本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及了一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、在臨床和科研中，穿刺標(biāo)本類器官（例如乳腺組織）的高效培養(yǎng)對于個性化治療等研究具有重要意義。然而，穿刺標(biāo)本類器官的培養(yǎng)常常面臨著成功率低、細胞功能退化等問題，制約了其在臨床和研究中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中針對穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)存在的問題，提供了一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決：

3、一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的各組分由advanced?dmem/f12培養(yǎng)基、rn條件培養(yǎng)基、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、b27、谷氨酰胺、y27632、wnt3a、煙酰胺、chir99021、表皮生長因子、重組人成纖維生長因子10、a8301、sb202190、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1以及青霉素-鏈霉素組成；

4、培養(yǎng)液中各組分以濃度計算由advanced?dmem/f12培養(yǎng)基、20%?rn條件培養(yǎng)基、10mm?4-羥乙基哌嗪乙磺酸、1x?b27、1x谷氨酰胺、10?um?y27632、50ng/ml?wnt3a、5?mm?煙酰胺、3?umchir99021、5?ng/ml?表皮生長因子、100?ng/ml重組人成纖維細胞生長因子10?、0.5?um?a8301?、0.5?um?sb202190、5nm?神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1以及1x?青霉素-鏈霉素組成。

5、一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟：

6、步驟s101、對于穿刺標(biāo)本進行剪切，保持組織結(jié)構(gòu)活性并避免細胞機械損傷；

7、步驟s102、通過膠原酶對剪切后的穿刺標(biāo)本進行消化，離心、沉淀過濾后收集細胞；

8、步驟s103、將步驟s102中得到的細胞置于低吸附培養(yǎng)板中無支架懸浮培養(yǎng)；

9、步驟s104、最后加入前述的一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得穿刺標(biāo)本類器官。

10、作為優(yōu)先，步驟s104中的培養(yǎng)方法包括接種于低吸附培養(yǎng)板進行類器官無支架培養(yǎng)，在37℃、5%?co2?細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

11、作為優(yōu)先，步驟s104中的培養(yǎng)方法具體包括以下步驟：

12、步驟s201、將孔內(nèi)無支架培養(yǎng)類器官收集到離心管中，離心后棄除上清；

13、步驟s202、向步驟s201?中的離心管加入tryple?express?溶液進行解離，解離溫度為37℃；

14、步驟s203、在溫度為4℃、轉(zhuǎn)速1200?rpm的條件下離心，離心后棄除上清液；

15、步驟s204、在步驟s203離心管細胞沉淀中加入權(quán)利要求1所述的一種腫瘤標(biāo)本類器官培養(yǎng)基混勻，直接接種于低吸附培養(yǎng)板進行類器官無支架培養(yǎng)，37℃5%?co2?細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

16、步驟s205、進行1:1-3傳代。

17、作為優(yōu)先，步驟s102中膠原酶由0.1%1型膠原酶、0.1%2型膠原酶、0.1%?四型膠原酶、0.05%胰蛋白酶-edta以及10nm?y-23867混合而成。

18、作為優(yōu)先，步驟s102中膠原酶對穿刺標(biāo)本的消化時間為30min，消化溫度37℃，該消化時間能夠保證消化充分且不影響細胞活性，避免過夜或長時間消化。

19、作為優(yōu)先，步驟s102還包括消化完成后采用含血清培養(yǎng)基終止消化，采用100um濾膜過濾后，1200?rpm?離心5min。

20、作為優(yōu)先，步驟s102具體包括室溫下在取5-10倍細胞體積的紅細胞裂解，緩沖液中孵育細胞，沉淀?3-5?分鐘除去多余紅細胞，離心后pbs?洗滌細胞沉淀。

21、本發(fā)明由于采用了以上技術(shù)方案，具有顯著的技術(shù)效果：

22、本發(fā)明中通過針對腫瘤標(biāo)本類器官的特點和需求，優(yōu)化培養(yǎng)條件，提供合適的生長環(huán)境，從而提高培養(yǎng)成功率、縮短腫瘤標(biāo)本培養(yǎng)時間，保持細胞功能，為個性化治療等研究提供可靠的支持。

技術(shù)特征：

1.一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)基一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)基，其特征在于：培養(yǎng)基的各組分由advanced?dmem/f12培養(yǎng)基、rn條件培養(yǎng)基、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、b27、谷氨酰胺、y27632、wnt3a、煙酰胺、chir99021、表皮生長因子、重組人成纖維生長因子10、a8301、sb202190、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1以及青霉素-鏈霉素組成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)基，其特征在于：培養(yǎng)液中各組分以濃度計算由advanced?dmem/f12培養(yǎng)基、20%?rn條件培養(yǎng)基、10mm?4-羥乙基哌嗪乙磺酸、1xb27、1x谷氨酰胺、10?um?y27632、5?mm?煙酰胺、3?um?chir99021、5?ng/ml?表皮生長因子、100?ng/ml重組人成纖維細胞生長因子10?、0.5?um?a8301?、0.5?um?sb202190、5nm?神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1以及1x?青霉素-鏈霉素組成。

3.一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟s104中的培養(yǎng)方法包括接種于低吸附培養(yǎng)板進行類器官無支架培養(yǎng)，在37℃、5%?co2?細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)方法，其特征在于：

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟s102中膠原酶由0.1%1型膠原酶、0.1%?2型膠原酶、0.1%?四型膠原酶、0.05%胰蛋白酶-edta以及10nmy-23867混合而成。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟s102中膠原酶對穿刺標(biāo)本的消化時間為30min，消化溫度37℃。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟s102還包括消化完成后采用含血清培養(yǎng)基終止消化，采用100um?濾膜過濾后，1200?rpm?離心5min。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟s102具體包括室溫下在取5-10倍細胞體積的紅細胞裂解，緩沖液中孵育細胞，沉淀?3-5?分鐘除去多余紅細胞，離心后pbs?洗滌細胞沉淀。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種穿刺標(biāo)本類器官培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，標(biāo)本來源包括穿刺活檢微量樣本和手術(shù)樣標(biāo)本，培養(yǎng)基的各組分由Advanced?DMEM/F12培養(yǎng)基、RN條件培養(yǎng)基、4?羥乙基哌嗪乙磺酸、B27、谷氨酰胺、Y27632、Wnt3A、煙酰胺、CHIR99021、表皮生長因子、重組人成纖維生長因子10、A8301、SB202190、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1以及青霉素?鏈霉素組成。本發(fā)明中通過針對穿刺標(biāo)本類器官的特點和需求，優(yōu)化培養(yǎng)條件，提供合適的生長環(huán)境，從而提高培養(yǎng)成功率、縮短穿刺標(biāo)本培養(yǎng)時間，保持細胞功能，為個性化治療等研究提供可靠的支持。

技術(shù)研發(fā)人員：劉小珍,孟旭莉,鄭慶輝,湯鴻超,李精龍,魏娟文,徐雅晴,陶娜娜,陳宏
受保護的技術(shù)使用者：浙江省人民醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21