本發(fā)明屬于抗體工程，尤其涉及一種抗igf-1抗體及其抗原結(jié)合片段。

背景技術(shù)：

1、igf-1是一類結(jié)構(gòu)與胰島素相似的多肽，由70個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋白，其分子量為7649da，igf-1與胰島素氨基酸序列具有48％的同源性，并具有相同的二硫鍵結(jié)合位點(diǎn)。其結(jié)構(gòu)也與胰島素類似，分為(nh-b-c-a-d-cooh)4個(gè)域，b(1-29)、c(30-41)、a(42-62)和d(63-70)。域a和b分別是胰島素b和a鏈的結(jié)構(gòu)同源物域，c與胰島素原的連接肽類似，而d域在胰島素中沒有對應(yīng)物。igf-1是動(dòng)物和人體內(nèi)非常重要的細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)劑；對維持與細(xì)胞分化有關(guān)蛋白質(zhì)水平十分重要，與一些生長因子合用能促進(jìn)細(xì)胞分化成熟。

2、igf-1的基因結(jié)構(gòu)在狗、人、牛、綿羊和豬中序列一致，且還展現(xiàn)出跨物種活性。igf-1在大量組織和細(xì)胞類型中表達(dá)且具有自分泌，旁分泌和內(nèi)分泌功能。分泌后，igf-1進(jìn)入血流中后立即與igfbp形成復(fù)合物，從而防止蛋白水解或與其受體結(jié)合。igf-1是動(dòng)物和人體內(nèi)非常重要的細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)劑；對維持與細(xì)胞分化有關(guān)蛋白質(zhì)水平十分重要，與一些生長因子合用能促進(jìn)細(xì)胞分化成熟。目前發(fā)現(xiàn)igf-1似乎對壽命有顯著影響，改變胰島素/胰島素樣信號(iis)讓秀麗隱桿蟲壽命增加100％，而改變雷帕霉素靶點(diǎn)(tor)通路使其壽命增加30％，融合兩者的雙突變體讓線蟲壽命延長5倍。

3、在大型犬(canis?lupusfamiliaris)和巨型犬中，體型繁殖導(dǎo)致這些狗的igf-1水平高度升高，igf-1是一種驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生長的激素。高igf-1有效地驅(qū)使這些動(dòng)物在年輕時(shí)長大，但成年狗的高igf-1水平被認(rèn)為會(huì)加速它們的衰老并縮短它們的健康壽命。大型犬的壽命一般比小型犬短，通常短一半。像大丹犬這樣的巨型品種的平均壽命為7-10年，而像吉娃娃這樣的小型品種的平均壽命為14-16年。berryman等人在對犬的研究中發(fā)現(xiàn)，與小型犬相比，大型犬會(huì)分泌更多的igf-1，這是一種促進(jìn)骨骼和肌肉生長的物質(zhì)，是導(dǎo)致大型犬快速生長和體型較大的一個(gè)原因，從而導(dǎo)致大型犬的壽命更短；此外，igf-1會(huì)升高患某些疾病的風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，導(dǎo)致大型犬比小型犬更容患腫瘤和癌癥等疾病。bertrandjordan等發(fā)現(xiàn)與狗體型相關(guān)的最顯著的多態(tài)性發(fā)生在igf-1基因區(qū)域，對大約50只狗血液中igf-1蛋白血清濃度的測量表明，它與狗的體重(以及t等位基因的存在)呈正相關(guān)。igf-1基因座已被證明導(dǎo)致了品種間約15％的身高差異。高igf-1有效地驅(qū)使這些動(dòng)物在年輕時(shí)長大，但成年犬的高igf-1水平被認(rèn)為會(huì)加速它們的衰老并縮短它們的健康壽命。提高成年犬的壽命存在很大挑戰(zhàn)。

4、已報(bào)導(dǎo)igf-1抗體顯示可抑制以20ng/ml人類igf-1刺激之小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞系balb/c3t3的增殖(russell等人，1984)。臨床候選藥物km1468為可以中和人igf-i、人igf-ii和小鼠igf-ii的生物活性而不會(huì)中和小鼠igf-i的生物活性的大鼠單克隆抗體，已證實(shí)km1468可以中和人類的igf-i和igf-i，可以抑制植入非肥胖糖尿病/嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺陷小鼠中的成人骨中的人類前列腺癌細(xì)胞的生長(goya等人，2004)。另外，已證實(shí)km1468可抑制人類結(jié)腸直腸癌的肝轉(zhuǎn)移(miyamoto等人，2005)。這些驗(yàn)證igf-1的抗體有可能成為一種降低成年犬的igf-1水平的新思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)，在已擁有的噬菌體文庫中淘篩，篩選出特異性igf-1單克隆陽性菌株；構(gòu)建原核表達(dá)載體，獲得可特異表達(dá)igf-1單域抗體的菌株，制備并純化igf-1單域抗體。此外，本發(fā)明還提供親和力提高的突變體。

