一種從豬肺中提取肝素的生產方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，尤其涉及一種從豬肺中提取肝素的生產方法。
【背景技術】
[0002]肝素，是酸性粘多糖硫酸酯類抗凝血藥。近年來研宄證明肝素還有降血脂作用，多年來，國際市場對肝素的需求一直十分旺盛。因肝素是從動物內臟中提取加工而得的，產量受到一定限制，時常滿足不了市場需求。自20世紀90年代后期開始，全球市場肝素需求大幅增加，我國肝素生產和出口連年均以較大幅度上升，出口量和出口金額呈快速增長態(tài)勢。中國已成為世界上首屈一指的肝素原料藥出口大國。2001年，全國肝素產品出口金額為4460萬美元。2002年，出口金額達5894萬美元，比上年增長了 32.17 %。肝素產品在我國醫(yī)藥類產品出口金額排序中已躋身前5位，僅次于維生素C、檸檬酸、維生素E和磺胺。
[0003]我國生產的肝素產品除滿足國內市場外，還大量出口。長期以來，我國產品出口順暢，只要質量達到要求，常常有多少就出口多少。與之形成對比的是，由于我國的經濟發(fā)展狀況和人民生活水平的限制，，對這種昂貴(注射用精品8?10美元/mega，口服用為7?8美元/mega)的抗凝血藥目前國內消費量極小，主要是創(chuàng)匯，銷往日本、美國、歐洲等發(fā)達國家和地區(qū)。
[0004]目前，國內生產肝素的方法，主要是鹽解法和酸解法，比如公開號為CN101735340A、CN101649008A、CN101519459A等等的中國發(fā)明申請，這兩種方法都是采用豬小腸粘膜為原料，在堿性條件下通過鹽解、酶解，出去部分蛋白質后，通過三甲胺季銨性強堿性陽離子交換樹脂吸附劑洗脫，在洗脫液中加以乙醇沉淀既得肝素鈉初級原料出售，其缺點是生產周期長達48h，反應溫度為95-100°C，能源消耗大，水解不完全，收率低，生產I億國際單位(IU)肝素粗品需2800-3000根豬小腸粘膜，所得產品純度低，粗品含肝素至多為80效價/毫克；并產生大量的肥腸渣和廢水，污染環(huán)境；且生產過程中樹脂再生困難，這種制備方法由于生產周期長，水解不完全、不徹底，制得的肝素鈉純度低、收率低、效價低，很難進行規(guī)模性生產，且不能滿足市場的大量需求。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種產品生產周期短、純度高、效價高、雜質少、綠色環(huán)保的利用豬肺提取肝素粗品的生產方法，本工藝采用生物酶解法從原材料易得的豬肺中提取肝素粗品。
[0006]本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術方案如下:
一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:步驟如下:(1)預處理:將豬肺清洗，去除內外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分攪拌下，加入水攪拌得到豬肺混合液，其中豬肺和水的質量比為1:3-4 ；(2)酶解:調豬肺混合液pH值為6.5?8.0，加入豬肺重量的1.5%?2.5%的硫酸軟骨素復合酶，攪拌均勻，升溫至30?45°C，保溫反應30?60min后，保持反應液的pH值為7.0?7.5，加入豬肺重量的0.25%?0.5%胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫2?4h，繼續(xù)升溫到90?100°C，保持5?lOmin，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，調濾液pH值為8.5?10.5，攪拌升溫到55?65°C時加入豬肺重量的0.1%?0.4%的澄清劑，繼續(xù)升溫至90?95°C，保溫反應2?4h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2?0.4 μπι濾膜進行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為10?30g/kg，常溫反應8?12h過濾，得濾液，將濾液調pH至4.5?5.5，加入等體積的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；
[6]冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內，設定溫度-20?10°C，真空度0.05?0.08Mpa，干燥時間2?4h。
[0007]所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(2)硫酸軟骨素復合酶為硫酸軟骨素酶A、B和C中二種或以上的組合。
[0008]所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(3)澄清劑為天然1+1澄清劑，使用之前用冰醋酸配成1%的溶液。
[0009]所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(5)調pH值所用的酸為冰醋酸、草酸、檸檬酸中的一種或者二種混合。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為:1、本發(fā)明采用的酶解方法能更徹底全面地溶解豬肺漿液，用胰蛋白酶終止酶解，真空冷凍干燥技術穩(wěn)定了產品的質量以及提高收率，同時獲得的粗品雜質少、效價高；2、本發(fā)明生產方法中采用澄清劑來替代乙醇反復醇沉來去除蛋白質的傳統(tǒng)工藝，具有去除率高，節(jié)約了大量乙醇的使用量，降低了生產成本；3、本發(fā)明工藝設計合理，生產無毒、無害、生物綠色環(huán)保，豬肺原料來源易得，運營生產成本低，適合大規(guī)模工業(yè)化生產。
【具體實施方式】
[0011]
實施例1:一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:步驟如下:(1)預處理:將豬肺5kg清洗，去除內外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分攪拌下，加入15kg水攪拌得到豬肺混合液；(2)酶解:用氫氧化鈉調豬肺混合液pH值為6.5，加入75g的硫酸軟骨素A和C，攪拌均勻，升溫至30°C，保溫反應30min后，保持反應液的pH值為7.0，加入12.5g胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫2h，繼續(xù)升溫到90°C，保持5min，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，用氫氧化鈉調濾液PH值為8.5，攪拌升溫到55°C時加入5g的澄清劑，繼續(xù)升溫至90°C，保溫反應2h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2 μπι濾膜進行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為ΙΟ/kg,常溫反應8h過濾，得濾液，將濾液用冰醋酸調pH至4.5，加入20kg的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內，設定溫度-20°C，真空度0.05Mpa，干燥時間2h，既得肝素粗品20 g，其效價為每毫克100單位。
