本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及一種能夠降解鄰苯二甲酸酯類塑化劑的羧酸酯酶care19及其全細(xì)胞催化劑和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鄰苯二甲酸酯(phthalic?acid?esters,paes)是一類半揮發(fā)性有機(jī)化合物，具有增強(qiáng)聚合物的可塑性、柔韌性和流動性等作用，因此主要作為增塑劑被廣泛應(yīng)用于聚氯乙烯地板、玩具、醫(yī)療器械、個人護(hù)理產(chǎn)品等方面。paes與塑料制品間沒有穩(wěn)定的化學(xué)鍵結(jié)合，因此其會不斷的從塑料制品中滲透、蒸發(fā)而出,進(jìn)入職業(yè)環(huán)境、空氣、水和土壤等環(huán)境介質(zhì)中，再通過食物鏈、吸入和皮膚吸收等途徑進(jìn)入到人體，paes作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，對人類健康的影響可能持續(xù)數(shù)年，并可能影響下一代的健康，同時具有潛在的致癌、致畸和致突變等危害，從而對人類健康造成潛在風(fēng)險。因此，對該類塑化劑的降解迫在眉睫。其中，六種paes即dmp、dep、dbp、dnop、dehp和bbp已被美國環(huán)境保護(hù)局和歐盟列為優(yōu)先污染物。

2、環(huán)境中鄰苯二甲酸酯的去除有幾種途徑：揮發(fā)去除作用、水解和光解反應(yīng)、物理吸附作用以及微生物降解作用。由于物理吸附、揮發(fā)去除作用、水解和光解反應(yīng)價格昂貴、效率低且會對環(huán)境產(chǎn)生二次污染，因此，微生物降解作用以及可降解污染物的微生物資源挖掘與利用是目前環(huán)境中污染物去除的主要手段。paes降解的關(guān)鍵步驟是paes分子中的酯鍵斷裂，形成鄰苯二甲酸和相應(yīng)的醇，羧酸酯酶是微生物代謝鄰苯二甲酸類塑化劑的關(guān)鍵，負(fù)責(zé)酯鍵斷裂。然而，純酶在實際運(yùn)用中有成本較高，純化步驟復(fù)雜且穩(wěn)定性差等限制條件，而運(yùn)用表面展示技術(shù)將酶展示到大腸桿菌細(xì)胞表面作為全細(xì)胞催化劑，在實際應(yīng)用中無需細(xì)胞破壁和純化，并且具有更好的穩(wěn)定性，大大縮小了經(jīng)濟(jì)成本和工藝的復(fù)雜性，表面展示技術(shù)已經(jīng)在環(huán)境修復(fù)、疫苗制備、生物傳感器等多個方面廣泛的運(yùn)用。且目前用表面展示技術(shù)降解鄰苯二甲酸酯類塑化劑的報道還較少。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種能夠降解鄰苯二甲酸酯類塑化劑的羧酸酯酶care19及其全細(xì)胞催化劑，對鄰苯二甲酸酯類塑化劑的污染處理具有應(yīng)用潛力。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種羧酸酯酶care19，該羧酸酯酶care19的氨基酸序列如seq?id?no.9所示，該羧酸酯酶care19可用于鄰苯二甲酸酯類塑化劑的降解中。

3、優(yōu)選地，該羧酸酯酶care19可用于鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯的降解。

4、本發(fā)明還提供了一種上述羧酸酯酶care19的編碼基因，該編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.10所示。

5、本發(fā)明還提供了一種全細(xì)胞催化劑，通過將上述羧酸酯酶care19的編碼基因和冰核蛋白基因inpn與表達(dá)載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌中所得，該冰核蛋白基因inpn的核苷酸序列如seq?id?no.11所示。

