專利名稱:一種利用黑曲霉生產(chǎn)羧肽酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)羧肽酶的新方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。具體而言是指使用黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-I菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶的新技術(shù)。
背景技術(shù)：
羧肽酶(Carboxyp印tidase)是一類肽鏈端水解酶，作用于肽鏈的游離羧基末端釋放單個(gè)氨基酸，其在醫(yī)藥和食品工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，可用于重組人胰島素的生產(chǎn)，腫瘤抗體導(dǎo)向酶的前藥治療，以及作為診斷急性胰腺炎輕重程度的血清標(biāo)記等；在食品工業(yè)上，羧肽酶可作用于苦味肽，水解肽鏈羧基端的疏水性氨基酸，達(dá)到脫苦味的目的。另外，羧肽酶還可用于多肽的氨基酸測(cè)序。羧肽酶有小麥羧肽酶、動(dòng)物羧肽酶和微生物羧肽酶，其中，動(dòng)物來(lái)源的羧肽酶主要存在于豬和牛等的胰臟中，數(shù)量非常有限， 價(jià)格昂貴，其應(yīng)用因此而受到限制。而微生物來(lái)源的羧肽酶來(lái)源廣泛，目前已在酵母和霉菌 (Aspergillus、Penicillium)中檢測(cè)到羧肽酶的存在。因此，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶具有廣闊的應(yīng)用前景。
曲霉(Aspergillus)中存在的羧肽酶主要為絲氨酸羧肽酶，主要存在液泡中，在酸性環(huán)境下，它們同時(shí)具有末端蛋白水解酶、酯酶和脫酰胺酶的活性，參與多肽和蛋白質(zhì)的加工、修飾與降解等多個(gè)重要環(huán)節(jié)。亞夫爾在其發(fā)明專利(公開(kāi)號(hào)CN95191058.2)中報(bào)道了編碼黑曲霉羧肽酶的基因，其產(chǎn)生的羧肽酶存在于液泡中，可降解異源蛋白。Ichishima 等人分離得到的一株黑曲霉液體發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶，酶活為0. 36U/ml濾液。Krishnan等人用清酒曲培養(yǎng)基固體發(fā)酵培養(yǎng)黑曲霉產(chǎn)羧肽酶酶活為60. 5U/mg。Morita等人用土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基固體發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶0，酶活為463. Omkat/kg。綜上所述，羧肽酶廣泛存在于曲霉中，但目前無(wú)論是液態(tài)發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵，微生物產(chǎn)羧肽酶活力均較低，導(dǎo)致了羧肽酶的生產(chǎn)和應(yīng)用成本高，從而限制了該酶的廣泛應(yīng)用。
羧肽酶屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物通常是在霉菌進(jìn)行分化時(shí)形成的，液態(tài)培養(yǎng)抑制真菌分化，所以真菌固態(tài)發(fā)酵單位體積的酶產(chǎn)量往往比液態(tài)發(fā)酵高。羧肽酶的產(chǎn)生量受碳源氮源及無(wú)機(jī)離子影響，通過(guò)改變發(fā)酵過(guò)程中的培養(yǎng)基組分可逐步提高產(chǎn)酶量。本專利中利用黑曲霉LW-I菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶為絲氨酸羧肽酶，可用作氨基酸測(cè)序，食品工業(yè)的脫苦劑等，其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量最高可達(dá)陽(yáng)84. 2U/g麩皮。微生物固態(tài)發(fā)酵具有設(shè)備簡(jiǎn)單、投入少、見(jiàn)效快、生產(chǎn)成本低以及對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明利用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶的酶活性高于國(guó)內(nèi)水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以麩皮、玉米粉和豆餅粉等農(nóng)副產(chǎn)品為發(fā)酵基料，利用黑曲霉LW-I固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶的方法。本發(fā)明所述固態(tài)發(fā)酵的技術(shù)方案和內(nèi)容如下
固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室小試生產(chǎn)羧肽酶
1、菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-I,由江南大學(xué)篩選和保藏。該菌種已經(jīng)于2008年在《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)》雜志的Vol. 16 No. 2 Pg. 346公開(kāi)。
2、斜面種子培養(yǎng)去皮馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂20g/L，自然pH;121°C滅菌20min，放置斜面；冷卻后接種LW-I菌株，30°C培養(yǎng)96h。此斜面培養(yǎng)基可用于菌種的活化、保藏和斜面種子等。每3個(gè)月轉(zhuǎn)接1次。
3、麩曲種子的制備250mL三角瓶中裝IOg基料(即麩皮IOg)，(NH4)2SO4 0. Ig,自來(lái)水12mL，自然pH，充分混勻。121°C滅菌40min，冷卻后接種LW-I試管斜面種子，30°C培養(yǎng) 96h，期間分別于24h和44h各翻曲一次。
