標(biāo)志物及其應(yīng)用、試劑盒、該標(biāo)志物的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及標(biāo)志物及其應(yīng)用、試劑盒、該標(biāo)志物的檢測方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] RA，rheumatoid arthritis，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，是一種常見的慢性且很難治愈的疾病 (占世界人口的1 %左右），能導(dǎo)致全身關(guān)節(jié)不可逆性損壞，發(fā)病末期能導(dǎo)致殘疾（約占1/4 患者），使患者喪失工作能力，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，對患者和社會產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。 據(jù)報導(dǎo)，采用生物制劑治療RA的患者，每年治療費(fèi)用將近要9萬元左右。早期診斷與早期 治療是緩解RA的關(guān)鍵。目前用于臨床RA診斷的方法很多，ACR2010分類標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定除了關(guān) 節(jié)受累數(shù)量和病程外，生物因子如RF，CCP，CRP等的含量與RA緊密相關(guān)。但是目前臨床采 納的多指標(biāo)聯(lián)合診斷（CCP/RF/GPI/AKA等）仍有一部分RA患者，尤其是早期患者不能及時 被確診。
[0003] RA是一種自身免疫疾病，在發(fā)病過程中許多功能蛋白會發(fā)生非正常的翻 譯后修飾，如括聚絲蛋白（Filaggrin，F(xiàn)LG)、波形蛋白（Vimentin)、a和0纖維蛋 白（a/0 Fibrin)、a-稀醇化酶（a -Enolase)及I型和II型膠原多肽（Type I and typeIIcollagen polypeptide)等會發(fā)生不正常翻譯后修飾，這些非正常修飾的蛋白能激 起體內(nèi)免疫系統(tǒng)反應(yīng)產(chǎn)生自身抗體。目前臨床使用的RA診斷方法中，大部分為自身抗體的 檢測，如RF，ACPA，AKA等。其中，ACR2010分類標(biāo)準(zhǔn)推介的RF在RA疾病特異性比較低（低 于80%)，臨床所用的CCP2的特異性可達(dá)到90%以上，但其靈敏度僅有70%左右，而在早 期RA患者中，CCP靈敏度只有不到50%。由于患者自身免疫系統(tǒng)的差異性以及自身抗體分 泌的之后性（相對于自生抗原），自身抗體的檢測顯然不能完全與RA病情尤其是RA早期的 病情相符，自身抗原的檢測在自身免疫疾病的診斷方面具有很大的潛力。但是，目前市場上 還沒有以自身抗原為檢測目標(biāo)的用于RA臨床診斷的試劑和方法還沒有出現(xiàn)。因此新的更 具診斷意義的生物標(biāo)志物開發(fā)成為突破RA診斷方法的關(guān)鍵。
[0004] 纖維蛋白原，F(xiàn)ibrinogen，是血液中促血凝與血栓形成因子。許多報道在RA患 者的體液中存在翻譯后修飾的纖維蛋白原（包括糖基化，羰基化，瓜氨酸化以及其他修 飾）（PTM-F)。大量的實驗數(shù)據(jù)證明將人工修飾的纖維蛋白原能誘導(dǎo)RA的并情更加嚴(yán) 重，暗示了非正常修飾的纖維蛋白原可能與RA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。但是，Takizawa和其 同事（Takizawa等，2006)用ELISA法檢測瓜氨酸化纖維蛋白原發(fā)現(xiàn)，在針對來自類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎患者之滑液的ELISA中檢測到陽性信號，但是所有RA(包括對照）血漿樣 本仍為陰性，Takizawa認(rèn)為纖維蛋白原在血液中是非瓜氨酸化的。本發(fā)明用不同的酶 (Glucosyltransferase, Peptidyl Arginine Deaminase，Carboxydismutase 等）處理 RA 關(guān)節(jié)滑膜特異性蛋白，并用修飾后蛋白免疫兔子，獲得特制的IgG抗體，用于檢測RA患者血 清樣本中的非正常修飾抗原。
[0005] RA會導(dǎo)致不可逆關(guān)節(jié)損壞，早診斷和早治療是緩解病情的關(guān)鍵。但是，目前臨床 采納的多指標(biāo)聯(lián)合診斷（CCP/RF/GPI/AKA等）仍有一部分RA患者不能及時被確診。RF和 CCP是2010ACR標(biāo)準(zhǔn)所推薦的診斷因子，其中，RF的特異性比較低（不到80% )，而目前臨 床所用的CCP2的特異性可達(dá)到90%以上，但靈敏度為70%左右，在早期RA患者中，CCP靈 敏度只有不到50%，RA診斷遇到了瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明提供標(biāo)志物及其應(yīng)用、試劑盒、該標(biāo)志物的檢測方法。本發(fā)明檢 測的PTM-F是與RA病理相關(guān)的自身抗原。在RA患病早期會發(fā)生纖維蛋白原的不正常翻譯 后修飾，因此PTM-F在RA患病早期檢出。另外，本發(fā)明排除因為自身免疫系統(tǒng)差異導(dǎo)致的 診斷結(jié)果與RA病情不符的現(xiàn)象。本發(fā)明檢測的PTM-F在RA患者血清中具有很高的特異性 (90%以上）與靈敏度（80%以上），且能反應(yīng)患者病理信息，具有很高的RA診斷意義。本 發(fā)明檢測的PTM-F蛋白，目標(biāo)明確，檢測時用特異性單抗捕捉目標(biāo)蛋白，可以很大程度上降 低非特異性信號，避免背景信號干擾以及假陽性現(xiàn)象。
