專利名稱:一種肝素鈉的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明方法涉及豬小腸粘膜深加工技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種肝素鈉的提取方法， 是一種以豬小腸粘膜為原料，通過生物酶解技術(shù).從而提取肝素鈉的方法。
背景技術(shù)：
肝素鈉Ofeparin Sodium)是粘多糖硫酸酯類抗凝血藥。它是從豬或牛的腸粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬粘多糖類物質(zhì)。近年來研究證明肝素鈉還有降血脂作用。
肝素鈉是目前世界上最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物，主要應(yīng)用于心腦血管疾病和血液透析治療，其中在血液透析治療中是唯一有效的特效藥物。臨床應(yīng)用及研究顯示，肝素鈉除具有抗凝血作用外，還具有其他多種生物活性和臨床用途，包括降血脂作用、 抗中膜平滑肌細(xì)胞(SMC)增生、促進(jìn)纖維蛋白溶解等作用。此外，低分子肝素是由肝素原料藥作為原料進(jìn)一步加工成的一大類抗血栓的藥物，具有更為廣泛的臨床醫(yī)學(xué)用途，成為治療急性靜脈血栓和急性冠脈綜合癥(心絞痛、心肌梗塞)等疾病的首選藥物。肝素是世界上迄今已知的分子結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的化合物，短期內(nèi)無法通過人工化學(xué)合成，目前只有來源于豬小腸粘膜的肝素鈉能夠用于臨床治療。肝素原料藥的原料是肝素粗品，其提取只能源自健康生豬的小腸粘膜，由于含有大量雜質(zhì)蛋白、雜質(zhì)核酸以及雜質(zhì)微生物等，需經(jīng)過物理和化學(xué)提取分離過程，定向獲取天然結(jié)構(gòu)基團(tuán)完整的肝素，從而制成肝素鈉原料藥。肝素鈉原料藥是標(biāo)準(zhǔn)肝素制劑的唯一有效成分和低分子肝素原料的生產(chǎn)起點(diǎn)，目前肝素制劑只有按照注射給藥方式用于臨床，這使得肝素原料藥需要有很高的純度，方可保證制劑的用藥安全。 本品不論在體內(nèi)或體外，都有迅速的抗凝血作用。
傳統(tǒng)生產(chǎn)肝素鈉的方法一般如下豬小腸粘膜酶解、樹脂吸附、洗滌、洗脫、沉淀、 精制。此工藝樹脂吸附難，時(shí)間長(zhǎng)，產(chǎn)品收率低、效價(jià)低。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種肝素鈉的提取方法， 是一種以簡(jiǎn)化工藝、提高收率、節(jié)能省時(shí)為目的而開發(fā)出來的新方法，該方法有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的一種肝素鈉的提取方法的步驟如下
1、酶解稱取健康豬的小腸粘膜作為原料，投入反應(yīng)釜，加入原料重量的0. 5%的酶活力為3. 5萬U/g的牛胰脂肪酶，混勻后調(diào)至pH8. 0-9. 0，升溫至45_50°C，恒溫?cái)嚢杳附?2. 8h，酶解過程中控制反應(yīng)體系的pH值穩(wěn)定；
2、滅酶將所得酶解液升溫至90°C，維持IOmin滅酶，然后立即冷卻；
3、過濾冷卻液用過濾機(jī)過濾兩次，先用孔徑為2μπι的濾膜粗濾，再用孔徑為 0. 22 μ m的濾膜過濾，以除去雜質(zhì)，得過濾液；
4、酶解蛋白質(zhì)將過濾液調(diào)至pH7. 5-9.0，然后升溫至45_55°C，加入原料重量的0. 5%的風(fēng)味蛋白酶(酶活力為3. 8萬U/g)，在45-55°C攪拌酶解4_6h，酶解過程中控制反應(yīng)體系的PH值穩(wěn)定，然后將酶解液升溫至90°C，維持IOmin以滅酶，然后立即冷卻，得冷卻液；
5、除蛋白將冷卻液用濾膜孔徑為5nm的過濾機(jī)過濾以除去蛋白質(zhì)并濃縮，得濃縮液；
6、沉淀向濃縮液中加入與其等體積的95wt%乙醇，攪拌均勻后沉淀10h，然后除去上清液，收集沉淀，沉淀中加入與其等體積的無水乙醇脫水，脫水后冷凍干燥得肝素鈉粗
P
m ；
7、精制加入9倍粗品重量的純水將粗品溶解，然后調(diào)PH至1.5，過濾除雜，所得濾液再調(diào)PH至11，記下此時(shí)溶液的體積，再按此體積的4 %加入30wt %過氧化氫，250C下放置氧化，注意控制反應(yīng)體系的PH穩(wěn)定在11，氧化30h后，調(diào)pH至6. 5，然后加入與此時(shí)的溶液等體積的95wt%乙醇，攪拌均勻后靜置沉淀10h，然后除去上清液，向沉淀中加入與其等體積的無水乙醇進(jìn)行脫水，然后過濾掉乙醇得沉淀，沉淀經(jīng)晾曬蒸發(fā)去殘留乙醇，再真空干燥得肝素鈉精品。
本發(fā)明方法中用于調(diào)節(jié)和控制pH值的酸堿分別為35-37wt%的鹽酸和固體氫氧化鈉。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下
1、采用微孔過濾，更有效地去除了酶解液中的雜質(zhì)；
2、剔除了傳統(tǒng)工藝中樹脂吸附的繁瑣操作，工藝簡(jiǎn)單，國(guó)內(nèi)尚未見有關(guān)報(bào)道；
3、生產(chǎn)周期短、成本低、不產(chǎn)生任何有毒有害物質(zhì)，安全，無毒副作用。
具體實(shí)施方式
下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
下述實(shí)施例中用于調(diào)節(jié)和控制pH值的酸堿分別為35-37wt%的鹽酸和固體氫氧化鈉。
實(shí)施例1
一種肝素鈉的提取方法，其步驟如下
1、酶解稱取健康豬的小腸粘膜Ikg為原料，投入反應(yīng)釜，加入5g酶活力為3. 5萬 U/g的牛胰脂肪酶，混勻后調(diào)至pH8. 0，升溫至50°C，恒溫?cái)嚢杳附?-池，酶解過程中控制反應(yīng)體系的PH值穩(wěn)定；
2、滅酶將所得酶解液升溫至90°C，維持IOmin滅酶，然后立即冷卻；
3、過濾冷卻液用過濾機(jī)過濾兩次，先用孔徑為2μπι的濾膜粗濾，再用孔徑為 0. 22 μ m的濾膜過濾，以除去雜質(zhì)，得過濾液；
4、酶解蛋白質(zhì)將過濾液調(diào)至pH7. 5，然后升溫至55°C，加入5g風(fēng)味蛋白酶(酶活力為3.8萬U/g)，在55 °C下攪拌酶解4h，酶解過程中控制反應(yīng)體系的pH值穩(wěn)定，然后將酶解液升溫至90°C，維持IOmin以滅酶，然后立即冷卻，得冷卻液；
5、除蛋白將冷卻液用濾膜孔徑為5nm的過濾機(jī)過濾以除去蛋白質(zhì)并濃縮，得濃縮液；
6、沉淀向濃縮液中加入與其等體積的95wt%乙醇，攪拌均勻后沉淀10h，然后除
4去上清液，收集沉淀，沉淀中加入與其等體積的無水乙醇進(jìn)行脫水，脫水后冷凍干燥得肝素鈉粗品7g ；
7、精制加入63g純水將粗品溶解，然后調(diào)pH至1. 5，過濾除雜，所得濾液再調(diào)pH 至11，記下此時(shí)溶液的體積，再按此體積的4%加入30wt%過氧化氫，25°C下放置氧化，注意控制反應(yīng)體系的PH穩(wěn)定在11，氧化30h后，調(diào)pH至6. 5，然后加入與該溶液等體積的 95wt%乙醇，攪拌均勻后靜置沉淀10h，除去上清液，沉淀中加入與其等體積的無水乙醇進(jìn)行脫水，然后過濾掉乙醇得沉淀，沉淀經(jīng)晾曬蒸發(fā)去殘留乙醇，再真空干燥得肝素鈉精品 4g。所得產(chǎn)品的檢測(cè)報(bào)告見表1。
表1實(shí)施例1所得產(chǎn)品的檢測(cè)報(bào)告
檢測(cè)項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢測(cè)結(jié)果性狀白色或類白色粉末白色粉末pH值(1襯%水溶液)5. 5-8. 07. 3吸光度(0.物丨%水溶液)彡0. 20 (260nm)；彡0. 13(260nm)；彡 0. 15(280nm)彡0. 09 (280nm)干燥失重彡5%3. 2%熾燒殘?jiān)?8. 0%-41. 0%33. 0%蛋白質(zhì)含量彡 2. 5%1. 1%重金屬含量(以1 元素計(jì))<3. Oppm0. 5ppm含硫量(以S元素計(jì))彡 10. 0%16%效價(jià)(USP)彡150U/mg160U/mg
實(shí)施例2
一種肝素鈉的提取方法，其步驟如下
1、酶解稱取健康豬的小腸粘膜2kg為原料，投入反應(yīng)釜，加入IOg酶活力為3. 5 萬U/g的牛胰脂肪酶，混勻后調(diào)至pH8. 3，升溫至48°C，恒溫?cái)嚢杳附?.他，酶解過程中控制反應(yīng)體系的PH值穩(wěn)定；
2、滅酶將所得酶解液升溫至90°C，維持IOmin滅酶，然后立即冷卻；
3、過濾冷卻液用過濾機(jī)過濾兩次，先用孔徑為2μπι的濾膜粗濾，再用孔徑為 0. 22 μ m的濾膜過濾，以除去雜質(zhì)，得過濾液；