2、免疫球蛋白或抗體

3、免疫球蛋白或抗體的輕鏈和重鏈區(qū)分為可變區(qū)(v)和恒定區(qū)(c)。抗體可變區(qū)由v、d和j三個(gè)基因段隨機(jī)組合而成，在人類和其他哺乳動(dòng)物中，這些基因段的數(shù)量和組合方式非常復(fù)雜，從而使得抗體分子具有極高的可變性?？贵w分子的可變區(qū)由六個(gè)互相連接的區(qū)域組成，即cdr1、cdr2和cdr3以及它們之間的fr1、fr2、fr3和fr4。cdr1和cdr2位于可變區(qū)的兩端，它們主要參與抗原的識別和結(jié)合。cdr3則位于可變區(qū)的中央，它是抗體特異性的最主要決定因素。fr1、fr2、fr3和fr4則是cdr1、cdr2和cdr3之間的支撐結(jié)構(gòu)，它們主要負(fù)責(zé)維持可變區(qū)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。每個(gè)vh和vl由三個(gè)cdr域和四個(gè)fr域構(gòu)成，按以下順序從氨基末端排到羧基末端：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。

4、免疫球蛋白或抗體的輕鏈可分為kappa(κ)型或lambda(λ)型，每個(gè)抗體含有的兩條輕鏈通常相同；根據(jù)y單體的數(shù)量和重鏈的類型，可將哺乳動(dòng)物體內(nèi)的抗體分為五種同型：igg、igm、iga、igd和ige。這些同型在生物特性、功能區(qū)域以及結(jié)合不同抗原的能力方面均有所不同。

5、抗原結(jié)合片段

6、在本文中，“抗體”以最廣泛意義使用，指包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)，涵蓋各種結(jié)構(gòu)的天然抗體、合成抗體、修飾抗體，包括但不限于完整的傳統(tǒng)抗體、抗原結(jié)合片段。

7、所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗原結(jié)合片段可以是但不限于fab，fab'，f(ab')2，fv，單鏈抗體(scfv)，單域抗體(sdab)，hcab，cdr片段。

8、本發(fā)明中所述的“fab”是由一條輕鏈和一條重鏈的可變區(qū)以及恒定區(qū)ch1結(jié)構(gòu)域組成。fab分子的重鏈不能與另一條重鏈分子形成二硫鍵。展示在噬菌體外殼蛋白上的抗體fab片段具有相對較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并且可以很容易地轉(zhuǎn)化為完整的ig抗體，通常不會(huì)損害結(jié)合活性。

9、本發(fā)明中所述的“fab’”含有一條輕鏈和一條重鏈的可變區(qū)、ch1結(jié)構(gòu)域以及ch1與ch2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域)，以便可在兩個(gè)fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成f(ab')2分子。

10、本發(fā)明中所述的“f(ab')2”由通過兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個(gè)fab’片段組成。

11、本發(fā)明中所述的“fv”包含重鏈和輕鏈的可變區(qū)，但缺乏恒定區(qū)。

12、本發(fā)明中所述的“單鏈抗體(scfv)”由重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過短肽(linker)連接而成。如果僅使用單個(gè)vh和vl，單鏈抗體是單價(jià)的；如果使用兩個(gè)vh和vl，則是二價(jià)的；或如果使用兩個(gè)以上vh和vl，則是多價(jià)的。

13、本發(fā)明中所述的“sdab”只包含單一的抗體可變區(qū)，因其大小通常在15kd左右且體積為納米級，又被稱為納米抗體。單域抗體具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，可以較好地與抗原結(jié)合，且不易于與機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，除此之外還具有可溶性好、易表達(dá)等特點(diǎn)，可滿足臨床試驗(yàn)的各種要求。由于單域抗體結(jié)構(gòu)簡單且具有較強(qiáng)的特異性，這使得對單域抗體的改造更加容易，并且在疾病的臨床診斷和后續(xù)治療中充分發(fā)揮自身的優(yōu)勢。

14、本發(fā)明中所述的“hcab”由一個(gè)納米抗體(vhh)和兩個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域ch2、ch3區(qū)組成。