4、固態(tài)發(fā)酵250mL三角瓶中裝IOg基料(麩皮8 10g，豆餅粉1 2g，玉米粉 0 Ig)，(NH4)2SO4 50 IOOmg, MgSO4 5 IOmg, CaCl2 5 IOmg, KH2PO4 30 50mg,自來(lái)水12 15mL，自然pH。121°C滅菌40min，冷卻后接種黑曲霉LW-I斜面種子，30°C培養(yǎng) 84 96h，期間分別于20 24h和44 48h各翻曲一次。
5、粗酶液提取固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后取培養(yǎng)物lg，每個(gè)錐形瓶中加入10mL50mM檸檬酸鈉緩沖液(PH5. 0)，碾磨lOmin，靜止一定時(shí)間后后過(guò)濾，離心、4000rpm、IOmin)后得到的上清液即為粗酶液。測(cè)定時(shí)經(jīng)緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。
6、分析方法
酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別取2mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液0，0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. OmL于試管中，用水補(bǔ)足至2mL。再加入ImL茚三酮顯色液，充分混勻后，蓋住試管口，在100°C水浴中加熱20min， 用自來(lái)水冷卻。放置5min后，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為570nm處的吸光值(0D570nm)。以 0D570nm為縱坐標(biāo)，氨基酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
茚三酮法測(cè)羧肽酶酶活
將0. 05mmolZ-Phe-Tyr溶于20mL 50mM醋酸鈉緩沖液(pH3. 0)作底物，定量移取1. 8mL底物(Z-Phe-Tyr，2. 5mmol/L)溶液于5mL離心管中，再加入酶液0. 2mL, 30°C保溫 20min，調(diào)pH 6. 0終止反應(yīng)。從酶底物反應(yīng)液中量取500 μ L，再加入500 μ L蒸餾水，得到 LOmL的稀釋后樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定。產(chǎn)物濃度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。IU定義為每分鐘產(chǎn)生Iyg酪氨酸的酶量。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)是采用廉價(jià)的麩皮、豆餅粉和玉米粉等農(nóng)副產(chǎn)品為發(fā)酵主原料，是一種充分利用自然界可再生資源的生產(chǎn)方式。同時(shí)，本發(fā)明所采用的菌株黑曲霉(Aspergillus niger)是公認(rèn)安全(GRAS)的微生物，因此利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑具有安全、可靠和不產(chǎn)生毒素等優(yōu)點(diǎn)；利用黑曲霉LW-I菌株固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)羧肽酶，符合生態(tài)系統(tǒng)中的自然法則，是一種綠色環(huán)保且可持續(xù)的生產(chǎn)方式，且具有設(shè)備簡(jiǎn)單、 投資少、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明利用黑曲霉LW-I菌株，采用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶，實(shí)驗(yàn)室小試產(chǎn)羧肽酶活性可達(dá)5584. 2U/g麩皮。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述內(nèi)容的范圍僅局限于下述實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
4[0020]1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-l 菌株。
2.固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基250mL三角瓶中裝IOg發(fā)酵基料(即麩皮IOg)，(NH4)2SO4 50mg, MgSO4 5mg, CaCl2 IOmg, KH2PO4 30mg,自來(lái)水 13mL,自然 pH。
3.固態(tài)發(fā)酵條件121°C滅菌40min，冷卻后接種一菌耳EOOl麩曲種子，30°C靜置培養(yǎng)96h，期間分別于24h和4 各翻曲一次。
4.粗酶液提取
固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后取培養(yǎng)物lg，每個(gè)錐形瓶中加入10mL50mM檸檬酸鈉緩沖液 (ρΗ5· 0)，碾磨lOmin，靜止30min后過(guò)濾，離心(4°C>4000rpmU0min)后得到的上清液即為
粗酶液。
5.茚三酮反應(yīng)
將0. 05mmolZ-Phe-Tyr溶于20mL 50mM醋酸鈉緩沖液(pH3. 0)作底物，定量移取1. 8mL底物(Z-Phe-Tyr，2. 5mmol/L)溶液于5mL離心管中，再加入酶液0. 2mL, 30°C保溫 20min，調(diào)pH 6. O終止反應(yīng)。從酶底物反應(yīng)液中量取500 μ L，再加入500 μ L蒸餾水，得到 1. OmL的稀釋后樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定。
重復(fù)3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成熟固態(tài)發(fā)酵曲料的羧肽酶平均酶活性達(dá)到3194. 4U/g麩曲。
實(shí)施例2
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-l 菌株。
2.固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基250mL三角瓶中裝IOg發(fā)酵基料(即麩皮8g，豆餅粉lg，菜籽餅粉 Ig)，(NH4)2SO4 75mg，MgSO4 7. 5mg，CaCl2 10mg，KH2PO4 40mg，自來(lái)水 13mL，自然 pH。