4、酶解蛋白質(zhì)將過濾液調(diào)至PH8.0，然后升溫至52°C，加入IOg風(fēng)味蛋白酶(酶活力為3. 8萬U/g)，在52°C攪拌酶解4. 5h，酶解過程中控制反應(yīng)體系的pH值穩(wěn)定，然后將酶解液升溫至90°C，維持IOmin以滅酶，然后立即冷卻，得冷卻液；
5、除蛋白將冷卻液用濾膜孔徑為5nm的過濾機(jī)過濾以除去蛋白質(zhì)并濃縮，得濃縮液；
6、沉淀向濃縮液中加入與其等體積的95wt%乙醇，攪拌均勻后沉淀10h，然后除去上清液，收集沉淀，沉淀中加入與其等體積的無水乙醇脫水，脫水后冷凍干燥得肝素鈉粗品 16g ；
7、精制加入144g純水將粗品溶解，然后調(diào)pH至1.5，過濾除雜，所得濾液再調(diào) PH至11，記下此時(shí)溶液的體積，再按此體積的4%加入30wt%過氧化氫，25°C下放置氧化， 注意控制反應(yīng)體系的PH穩(wěn)定在11，氧化30h后，調(diào)pH至6. 5，然后加入與該溶液等體積的95wt %乙醇，攪拌均勻后靜置沉淀10h，除去上清液，沉淀中加入與其等體積的無水乙醇進(jìn)行脫水，然后過濾掉乙醇得沉淀，沉淀經(jīng)晾曬蒸發(fā)去殘留乙醇，再真空干燥得肝素鈉精品 7g。所得產(chǎn)品的檢測(cè)報(bào)告見表2。 表2實(shí)施例2所得產(chǎn)品的檢測(cè)報(bào)告
權(quán)利要求
1. 一種肝素鈉的提取方法，其步驟如下A、酶解稱取健康豬的小腸粘膜作為原料，投入反應(yīng)釜，加入原料重量的0.5%的比活力為3. 5萬U/g的牛胰脂肪酶，混勻后調(diào)至pH8. 0-9. 0，升溫至45_50°C，恒溫?cái)嚢杳附?2. 8h，酶解過程中控制反應(yīng)體系的pH值穩(wěn)定；B、滅酶將所得酶解液升溫至90°C，維持IOmin滅酶，然后立即冷卻；C、過濾冷卻液用過濾機(jī)過濾兩次，先用孔徑為2μ m的濾膜粗濾，再用孔徑為0. 22 μ m 的濾膜過濾，以除去雜質(zhì)，得過濾液；D、酶解蛋白質(zhì)將過濾液調(diào)至pH7.5-9. 0，然后升溫至45-55°C，加入原料重量的0. 5% 的比活力為3. 8萬U/g風(fēng)味蛋白酶，在45-55°C攪拌酶解4_6h，酶解過程中控制反應(yīng)體系的 PH值穩(wěn)定，然后將酶解液升溫至90°C，維持IOmin以滅酶，然后立即冷卻，得冷卻液；E、除蛋白將冷卻液用濾膜孔徑為5nm的過濾機(jī)過濾以除去蛋白質(zhì)并濃縮，得濃縮液；F、沉淀向濃縮液中加入與其等體積的95wt%乙醇，攪拌均勻后沉淀10h，然后除去上清液，收集沉淀，沉淀中加入與其等體積的無水乙醇脫水，脫水后冷凍干燥得肝素鈉粗品；G、精制加入9倍粗品重量的純水將粗品溶解，然后調(diào)pH至1.5，過濾除雜，所得濾液再調(diào)pH至11，記下此時(shí)溶液的體積，再按此體積的4%加入30wt%過氧化氫，25°C下放置氧化，注意控制反應(yīng)體系的PH穩(wěn)定在11，氧化30h后，調(diào)pH至6. 5，然后加入與此時(shí)的溶液等體積的95wt%乙醇，攪拌均勻后靜置沉淀10h，然后除去上清液，向沉淀中加入與其等體積的無水乙醇進(jìn)行脫水，然后過濾掉乙醇得沉淀，沉淀經(jīng)晾曬蒸發(fā)去殘留乙醇，再真空干燥得肝素鈉精品。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種肝素鈉的提取方法，該方法采用健康豬的小腸粘膜為主要原料，經(jīng)過酶解、滅酶、過濾、酶解蛋白、除蛋白、沉淀、精制、干燥后即獲肝素鈉。本發(fā)明方法生產(chǎn)周期短、成本低、收率高，不產(chǎn)生任何有毒有害物質(zhì)，而且所得產(chǎn)品安全性高，可用于藥品領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C08B37/10GKCN102070727 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010609844
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月28日
發(fā)明者葉傳發(fā), 葉思, 張小東 申請(qǐng)人:湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3),