15、cdr移植抗體是在嵌合抗體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步用犬源框架區(qū)(frameworkregion，fr)替代鼠源框架區(qū)(fr)，僅保留了3個(gè)鼠源性cdr，其他為犬源結(jié)構(gòu)。

16、互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)

17、在本文中，“互補(bǔ)決定區(qū)”或“cdr區(qū)”或“cdr”可以互換使用，重鏈的三個(gè)cdr稱為cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，輕鏈的三個(gè)cdr稱為cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。

18、所述cdr的最常用編碼規(guī)則由kabat?e.a等人提供。此外，imgt(lefranc，2003)、chothia(al-lazikani，1997)等均提供了cdr編碼規(guī)則，這些規(guī)則是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。本技術(shù)中抗體的cdr可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本領(lǐng)域的任何方案確定邊界。

19、應(yīng)該注意的是，基于不同定義方式獲得的同一抗體的cdr的邊界可能有所差異，即不同定義方式下獲得的同一抗體可變區(qū)的cdr序列有所不同。因此，當(dāng)后者抗體的互補(bǔ)決定區(qū)序列包含本技術(shù)所述的cdr的序列，但只是由于采用了不同的cdr邊界定義方式而導(dǎo)致其所聲稱的cdr邊界與本技術(shù)所定義的具體cdr邊界不同的抗體，仍落在本技術(shù)保護(hù)范圍內(nèi)。

20、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述cdr是根據(jù)kabat編號系統(tǒng)定義的，所述的抗體或抗原結(jié)合片段的vl區(qū)和vh區(qū)的cdr氨基酸殘基在數(shù)量和位置由kabat編號規(guī)則確定。

21、在一實(shí)施例中，所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:1所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:2所示，其cdr區(qū)所在位置由kabat編號規(guī)則確定，具體如下：

22、 v區(qū) cdr1 cdr2 cdr3 h 31-35 50-66 99-106 l 23-33 49-55 88-98

23、在一實(shí)施例中，所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:3所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:4所示，其cdr區(qū)所在位置由kabat編號規(guī)則確定，具體如下：

24、 v區(qū) cdr1 cdr2 cdr3 h 31-35 50-66 99-110 l 23-35 51-57 90-100

25、在一實(shí)施例中，所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:5所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:6所示，其cdr區(qū)所在位置由kabat編號規(guī)則確定，具體如下：

26、 v區(qū) cdr1 cdr2 cdr3 h 31-35 50-66 99-110 l 23-35 51-57 90-100

27、在一實(shí)施例中，所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:7所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:8所示，其cdr區(qū)所在位置由kabat編號規(guī)則確定，具體如下：

28、 v區(qū) cdr1 cdr2 cdr3 h 31-35 50-66 99-103 l 23-35 51-57 90-100

29、在一實(shí)施例中，所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:9所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:10所示，其cdr區(qū)所在位置由kabat編號規(guī)則確定，具體如下：

30、 v區(qū) cdr1 cdr2 cdr3 h 31-35 50-66 99-108 l 23-35 51-57 90-100

31、在一些實(shí)施例中，本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合片段包含重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)，其中，重鏈互補(bǔ)決定區(qū)選自：

32、 cdr-h1 cdr-h2 cdr-h3 1 nygms gitstggttyyadavkg gwfssfdy 2 dygms gitstggttyyadavkg gwfssfdy 3 eygms gitstggttyyadavkg gwfssfdy 4 nyams gitstggttyyadavkg gwfssfdy 5 nygms aitstggttyyadavkg gwfssfdy 6 nygms gitsnggttyyadavkg gwfssfdy 7 nygms gitstgtttyyadavkg gwfssfdy 8 eygms gitstgtttyyadavkg gwftsfdy 9 nygms gitatggttyyadavkg gwfssfdy 10 nygms gitstggttyyadavkg awfssfdy 11 nygms gitstggttyyadavkg gwftsfdy 12 eyams aitatgtttyyadavkg awftsfdy 13 nygms gilstggttyyadavkg gwfssfdy 14 dyymy rinidgtttwysnavkg evfrggarsped 15 tysms gisnggsvtyytdavkg gqygstwyggdy 16 syamn wirsdgrrtyyadavkg gakdy 17 syams ginsggsstsyadavkg rpvgtgnfey

33、在一些實(shí)施例中，本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合片段包含重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)，其中，輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)選自：

