)。越來(lái)越多的研宄證明，在大 腦的發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元成熟及突觸形成過(guò)程中，miRNA起關(guān)鍵的調(diào)控作用。進(jìn)一步的 研宄表明，焦慮癥的發(fā)生、發(fā)展中，miRNA亦起重要作用，并與抗焦慮藥物的療效有相關(guān)性。 因此，某些MicroRNA可成為焦慮癥診斷和預(yù)測(cè)抗焦慮藥物治療效果的生物標(biāo)記物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供焦慮癥生物標(biāo)記物。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：焦慮癥生物標(biāo)記物，所述標(biāo)記 物包括miRNA-1301、miRNA-4484、miRNA-4674、miRNA-501-3p、miRNA-663B和miRNA-4505。
[0007] 在本發(fā)明的第二方面，提供了上述焦慮癥生物標(biāo)記物的篩選方法，包括以下步驟： 取適量受試者血液，從中提取總RNA，并檢測(cè)提取到的總RNA濃度；通過(guò)miRNA芯片篩查出 差異性表達(dá)的7種miRNA;選取若干例焦慮癥患者，設(shè)為病例組；選取若干例健康對(duì)照者，設(shè) 為對(duì)照組；分別采集血樣，提取出單核淋巴細(xì)胞中的總RNA后進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄和熒光 定量PCR檢測(cè)，所得數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，得到兩組間表達(dá)水平有顯著性差異的 miRNA-1301、miRNA-4484、miRNA-4674、miRNA-501-3p、miRNA-663B和miRNA-4505。
[0008] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種焦慮癥診斷試劑盒，其能夠測(cè)定血液中 miRNA-1301、miRNA-4484、miRNA-4674、miRNA-501-3p、miRNA-663B和miRNA-4505 的表達(dá)水 平。
[0009] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述試劑盒含有miRNA-1301、miRNA-4484、 miRNA-4674、miRNA-501-3p、miRNA-663B和miRNA-4505 的引物探針。
[0010] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述引物探針的序列如SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQ IDNO. 3、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5 和SEQIDNO. 6 所示。
[0011] 所述診斷試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用試劑，如Taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液， dNTPs，MgCljPDEPC水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了序列如SEQIDN0. 1、SEQIDN0. 2、SEQID NO. 3、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6所示引物探針的用途，其用于制備焦慮癥 診斷試劑盒。
[0013] 在本發(fā)明的第四方面，提供了一種預(yù)測(cè)抗焦慮藥物療效的生物標(biāo)記物，所述標(biāo)記 物包括miRNA-1301、miRNA-4484、miRNA-663B和miRNA-4505。
[0014] 在本發(fā)明的第五方面，提供了上述預(yù)測(cè)抗焦慮癥藥物療效生物標(biāo)記物的篩選方 法，包括以下步驟：取適量受試者血液，從中提取總RNA，并檢測(cè)提取到的總RNA濃度；通過(guò)miRNA芯片篩查出差異性表達(dá)的miRNA;選取若干例焦慮癥患者進(jìn)行臨床藥物干預(yù)隨訪(fǎng)觀 察，對(duì)選取得到的患者分別施以臨床常用的抗焦慮藥，在用藥前和用藥六周后分別采集血 樣，提取出單核淋巴細(xì)胞中的總RNA后進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè)，所得數(shù)據(jù) 使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，得到用藥前后表達(dá)水平有顯著性差異的miRNA。
[0015] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種預(yù)測(cè)抗焦慮癥藥物療效的生物標(biāo)記物檢測(cè)試劑 盒，其能夠測(cè)定血液中miRNA-1301、miRNA-4484、miRNA-663B和miRNA-4505的表達(dá)水平。
[0016]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述試劑盒含有miRNA-1301、miRNA-4484、 miRNA-663B和miRNA-4505 的引物探針。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，上述引物探針的序列如SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQ IDNO. 5 和SEQIDNO. 6 所示。
[0018] 所述試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用試劑，如Taq酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs， MgClJPDEPC水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了序列如SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDN0. 5 和SEQIDNO. 6所示引物探針的用途，其用于制備預(yù)測(cè)抗焦慮癥藥物療效的試劑盒。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0021] 1、焦慮癥的診斷將不再只是主觀經(jīng)驗(yàn)判斷，而是可以通過(guò)microRNA這種客觀指 標(biāo)檢查，進(jìn)行確診，提高診斷準(zhǔn)確率，簡(jiǎn)化診斷過(guò)程；
[0022] 2、有望通過(guò)miRNA模擬物和拮抗物（修飾寡核苷酸）改變特定miRNA表達(dá)水平能 夠使異常的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路正?；M(jìn)而治療焦慮癥；