3.固態(tài)發(fā)酵條件121°C滅菌40min，冷卻后接種一菌耳LW-I麩曲種子，30°C靜置培養(yǎng)96h，期間分別于24h和4 各翻曲一次。
4.粗酶液提取
固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后取培養(yǎng)物lg，每個(gè)錐形瓶中加入10mL50mM檸檬酸鈉緩沖液 (ρΗ5· 0)，碾磨lOmin，靜止30min后過(guò)濾，離心(4°C>4000rpmU0min)后得到的上清液即為
粗酶液。
5.茚三酮反應(yīng)
將0. 05mmolZ-Phe-Tyr溶于20mL 50mM醋酸鈉緩沖液(ρΗ3. 0)作底物，定量移取1. 8mL底物(Z-Phe-Tyr，2. 5mmol/L)溶液于5mL離心管中，再加入酶液0. 2mL, 30°C保溫 20min，調(diào)pH 6. O終止反應(yīng)。從酶底物反應(yīng)液中量取500 μ L，再加入500 μ L蒸餾水，得到 1. OmL的稀釋后樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定。
重復(fù)3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成熟固態(tài)發(fā)酵曲料的羧肽酶平均酶活性達(dá)到3868. 9U/g麩曲。
實(shí)施例3
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-l 菌株。
2.固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基250mL三角瓶中裝IOg發(fā)酵基料(即麩皮8g，豆餅粉lg，菜籽餅粉 Ig)，(NH4)2SO4 75mg，MgSO4 7. 5mg，CaCl2 10mg，KH2PO4 40mg，自來(lái)水 13mL，自然 pH。
3.固態(tài)發(fā)酵條件121°C滅菌40min，冷卻后接種一菌耳EOOl麩曲種子，30°C靜置培養(yǎng)96h，期間分別于24h和4 各翻曲一次。[0041]4.粗酶液提取
固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后取培養(yǎng)物lg，每個(gè)錐形瓶中加入10mL50mM檸檬酸鈉緩沖液 (pH5. 0)，碾磨lOmin，靜止Mi后過(guò)濾，離心、4000rpm、IOmin)后得到的上清液即為粗酶液。
5.茚三酮反應(yīng)
將0. 05mmolZ-Phe-Tyr溶于20mL 50mM醋酸鈉緩沖液(ρΗ3. 0)作底物，定量移取1. 8mL底物(Z-Phe-Tyr，2. 5mmol/L)溶液于5mL離心管中，再加入酶液0. 2mL, 30°C保溫 20min，調(diào)pH 6. O終止反應(yīng)。從酶底物反應(yīng)液中量取500 μ L，再加入500 μ L蒸餾水，得到 1. OmL的稀釋后樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定。
重復(fù)3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成熟固態(tài)發(fā)酵曲料的羧肽酶平均酶活性達(dá)到5584. 2U/g麩曲。
權(quán)利要求
1.一種小試生產(chǎn)羧肽酶的新方法，其特征在于以麩皮、豆餅粉和玉米粉為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的基料，并添加適量的無(wú)機(jī)氮源、無(wú)機(jī)鹽和自來(lái)水，在250mL三角瓶中，利用黑曲霉 (Aspergillus niger)Lff-l菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于使用的菌種是黑曲霉LW-I。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于采用的發(fā)酵工藝是固態(tài)發(fā)酵。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于使用的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為250mL三角瓶中裝IOg基料(麩皮8 10g，豆餅粉1 2g，玉米粉0 lg)，(NH4)2SO4 50 lOOmg， MgS045 10mg，CaCl2 5 10mg，KH2PO4 30 50mg，自來(lái)水 12 15mL，自然 pH。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于采用的固態(tài)發(fā)酵條件為發(fā)酵培養(yǎng)基121°C 滅菌40min，冷卻后接種一菌耳LW-I麩曲種子，30°C培養(yǎng)84 96h，期間分別于20 24h 和44 48h各翻曲一次。
專利摘要
一種利用黑曲霉生產(chǎn)羧肽酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明采用麩皮、豆餅粉和玉米粉等農(nóng)副產(chǎn)品為發(fā)酵基料，通過(guò)適當(dāng)改變培養(yǎng)基中碳源和氮源的比例，優(yōu)化酶液提取時(shí)間，利用黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)羧肽酶。本發(fā)明提供了實(shí)驗(yàn)室小試生產(chǎn)的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，成熟發(fā)酵曲料的羧肽酶活性達(dá)到3194.4U/g～5584.2U/g。本發(fā)明具有設(shè)備簡(jiǎn)單、投入少、見(jiàn)效快、生產(chǎn)成本低廉、對(duì)環(huán)境友好以及羧肽酶活性較高等特點(diǎn)，有利于羧肽酶的開(kāi)發(fā)和利用，具有較高的經(jīng)濟(jì)和實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N9/48GKCN102154251SQ201010602818
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月24日
發(fā)明者吳靜, 唐存多, 李劍芳, 鄔敏辰, 閔柔, 陳偉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan