一種鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種的引物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種的引物及 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是最嚴(yán)重的流行性傳染疾病之一，使人類的公共健康面臨著巨大的挑戰(zhàn)， 它在全世界范圍內(nèi)有著相當(dāng)高的致病率和致死率。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTBC)中的一些 菌種是引發(fā)人類和動(dòng)物結(jié)核病的病原菌。引起人類結(jié)核病的主要病原菌即結(jié)核分枝桿菌 (M.tuberculosis)起源于大約3百萬(wàn)年前，并因耐藥株的出現(xiàn)持續(xù)影響著人類健康。除了 結(jié)核分枝桿菌，在病人體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了MTBC中的其它菌種，包括牛型分枝桿菌（M.bovis)、 肯尼迪分枝桿菌（M.canetii)、非洲分枝桿菌（M.africanumsubtypeI)、山羊分枝桿菌 (M.caprae)、田鼠分枝桿菌（M.microti)。其中牛型分枝桿菌是牛結(jié)核病的主要病原菌，由 于直接與牛接觸或食用未消毒的奶制品致使人類的感染?？夏岬戏种U菌、非洲分枝桿菌、 山羊分枝桿菌、田鼠分枝桿菌均常見(jiàn)于非洲病人體內(nèi)。
[0003] 傳統(tǒng)的鑒定MTBC菌種的方法是根據(jù)菌落形態(tài)、氧偏好性、煙酸累積、硝酸鹽還原 酶的活性以及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)等的表型特征來(lái)判斷，這些方法都制約于緩慢的細(xì)菌培養(yǎng)，而且 涉及主觀解讀易于判錯(cuò)。傳統(tǒng)的鑒定方法由于時(shí)間長(zhǎng)等原因已不能滿足當(dāng)前的臨床需要， 因此快速鑒定MTBC中的成員，對(duì)于控制傳染源和早期治療起著至關(guān)重要的作用，也可為臨 床治療提供用藥指導(dǎo)。
[0004]現(xiàn)今的分子鑒別方法主要有IS6110-RFLP，MIRU-VNTR、Spoligotyping和SNP。 IS6110-RFLP應(yīng)用廣泛，分辨率較高，但該方法基于大量菌株的培養(yǎng)，價(jià)格高，時(shí)間長(zhǎng)且 IS6110拷貝數(shù)較少的菌株不易分型；MIRU-VNTR不需要大量培養(yǎng)菌株，結(jié)果容易讀識(shí)，但由 于位點(diǎn)組合不同，其分辨率和成簇率亦不盡相同；Spoligotyping分型方法用時(shí)較短，成本 較低，但分辨率較低，圖片結(jié)果易產(chǎn)生假陽(yáng)性；SNP需要測(cè)序，價(jià)格昂貴，不能在實(shí)驗(yàn)室間推 廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種的成套引物。
[0006] 本發(fā)明提供的鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種的成套引物，由引物對(duì)（1)_(7)組 成：
[0007] (1)為由SEQID No.1所示的單鏈DNA和SEQID No. 2所示的單鏈DNA組成的引 物對(duì)1 ;
[0008] (2)為由SEQID No. 3所示的單鏈DNA和SEQID No. 4所示的單鏈DNA組成的引 物對(duì)2 ;
[0009] (3)為由SEQID No. 5所示的單鏈DNA和SEQID No.6所示的單鏈DNA組成的引 物對(duì)3 ;
[0010] (4)為由SEQIDNo. 7所示的單鏈DNA和SEQIDNo. 8所示的單鏈DNA組成的引 物對(duì)4;
[0011] (5)為由SEQIDNo. 9所示所示的單鏈DNA和SEQIDNo. 10所示的單鏈DNA組成 的引物對(duì)5;
[0012] (6)為由SEQIDNo. 11所示的單鏈DNA和SEQIDNo. 12所示的單鏈DNA組成的 引物對(duì)6;
[0013] (7)為由SEQIDNo. 13所示的單鏈DNA和SEQIDNo. 14所示的單鏈DNA組成的 引物對(duì)7。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種的PCR試劑組。
[0015] 本發(fā)明提供的鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種的PCR試劑組由PCR試劑1、PCR試劑 2、PCR試劑3、PCR試劑4、PCR試劑5、PCR試劑6和PCR試劑7組成。
[0016] 上述PCR試劑組中，所述PCR試劑1包括上述成套引物中的引物對(duì)1 ;所述PCR試 劑2包括上述成套引物中的引物對(duì)2;所述PCR試劑3包括上述成套引物中的引物對(duì)3;所 述PCR試劑4包括上述成套引物中的引物對(duì)4;所述PCR試劑5包括上述成套引物中的引 物對(duì)5;所述PCR試劑6包括上述成套引物中的引物對(duì)6;所述PCR試劑7包括上述成套引 物中的引物對(duì)7。
[0017]上述PCR試劑組中，所述引物對(duì)1、引物對(duì)2、引物對(duì)3、引物對(duì)4、引物對(duì)5、引物對(duì) 6或引物對(duì)7中的各條引物的物質(zhì)的量相同。
[0018] 上述成套引物中各個(gè)引物對(duì)獨(dú)立包裝，各條引物獨(dú)立包裝。
[0019] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種用于鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種的試劑盒。
[0020] 本發(fā)明提供的用于鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種的試劑盒，其含有上述的成套引 物或含有上述的PCR試劑組。
[0021] 上述的成套引物或上述的PCR試劑組或上述的試劑盒在制備鑒別或輔助鑒別待 測(cè)菌株是否為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022] 上述的成套引物或上述的PCR試劑組或上述的試劑盒在鑒別或輔助鑒別待測(cè)菌 株是否為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023] 上述的成套引物或上述的PCR試劑組或上述的試劑盒在制備鑒別或輔助鑒別待 測(cè)菌株為結(jié)核分枝菌復(fù)合群菌種7種中哪一種的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 上述的成套引物或上述的PCR試劑組或上述的試劑盒在鑒別或輔助鑒別待測(cè)菌 株為結(jié)核分枝菌復(fù)合群菌種7種中哪一種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種鑒別或輔助鑒別待測(cè)菌株為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合 群菌種7種中哪一種的方法。