[0007] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提拱了一種標(biāo)志物，其為翻譯后修飾纖維蛋白原（PTM-F)。
[0009] 通過對正常人血清，相關(guān)疾病患者血清及RA患者血清共821例樣本分析，發(fā)現(xiàn)在 RA患者血清樣本中的非正常修飾的纖維蛋白原（PTM-F)的含量要明顯高于正常人血清樣 本，且在其他相關(guān)疾病如骨關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡等患者血清中含量和正常人中非常低， 表明PTM-F具有很高的RA疾病特異性（95 %左右）。并且，采用我們特殊的樣品處理方法 與設(shè)計的ELISA實驗參數(shù)，通過對57例確診為RA患者（根據(jù)ACR2010RA分類標(biāo)準(zhǔn)打分，不 低于6分）的血清樣本測定結(jié)果統(tǒng)計表明，PTM-F在57例RA患者中有47例呈陽性（根據(jù) 95%特異性時設(shè)定cut off值），靈敏度高達(dá)為82%。我們現(xiàn)有的數(shù)據(jù)顯示，以患者的血清 為檢測樣本，PTM-F在RA患者，尤其是早期RA患者中，有很高的臨床診斷價值。本發(fā)明即 是基于以PTM-F為檢測目標(biāo)開發(fā)的RA診斷方法。
[0010] 雖然RA的致病機(jī)理目前研究并不清楚，但有實驗證明將瓜氨酸化纖維蛋白原注 入動物體類，能加劇RA的病情，由此推測瓜氨酸化纖維蛋白原與RA的發(fā)病機(jī)制有很大的關(guān) 聯(lián)。因此，本發(fā)明以PTM-F為檢測目標(biāo)，不僅能高靈敏度確診RA，還能提供一定的病理信息， 以指導(dǎo)臨床制定個性化治療方案。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的標(biāo)志物所述翻譯后修飾纖維蛋白 原（PTM-F)的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0012] 所述纖維蛋白原的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示（突出標(biāo)記部分為潛在的翻譯 后修飾位點(diǎn)）。SEQ ID No. 1所示：
[0013]
[0014] 在本發(fā)明的一些實施例中，所述翻譯后修飾為點(diǎn)選自第5位、第35位、第38位、第 42位、第69位、第84位、第114位、第123位、第129位、第135位、第137位、第143位、第 160位、第168位、第178位、第181位、第186位、第190位、第216位、第218位、第258位、 第263位、第271位、第287位、第308位、第353位、第367位、第394位、第414位、第425 位、第426位、第443位、第458位、第459位、第510位、第512位、第547位、第573位、第 591位、第621位、第627位、第630位。
[0015] 在本發(fā)明的一些實施例中，所述修飾為瓜氨酸化或氨基甲?；?。
[0016] 在本發(fā)明的一些實施例中，所述翻譯后修飾纖維蛋白原為瓜氨酸化纖維蛋白原和 /或氨基甲?；w維蛋白原。
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述翻譯后修飾纖維蛋白原（PTM-F)具體為瓜 氨酸化纖維蛋白原和氨基甲酰化纖維蛋白原。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述標(biāo)志物的抗體在制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷試劑或診斷工具 中的應(yīng)用。
[0019] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述應(yīng)用中所述診斷工具為診斷試劑盒。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括抗翻譯后修飾纖維蛋白原抗體和檢測中可接受 的試劑。
[0021] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的所述試劑盒中所述試劑還包括載 體、封閉液、洗滌液、樣品稀釋液、標(biāo)記抗體、底物、顯色液、終止液中的一種或兩者以上的混 合物。
[0022] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的所述試劑盒中所述試劑盒在檢測 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明提供的所述標(biāo)志物的檢測方法，包括如下步驟：
[0024] 步驟1 :取載體包被所述抗翻譯后修飾纖維蛋白原抗體，與待測樣品混合，孵育， 獲得包含有樣品待測液的載體；
[0025] 步驟2 :取載體包被所述抗翻譯后修飾纖維蛋白原抗體，與陰性參考樣品混合，孵 育，獲得包含有陰性參考樣品待測液的載體；
[0026] 步驟3 :分別取步驟1制得的包含有樣品待測液的載體與步驟2制得的包含有陰 性參考樣品待測液的載體，洗滌后，分別與標(biāo)記二抗混合，孵育，洗滌，顯色，檢測所述待測 樣品的光吸收值和所述陰性參考樣品的光吸收值，獲得所述標(biāo)志物的濃度。
[0027] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的所述標(biāo)志物的檢測方法步驟3中 所述獲得所述標(biāo)志物的濃度=所述待測樣品的光吸收值/所述陰性參考樣品的光吸收值。
[0028] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，本發(fā)明提供的所述標(biāo)志物的檢測方法中根據(jù)所 述標(biāo)志物獲得的檢測結(jié)果為半定量檢測結(jié)果，用S/N值來表示；
[0029] 吸光度比值（S/N)=待測樣品孔的光吸收值/陰性參考樣品孔的光吸收值
[0030]