34、 cdr-l1 cdr-l2 cdr-l3 1 ggdsigsksvq ygtnrpa qvwdrsnkaiv 2 ggdsigsrsvq ygtnrpa qvwdrsnkaiv 3 ggdsigskdvq ygtnrpa qvwdrsnkaiv 4 ggdsigskmvq ygtnrpa qvwdrsnkaiv 5 ggdsigsksvq ygtnrpa qvwdssnkaiv 6 ggdsigsksvq ygtnrpa qvwdrsnqaiv 7 tgsssnigrgsva innnrps sswdsslrsav 8 tgsssnigrgsvr snsnrps ssydsslrgiv 9 tgsssnigrghvs annnrps stwdsslkaav 10 tgsspnigrgsva vnnnrps sswdtslsdlv

35、在一些實(shí)施例中，所述抗體的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)選自：

36、

37、

38、本發(fā)明所述的抗體可以是但不限于鼠抗、鼠-犬嵌合抗體、犬源化抗體、或者犬抗。

39、在實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的單價(jià)fab可以連接到另外的靶向不同蛋白的fab或scfv，以產(chǎn)生雙特異性抗體。雙特異性抗體可以具有雙重功能，例如由本發(fā)明賦予的治療功能和可以結(jié)合到受體分子以增強(qiáng)跨生物屏障轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

40、以下可互用的術(shù)語“雙抗”、“雙功能抗體”、“雙特異性抗體”、“bispecificantibody”或“bsab”是指擁有2個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，從而可以同時(shí)與兩個(gè)靶抗原結(jié)合，在發(fā)揮抗體靶向性的同時(shí)具有介導(dǎo)另外一種特殊功能的作用，所介導(dǎo)的特殊功能效應(yīng)分子還可以是藥物、受體、毒素、酶、細(xì)胞因子、放射核素等，雙特異性抗體結(jié)合抗原的兩條臂可分別來自fab、fab'、fv、scfv、dsfv、sdab、hcab或cdr片段等。

41、本文所述的“抗原結(jié)合片段”指能夠與表位結(jié)合的抗體的片段、部分、區(qū)域或結(jié)構(gòu)域?？乖Y(jié)合片段可以含有該類抗體的1、2、3、4、5或完整的6個(gè)cdr域，并且盡管能夠結(jié)合到所述表位，仍可以展現(xiàn)出不同的特異性、親和力或選擇性。優(yōu)選地，抗原結(jié)合片段含有所述抗體的所有6個(gè)cdr域。

42、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體及其抗原結(jié)合片段是嵌合抗體。嵌合抗體，指重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種的或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體的相應(yīng)序列是相同或同源的，而鏈的其余部分與來自另一個(gè)物種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體類別或亞類的抗體以及此類抗體的片段的相應(yīng)序列是相同的或同源的，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。本發(fā)明提供了來自鼠抗體的可變區(qū)抗原結(jié)合序列。因此，本發(fā)明提及的嵌合抗體包括具有一個(gè)或多個(gè)鼠抗原結(jié)合序列(如cdr)并含有一個(gè)或多個(gè)來自犬抗體的序列如fr或c區(qū)序列的抗體。

43、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體及其抗原結(jié)合片段是犬源化抗體?！叭椿贵w”指其中來源于另一種哺乳動(dòng)物物種如小鼠的種系的cdr序列已被移植到犬框架序列上的抗體。

44、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體及其抗原結(jié)合片段是犬抗體或全犬抗體。

45、序列同一性

46、本文中所述的“同一性”是指兩個(gè)或更多個(gè)蛋白質(zhì)或多肽分子的序列之間的關(guān)系，如通過比對和比較序列來測定氨基酸之間的相同殘基的百分比，并且可基于待比較的最小的分子的大小來計(jì)算。利用程序提供的缺省缺口權(quán)重，進(jìn)行最佳對齊。

47、“保守氨基酸置換”，即其中氨基酸殘基被具有擁有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或正在水性)的側(cè)鏈r基團(tuán)的另一個(gè)氨基酸殘基置換。一般地，保守氨基酸置換將基本上不改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在其中兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列彼此相異在于保守置換的情況下，可上調(diào)百分比序列同一性以就置換的保守性質(zhì)進(jìn)行修正。用于進(jìn)行該調(diào)整的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。因此，此類改變導(dǎo)致的序列同一性高于90％以上，這樣的序列被認(rèn)為仍落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。具體地，在后序列與申請中列舉的序列seq?id?no:1、seqid?no:3、seq?id?no:5、seq?id?no:7、seq?id?no:9、seq?id?no:2、seq?id?no:4、seq?idno:6、seq?id?no:8或seq?id?no:10具有90％或更多(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的序列同源性。

48、重組與表達(dá)