6、優(yōu)選地，上述的表達(dá)載體為原核表達(dá)載體，更優(yōu)地選擇為pet-28a(+)。

7、優(yōu)選地，上述的表達(dá)菌為大腸桿菌，更優(yōu)地選擇為e.colibl21(de3)。

8、本發(fā)明提供的全細(xì)胞催化劑可用于鄰苯二甲酸酯類塑化劑的降解中。

9、優(yōu)選地，該全細(xì)胞催化劑可用于鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯的降解。

10、本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

11、本發(fā)明提供的重組羧酸酯酶care19在4℃、37℃和50℃分別處理20d后，仍能保持26％、33％和33％的相對活性。而本發(fā)明提供的全細(xì)胞催化劑在4℃處理35d后仍保持大于57％的相對活性，在37℃和50℃處理35天，仍保持51％和47％的相對活性，表明全細(xì)胞催化劑比純化的羧酸酯酶care19具有更好的穩(wěn)定性，能更長期穩(wěn)定地應(yīng)用于環(huán)境中鄰苯二甲酸酯類塑化劑的降解。

12、本發(fā)明提供了一種對鄰苯二甲酸酯類塑化劑具有降解能力的羧酸酯酶機(jī)器全細(xì)胞催化劑，在鄰苯二甲酸酯類塑化劑的污染處理中具有應(yīng)用潛力。其中，純化的重組羧酸酯酶care19經(jīng)5h對200mg/l塑化劑dmp、dep和dibp分別具有40.5％、64.8％和93.2％的降解效率；全細(xì)胞催化劑經(jīng)5h對200mg/l塑化劑dmp、dep和dibp和分別具有66.1％、77.2％和94.5％的降解效率，表明全細(xì)胞催化劑對dmp、dep和dibp的降解效率高于純化的重組羧酸酯酶care19。可知本發(fā)明的全細(xì)胞催化劑可經(jīng)濟(jì)高效地用于環(huán)境中dmp、dep和dibp污染處理問題，如農(nóng)田環(huán)境、污水環(huán)境等的污染處理。

技術(shù)特征：

1.一種羧酸酯酶care19，其特征在于，所述羧酸酯酶care19的氨基酸序列如seq?idno.9所示。

2.如權(quán)利要求1所述的羧酸酯酶care19在鄰苯二甲酸酯類塑化劑降解中的應(yīng)用。

3.如權(quán)利要求1所述羧酸酯酶care19的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.10所示。

4.一種全細(xì)胞催化劑，其特征在于，通過將如權(quán)利要求3所述的編碼基因和冰核蛋白基因inpn與表達(dá)載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌中所得，其中，所述冰核蛋白基因inpn的核苷酸序列如seq?id?no.11所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的全細(xì)胞催化劑，其特征在于，所述的表達(dá)載體為原核表達(dá)載體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的全細(xì)胞催化劑，其特征在于，所述的原核表達(dá)載體為pet-28a(+)。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的全細(xì)胞催化劑，其特征在于，所述的表達(dá)菌為大腸桿菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的全細(xì)胞催化劑，其特征在于，所述的大腸桿菌為e.

9.如權(quán)利要求4～8中任意一項所述的全細(xì)胞催化劑在鄰苯二甲酸酯類塑化劑降解中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用包含對鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯的降解。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種能夠降解鄰苯二甲酸酯類塑化劑的羧酸酯酶CarE19及其全細(xì)胞催化劑和應(yīng)用，該羧酸酯酶CarE19的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.9所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.10所示。利用冰核蛋白INPN將羧酸酯酶CarE19展示在大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)表面獲得全細(xì)胞催化劑，將其運(yùn)用于鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)<subgt;、</subgt;鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)和鄰苯二甲酸二異丁酯(DiBP)的降解，具有良好的降解效果，且具有良好的溫度穩(wěn)定性，表明本發(fā)明提供的羧酸酯酶CarE19及其全細(xì)胞催化劑對于鄰苯二甲酸酯類塑化劑的污染處理具有應(yīng)用潛力。

技術(shù)研發(fā)人員：丁俊美,梁璐,徐微,李佳怡,張清鍵
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南師范大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21