本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于crispr技術(shù)的eccdna快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、攜帶隨機(jī)基因組片段的染色體外環(huán)狀dna(eccdna)廣泛存在于不同的癌癥類(lèi)型中，eccdna的擴(kuò)增促進(jìn)腫瘤遺傳異質(zhì)性并加速腫瘤進(jìn)化，隨著分析技術(shù)的進(jìn)步，eccdna最近已被證明是具有多種特性的多功能分子。eccdna獨(dú)特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和遺傳特征為癌癥的監(jiān)測(cè)、早期診斷、治療和預(yù)測(cè)提供了新的思路。已有的研究中，分析eccdna的主要手段是環(huán)狀dna測(cè)序，使用這種方法能獲得腫瘤組織中或正常組織中豐富的環(huán)形dna的序列信息，以便進(jìn)行對(duì)比分析，從而揭示腫瘤發(fā)病機(jī)制甚至預(yù)測(cè)癌癥進(jìn)展。然而，環(huán)狀dna測(cè)序方法也存在一些限制，例如操作復(fù)雜，測(cè)序周期長(zhǎng)，價(jià)格昂貴等，無(wú)法進(jìn)行針對(duì)性較強(qiáng)的快速診斷。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)在疾病快速診斷或體外診斷方面實(shí)現(xiàn)了快速的發(fā)展，crispr-cas系統(tǒng)因?yàn)槠鋬?yōu)異的核酸靶向特性成為了基因編輯與分子檢測(cè)的有力工具，具有低成本、簡(jiǎn)單、便攜、高靈敏和高特異等優(yōu)點(diǎn)，被稱(chēng)為“新一代分子診斷技術(shù)”。

2、由于crispr-cas系統(tǒng)具有特異的識(shí)別、順式切割和非特異性的反式切割能力，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)dna和rna等核酸靶標(biāo)以及蛋白質(zhì)、外泌體、細(xì)胞和小分子等非核酸靶標(biāo)的檢測(cè)，進(jìn)而逐漸發(fā)展成了一門(mén)獨(dú)立的分子檢測(cè)門(mén)類(lèi)。本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種eccdna的體外檢測(cè)方法，利用eccdna本身是環(huán)形這一特征，結(jié)合crispr-cas9的特異性識(shí)別功能，對(duì)目標(biāo)環(huán)形dna進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用cas14a的高保真結(jié)合特性以及結(jié)合到靶位點(diǎn)后的反式切割活性，對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)放大，并將信號(hào)轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)到的熒光信號(hào)，有望使用分子生物學(xué)手段通過(guò)對(duì)eccdna的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)癌癥診斷與預(yù)測(cè)。

3、現(xiàn)有的eccdna檢測(cè)分析方法主要是環(huán)狀dna測(cè)序法(ci?rc?l?e-seq)，這種研究方法存在著明顯的限制性：(一)分析周期長(zhǎng)，在從細(xì)胞或血液中獲取dna后，eccdna擴(kuò)增之前要先用核酸外切酶消化掉線性dna，消化時(shí)間需要1-2周。加上滾環(huán)擴(kuò)增、基因文庫(kù)制備和數(shù)據(jù)分析，送樣檢測(cè)周期長(zhǎng)達(dá)1.5-2個(gè)月。(二)檢測(cè)成本高。由于需要長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)操作以及需要用到基因測(cè)序儀器，eccdna測(cè)序分析價(jià)格昂貴。(三)檢測(cè)針對(duì)性弱。由于對(duì)eccdna的測(cè)序分析是對(duì)細(xì)胞內(nèi)存在的全部環(huán)形dna進(jìn)行測(cè)序的，故檢測(cè)的針對(duì)性較弱。部分疾病的產(chǎn)生只與某一段或數(shù)段存在于eccdna的基因片段有關(guān)，通過(guò)對(duì)這一段或數(shù)段的基因片段進(jìn)行檢測(cè)即可對(duì)病理特征進(jìn)行分析，如果每次都使用基因測(cè)序方法對(duì)此類(lèi)eccdna進(jìn)行檢測(cè)，則都需要經(jīng)歷長(zhǎng)周期、高花費(fèi)的測(cè)序過(guò)程，獲得的大量測(cè)序數(shù)據(jù)只有極少的部分被用到，導(dǎo)致資源利用效率低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種基于crispr技術(shù)的eccdna快速檢測(cè)方法。