[0023] 3、有望通過(guò)檢測(cè)特定miRNA表達(dá)水平對(duì)焦慮癥的用藥療效進(jìn)行預(yù)測(cè)；
[0024] 4、有望通過(guò)檢測(cè)特定miRNA表達(dá)水平對(duì)焦慮癥患者轉(zhuǎn)歸及預(yù)后情況進(jìn)行預(yù)測(cè)；
[0025] 5、有望通過(guò)miRNA模擬物和拮抗物對(duì)特定焦慮癥某種特定癥狀進(jìn)行針對(duì)性治療。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為焦慮癥與抑郁癥患者miRNA_26b的ROC曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 一、研宄對(duì)象
[0028] 1.病例組：2012年8月至2014年6月于中國(guó)人民解放軍第102醫(yī)院門(mén)診以及精神 科病房連續(xù)收治的病人。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國(guó)精神疾病診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第4版（DSM-IV) GAD標(biāo)準(zhǔn)；②首發(fā)病人或入組前3個(gè)月未服抗焦慮藥物；③年齡15~80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 患有其他精神疾病；②患有腦外傷等軀體或神經(jīng)系統(tǒng)疾??；③有酗酒或藥物濫用史；④入 組前1個(gè)月內(nèi)有輸血史；⑤入組前3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)無(wú)抽搐電休克治療者（MECT)。共入組76 例患者，其中男性19例，女性57例。
[0029] 2.對(duì)照組：來(lái)自解放軍第102醫(yī)院工作人員、健康體檢人員，除一例性別不匹配 外，其余與病例組年齡、性別和民族一一匹配，最大限度排除了性別、年齡和民族等因素帶 來(lái)的誤差。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)精神疾病家族史；②近1個(gè)月內(nèi)無(wú)重大創(chuàng)傷事件；③近1月內(nèi)無(wú) 輸血史。共入組39例，其中男性10例，女性29例。
[0030] 在開(kāi)展研宄前，首先對(duì)參加本課題的精神專(zhuān)科醫(yī)師和研宄生進(jìn)行培訓(xùn)。采用漢密 頓焦慮量表（HAMA)、大體評(píng)定量表（GAS)在病例入組前、藥物治療3周后、藥物治療6周后 分別進(jìn)行評(píng)估。由兩位精神科主治醫(yī)師根據(jù)DSM-IV-TR對(duì)患者進(jìn)行診斷，如果出現(xiàn)不一致 情況，則請(qǐng)一位精神科主任醫(yī)師共同討論后確定診斷。
[0031] 入組時(shí)記錄一般情況（姓名、性別、年齡、民族、文化程度、職業(yè)、收入水平、婚姻狀 況、藥物成癮史及精神疾病家族史等）。同樣，記錄正常對(duì)照組一般情況。
[0032] 本研宄獲得中國(guó)人民解放軍第102醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者或受試 家屬（監(jiān)護(hù)人）均簽署知情同意書(shū)。。
[0033] 二、研宄方法
[0034] ①使用量表
[0035] 漢密頓焦慮量表（HAMA):由Hamilton于1959年編制，是目前最經(jīng)典的焦慮量表， 能夠很好地衡定治療效果，現(xiàn)已在臨床和研宄中廣泛應(yīng)用。該量表主要用于評(píng)定神經(jīng)癥及 其他病人焦慮癥狀的嚴(yán)重程度，共有14個(gè)條目，分為5級(jí)評(píng)分（0~4分），能夠較好地反映 病情嚴(yán)重程度。本研宄中使用HAMA量表的中文版本進(jìn)行評(píng)估，該版本經(jīng)信效度檢驗(yàn)分析， 達(dá)到心理測(cè)量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。本文使用HAMA總分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0036] 大體評(píng)定量表（GAS):大體評(píng)定量表是評(píng)價(jià)各類(lèi)精神疾病癥狀的量表，在同類(lèi)量 表中是應(yīng)用最廣泛的一種。本研宄使用的是美國(guó)心理衛(wèi)生研宄所（NMH) 1976年的Spitzer 版本，共有10級(jí)評(píng)定分（1~10分），根據(jù)患者臨床癥狀進(jìn)行評(píng)定?？偡衷礁撸f(shuō)明病情越 輕。本研宄中使用GAS量表的中文版本進(jìn)行評(píng)估，該版本經(jīng)信效度檢驗(yàn)分析，達(dá)到心理測(cè)量 學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。
[0037] 臨床療效總評(píng)量表（CGI):臨床療效總評(píng)量表由WHO設(shè)計(jì)，用于國(guó)際精神疾病試點(diǎn) 調(diào)查（IPSS)的研宄，現(xiàn)用以評(píng)定臨床療效，適用于任何精神科治療和研宄對(duì)象。量表分為 病情嚴(yán)重程度（severityofillness，SI)，療效總評(píng)（globalimprovement，GI)和療效指 數(shù)（efficacyindex，EI)三個(gè)分量表。本研宄中使用CGI量表的中文版本進(jìn)行評(píng)估，該版 本經(jīng)信效度檢驗(yàn)分析，達(dá)到心理測(cè)量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。本研宄中使用疾病嚴(yán)重程度分（severityof illness，SI)和療效總評(píng)分（globalimprovement，GI)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0038] ②資料收集
[0039] 入組時(shí)記錄一般情況（姓名、性別、年齡、民族、文化程度、職業(yè)、收入水平、婚姻狀 況、藥物成癮史及精神疾病家族史等）。由3名精神科主治醫(yī)師或醫(yī)師使用漢密頓焦慮量表 (HAMA)和臨床療效總評(píng)量表（CGI)于用藥前及用藥6周以上對(duì)病例組被試進(jìn)行評(píng)定。評(píng)定 前，所有參與研宄人員進(jìn)行統(tǒng)一培訓(xùn)，統(tǒng)一方法等，標(biāo)準(zhǔn)化施測(cè)過(guò)程。其中HAMD使用總分和 因子分統(tǒng)計(jì)，CGI使用療效總評(píng)分（globalimprovement,GI)統(tǒng)計(jì)。
[0040] ③藥物干預(yù)
[0041] 在76例病例中，隨機(jī)選取11例進(jìn)行臨床藥物干預(yù)隨訪(fǎng)觀察。對(duì)其采用每日服用 文拉法辛（劑量范圍150mg-225mg)、舍曲林（劑量范圍50m