[0026] 本發(fā)明提供的鑒別或輔助鑒別待測(cè)菌株為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種中哪一種的 方法包括如下步驟：以上述的成套引物中的7種引物對(duì)分別對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各自 引物對(duì)對(duì)應(yīng)的所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0027] 若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足如下1):所述引物對(duì)1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為975bp 的片段（或所述引物對(duì)1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是975bp的片段）、所述引物對(duì)2的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為588bp的片段（或所述引物對(duì)2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是588bp的片 段）、所述引物對(duì)3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為466bp的片段（或所述引物對(duì)3的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物為大小是466bp的片段）、所述引物對(duì)4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為802bp的片段 (或所述引物對(duì)4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是802bp的片段）、所述引物對(duì)5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 含有大小為711bp的片段（或所述引物對(duì)5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是711bp的片段）、所述 弓丨物對(duì)6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為1055bp的片段（或所述引物對(duì)6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為 大小是1055bp的片段）且所述引物對(duì)7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為321bp的片段（或所 述引物對(duì)7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是321bp的片段），則待測(cè)菌株為或候選為結(jié)核分枝桿菌 復(fù)合群的結(jié)核分枝桿菌M. tuberculosis ;
[0028] 若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足如下2):所述引物對(duì)1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為975bp 的片段（或所述引物對(duì)1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是975bp的片段）、所述引物對(duì)2的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為588bp的片段（或所述引物對(duì)2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是588bp的片 段）、所述引物對(duì)3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為466bp的片段（或所述引物對(duì)3的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物為大小是466bp的片段）、所述引物對(duì)4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為802bp的片段 (或所述引物對(duì)4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是802bp的片段）、所述引物對(duì)5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 含有大小為711bp的片段（或所述引物對(duì)5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是711bp的片段）、所述 弓丨物對(duì)6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為1055bp的片段（或所述引物對(duì)6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為 大小是1055bp的片段）且所述引物對(duì)7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有大小為321bp的片段（或 所述引物對(duì)7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不為大小是321bp的片段），則待測(cè)菌株為或候選為結(jié)核分枝 桿菌復(fù)合群的肯尼迪分枝桿菌M. canetii ;
[0029] 若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足如下3):所述引物對(duì)1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為975bp 的片段（或所述引物對(duì)1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是975bp的片段）、所述引物對(duì)2的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為588bp的片段（或所述引物對(duì)2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是588bp的片 段）、所述引物對(duì)3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為466bp的片段（或所述引物對(duì)3的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物為大小是466bp的片段）、所述引物對(duì)4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為802bp的片段 (或所述引物對(duì)4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是802bp的片段）、所述引物對(duì)6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 含有大小為l〇55bp的片段（或所述引物對(duì)6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是1055bp的片段）、所 述引物對(duì)7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為321bp的片段（或所述引物對(duì)7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為 大小是321bp的片段）且所述引物對(duì)5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不含有大小為711bp的片段（或所 述引物對(duì)5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不為大小是711bp的片段），則待測(cè)菌株為或候選為結(jié)核分枝桿 菌復(fù)合群的非洲分枝桿菌M.africanum;
[0030]若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足如下4):所述引物對(duì)1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為975bp 的片段（或所述引物對(duì)1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為大小是975bp的片段）、所述引物對(duì)2的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為588bp的片段（或