2、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，我們將采用如下所述的技術(shù)方案加以實(shí)施：

3、一種基于crispr技術(shù)的eccdna快速檢測(cè)方法，其特征在于，在不消化基因組中線性dna的情況下，包括如下所述的步驟：

4、s1、利用crispr技術(shù)，將cas9n-sgrna結(jié)合到目標(biāo)雙鏈環(huán)形dna的靶位點(diǎn)；

5、s2、根據(jù)所述靶位點(diǎn)序列信息合成長(zhǎng)度為40nt的單鏈dna探針，并將所述40nt的單鏈dna探針結(jié)合到sgrna的非互補(bǔ)鏈上；

6、s3、以長(zhǎng)度為40nt的單鏈dna探針為模板，在靶位點(diǎn)處使用kl?enow大片段酶延長(zhǎng)sgrna的非互補(bǔ)鏈；

7、s4、以sgrna的非互補(bǔ)鏈延長(zhǎng)區(qū)域?yàn)槠瘘c(diǎn)，以與40nt的單鏈dna探針對(duì)應(yīng)的20nt探針為引物，對(duì)目標(biāo)雙鏈環(huán)形dna進(jìn)行鏈取代反應(yīng)，使目標(biāo)雙鏈環(huán)形dna變?yōu)閱捂湱h(huán)狀dna；

8、s5、在反應(yīng)體系中加入滾環(huán)擴(kuò)增引物，使用ph?i29對(duì)鏈取代得到的單鏈環(huán)狀dna進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，獲得滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物；

9、s6、利用crispr技術(shù)，將cas14a-sgrna和報(bào)告探針結(jié)合到滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的靶位點(diǎn)，激發(fā)反式切割活性，切割報(bào)告探針；

10、s7、定容反應(yīng)體系，在熒光分光光度計(jì)下進(jìn)行熒光檢測(cè)。

11、作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述eccdna快速檢測(cè)方法的具體操作步驟，如下所述：

12、s21、在目標(biāo)雙鏈環(huán)形dna上，選取靶位點(diǎn)，根據(jù)靶位點(diǎn)的序列信息，合成cas9n蛋白的sgrna；

13、s22、取1.5ml?ep管，設(shè)置反應(yīng)體系為20μl，加入cas9n蛋白與sgrna，終濃度均為50nm,加入10×cas9n?buffer?2μl，在37℃下孵育20min:，使cas9n蛋白與sgrna相結(jié)合；

14、s23、在反應(yīng)體系中加入目標(biāo)雙鏈環(huán)形dna，終濃度為5nm，在37℃下孵育30min，使cas9n-sgrna結(jié)合到目標(biāo)雙鏈環(huán)形dna的靶位點(diǎn)；

15、s24、將1μl根據(jù)靶位點(diǎn)序列信息合成的長(zhǎng)度為40nt的單鏈dna探針，加入到反應(yīng)體系，使單鏈dna探針終濃度為500nm，在37℃下孵育20min，使單鏈dna探針結(jié)合到sgrna的非互補(bǔ)鏈上；

16、s25、在反應(yīng)體系中加入2μl?dntp、1μl?kl?enow大片段酶以及對(duì)應(yīng)反應(yīng)buffer，以40nt的單鏈dna探針為模板，使用kl?enow大片段酶延長(zhǎng)sgrna的非互補(bǔ)鏈；