[0012]實施例2:—種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:步驟如下:(1)預處理:將10kg豬肺清洗，去除內外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分攪拌下，加入350kg水攪拌得到豬肺混合液(2)酶解:用氫氧化鈉調豬肺混合液pH值為7.0，加入豬肺重量的2kg的硫酸軟骨素A和B，攪拌均勻，升溫至40°C，保溫反應45min后，保持反應液的pH值為7.0，加入0.3kg胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫3h，繼續(xù)升溫到95°C，保持7min，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，用氫氧化鈉調濾液pH值為9.0，攪拌升溫到60°C時加入0.2kg的澄清劑，繼續(xù)升溫至93°C，保溫反應3h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2 μ m濾膜進行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為20g/kg，常溫反應1h過濾，得濾液，將濾液用草酸調pH至5.0，加入350kg無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內，設定溫度-10°C，真空度0.07Mpa，干燥時間3h，既得肝素粗品0.5kg,其效價為每毫克90單位。
[0013]實施例3:—種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:步驟如下:(1)預處理:將100kg豬肺清洗，去除內外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分攪拌下，加入4000kg水攪拌得到豬肺混合液(2)酶解:調豬肺混合液pH值為8.0，加入豬肺重量的25kg的硫酸軟骨素B和C，攪拌均勻，升溫至45°C，保溫反應60min后，保持反應液的pH值為7.5，加入5kg胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫4h，繼續(xù)升溫到100°C，保持lOmin，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，用氫氧化鈉調濾液pH值為10.5，攪拌升溫到65°C時加入4kg的澄清劑，繼續(xù)升溫至95°C，保溫反應4h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.4 μ m濾膜進行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為30g/kg，常溫反應12h過濾，得濾液，將濾液用檸檬酸調pH至5.5，加入4000kg的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內，設定溫度0°c，真空度0.0SMpa,干燥時間4h，既得肝素粗品4.8kg，其效價為每毫克100單位。
【主權項】
1.一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:步驟如下:(I)預處理:將豬肺清洗，去除內外污物和脂肪后，絞碎成糜狀，并在充分攪拌下，加入水攪拌得到豬肺混合液，其中豬肺和水的質量比為1:3-4 ；(2)酶解:調豬肺混合液pH值為6.5?8.0，加入豬肺重量的1.5%?2.5%的硫酸軟骨素復合酶，攪拌均勻，升溫至30?45°C，保溫反應30?60min后，保持反應液的pH值為7.0?7.5，加入豬肺重量的0.25%?0.5%胰蛋白酶，攪拌均勻，保溫2?4h，繼續(xù)升溫到90?100°C，保持5?lOmin，冷卻，得到豬肺酶解液(3)除蛋白:過濾豬肺酶解液，去除表面油脂層，調濾液pH值為8.5?10.5，攪拌升溫到55?65°C時加入豬肺重量的0.1%?0.4%的澄清劑，繼續(xù)升溫至90?95°C，保溫反應2?4h，冷卻至常溫；(4)超濾:將上述液體用0.2?0.4 μπι濾膜進行過濾，得過濾液；(5)氧化沉淀:加入雙氧水，使過濾液中雙氧水的含量為10?30g/kg，常溫反應8?12h過濾，得濾液，將濾液調pH至4.5?5.5，加入等體積的無水乙醇沉淀過夜后，除去上層清液，沉淀物為粗品肝素；(6)冷凍干燥:將粗品肝素放入真空冷凍干燥箱內，設定溫度-20?10°C，真空度0.05?0.08Mpa，干燥時間2?4h。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(2)硫酸軟骨素復合酶為硫酸軟骨素酶A、B和C中二種或以上的組合。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(3)澄清劑為天然1+1澄清劑，使用之前用冰醋酸配成1%的溶液。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種從豬肺中提取肝素的生產方法，其特征在于:所述步驟(5)調pH值所用的酸為冰醋酸、草酸、檸檬酸中的一種或者二種混合。
【專利摘要】一種從豬肺中提取肝素的生產方法，步驟如下：將新鮮豬肺絞碎成漿液、漿液保溫酶解、酶解液過濾收集濾液、對濾液進行除蛋白處理、超濾、氧化沉淀、冷凍干燥得肝素粗品。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為：1、本發(fā)明采用的酶解方法能更徹底全面地溶解豬肺漿液，用胰蛋白酶終止酶解，真空冷凍干燥技術穩(wěn)定了產品的質量以及提高收率，同時獲得的粗品雜質少、效價高；2、本發(fā)明生產方法中采用澄清劑來替代乙醇反復醇沉來去除蛋白質的傳統(tǒng)工藝，具有去除率高，節(jié)約了大量乙醇的使用量，降低了生產成本；3、本發(fā)明工藝設計合理，生產無毒、無害、生物綠色環(huán)保，豬肺原料來源易得，運營生產成本低，適合大規(guī)模工業(yè)化生產。
【IPC分類】C08B37-10
【公開號】CN104530262
【申請?zhí)枴緾N201510036218
【發(fā)明人】郭慶, 徐賓朋, 趙厚發(fā)
【申請人】安徽科寶生物工程有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月26日