17、s26、在反應(yīng)體系中加入2μl蛋白酶k,在52℃下孵育60min,使cas9n-sgrna從靶位點(diǎn)脫落；

18、s27、將整個(gè)反應(yīng)體系在95℃下孵育10min，滅活蛋白酶k；

19、s28、反應(yīng)體系冷卻至常溫后，加入與40nt單鏈dna探針對(duì)應(yīng)的20nt探針1μl，使得20nt探針終濃度為500nm,再加入1μl?ph?i29?dna聚合酶以及對(duì)應(yīng)反應(yīng)buffer啟動(dòng)滾環(huán)擴(kuò)增，在30℃下滾環(huán)48h，獲得滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物；

20、s29、在滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物上，選取靶位點(diǎn)，根據(jù)靶位點(diǎn)的序列信息，合成cas14a蛋白的sgrna；

21、s210、取1.5ml?ep管，設(shè)置反應(yīng)體系為40μl，加入cas14a蛋白與sgrna，cas14a終濃度為50nm,sgrna終濃度為100nm，加入10×cas14a?buffer?4μl，在37℃下孵育20min，使cas14a蛋白與sgrna相結(jié)合；

22、s211、在反應(yīng)體系中加入20μl的滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物，再加入2μl報(bào)告探針，使報(bào)告探針終濃度為2μm，在37℃下孵育30min，使cas14a-sgrna結(jié)合到滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的靶位點(diǎn)上，激發(fā)反式切割活性，切割報(bào)告探針；

23、s212、將反應(yīng)體系定容至100μl，在熒光分光光度計(jì)下進(jìn)行熒光檢測(cè)。

24、作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述步驟s211的孵育時(shí)間的調(diào)整是根據(jù)待測(cè)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度進(jìn)行的，當(dāng)待測(cè)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物濃度低時(shí)，延長(zhǎng)孵育時(shí)間至4h。

25、作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述步驟s24的單鏈dna探針通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合到sgrna的非互補(bǔ)鏈上。

26、作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，通過(guò)增加滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物上結(jié)合cas14a的密度來(lái)提高檢測(cè)靈敏度。

27、作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述20nt單鏈dna探針序列為：5'-ctaag?gatgc?gtgtaattgc-3'。

28、作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述報(bào)告探針序列為：fam-tttttttttttt-bhq1。

29、作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述40nt單鏈dna探針序列為：5'-ctaag?gatgc?gtgtaattgc?atctc?tctcc?ttcta?gcctc-3'。

30、作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述目標(biāo)雙鏈環(huán)形dna包括但不限于質(zhì)粒dna、細(xì)胞裂解液dna、動(dòng)植物組織dna等。

31、有益效果

32、1、本發(fā)明由于靶向含有特定序列的eccdna進(jìn)行擴(kuò)增，不對(duì)線性dna與不含靶位點(diǎn)的其他eccdna進(jìn)行擴(kuò)增，所以在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)不需要提前消化線性dna，加上沒(méi)有構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)與上機(jī)測(cè)許的步驟，故相比環(huán)狀dna測(cè)序法會(huì)大大縮短反應(yīng)時(shí)間，提高整個(gè)反應(yīng)體系的效率，測(cè)周期可以縮短到60小時(shí)以?xún)?nèi)；

33、2、本發(fā)明所述的eccdna檢測(cè)方法可以在恒溫下對(duì)目標(biāo)eccdna進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)大型檢測(cè)儀器的依賴(lài)低，主要檢測(cè)成本在cas14a與cas9n蛋白的sgrna合成步驟，相比環(huán)狀dna測(cè)序法，檢測(cè)成本大幅降低；

34、3、本發(fā)明通過(guò)cas9n與cas14a的兩次靶向結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)靶位點(diǎn)的精準(zhǔn)擴(kuò)增與檢測(cè)，克服了cas9n蛋白脫靶效應(yīng)所帶來(lái)的影響，能做到對(duì)含有特定靶序列的eccdna進(jìn)行針對(duì)性檢測(cè)；

35、4、本發(fā)明經(jīng)過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增與cas14a反式切割這兩步信號(hào)放大過(guò)程，并且可以通過(guò)增加rca產(chǎn)物上結(jié)合cas14a的密度來(lái)提高檢測(cè)靈敏度，對(duì)雙鏈環(huán)狀dna的檢測(cè)限可以達(dá)到1fm。