49、本發(fā)明提供一種分離的核酸，包含編碼所述的抗體的多核苷酸序列。

50、本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包括上述核酸分子。

51、重組表達(dá)載體在將原核細(xì)胞作為宿主的情況下，通常包含可使轉(zhuǎn)錄進(jìn)行的強(qiáng)力的啟動(dòng)子(例如，tac啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、lacuv5啟動(dòng)子、lpp啟動(dòng)子、plλ啟動(dòng)子、prλ啟動(dòng)子、rac5啟動(dòng)子、amp啟動(dòng)子、reca啟動(dòng)子、sp6啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子及t7啟動(dòng)子)、用于開始翻譯的核糖體結(jié)合位置及轉(zhuǎn)錄/翻譯結(jié)束序列。

52、重組表達(dá)載體在將真核細(xì)胞作為宿主的情況下，可利用來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組的啟動(dòng)子(例如：金屬硫蛋白啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、人血紅蛋白啟動(dòng)子及人肌酸啟動(dòng)子)或來源于哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如：腺病毒后期啟動(dòng)子、牛痘病毒7.5k啟動(dòng)子、sv40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子、hsv的tk啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒(mmtv)啟動(dòng)子、hiv的ltr啟動(dòng)子、莫洛尼病毒的啟動(dòng)子、eb病毒(ebv)的啟動(dòng)子及勞斯肉瘤病毒(rsv)的啟動(dòng)子)。

53、另外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還包括質(zhì)粒(例如，pcl、psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pcdna3.4、pet系列及puc19等)、噬菌體(例如λgt4.λb、λ-charon、λδz1及m13等)或病毒(例如sv40等)。

54、本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包括上述核酸分子或上述重組表達(dá)載體。

55、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如e.coli、枯草芽胞桿菌(bacillus?subtilis)、鏈霉菌(streptomyces?sp.)、假單孢菌(pseudomonas?sp.)、奇異變形桿菌(proteus?mirabilis)或葡萄球菌(staphylococcus?sp.)。

56、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可以是真菌，例如曲霉菌(aspergillussp.)，酵母細(xì)胞如甲醇酵母(pichia?pastoris)、釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces?sp.)和粗糙脈胞菌(neurospora?crassa)，低級真核細(xì)胞和諸如昆蟲細(xì)胞之類的高級真核細(xì)胞。

57、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可以來自植物和/或哺乳動(dòng)物。宿主細(xì)胞的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于per.c6細(xì)胞、猴腎細(xì)胞7(cos7，特別是simian?cos細(xì)胞)、nso細(xì)胞、sp2/0、中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞、w138、幼倉鼠腎(bhk)細(xì)胞、madin-darby犬腎(mdck)細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系、hut78細(xì)胞、293t細(xì)胞、293f細(xì)胞以及其它產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的抗體蛋白的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。

58、本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中的方法包括用于將核酸引入有機(jī)體、細(xì)胞、組織或器官的任何方法，可以如本領(lǐng)域所知那樣利用根據(jù)宿主細(xì)胞的類型所選擇的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來進(jìn)行。該方法包括但不限于電穿孔、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣(capo4)沉淀、氯化鈣(cacl2)沉淀、利用碳化硅纖維震蕩(agitation)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，以及peg、硫酸葡聚糖、脂質(zhì)體(lipofectamine)或干燥/抑制所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。

59、應(yīng)用與作用方式

60、本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合片段在以下任一項(xiàng)中的應(yīng)用：

61、1)制備治療或預(yù)防犬的由igf-1介導(dǎo)的相關(guān)疾病的藥物；

62、2)制備延長犬壽命的藥物；

63、3)制備鑒定igf-1的試劑盒。

64、在一實(shí)施例中，抗體偶聯(lián)物、多特異性抗體(優(yōu)選雙特異性抗體)、融合蛋白或藥物組合物等可用于制備延長動(dòng)物尤其是犬的壽命的藥物，主要成分包含本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。

65、優(yōu)選地，所述抗體偶聯(lián)物還包含與所述的抗體或其抗原結(jié)合片段偶聯(lián)的偶聯(lián)部分，所述偶聯(lián)部分選自純化標(biāo)簽、細(xì)胞毒性劑、可檢測的標(biāo)記、放射性同位素、發(fā)光物質(zhì)、有色物質(zhì)、酶或聚乙二醇等。

66、優(yōu)選地，所述多特異性抗體還包含針對其他抗原和/或其他抗原表位的抗體或抗原結(jié)合片段。

67、優(yōu)選地，所述藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。

68、優(yōu)選地，所述藥物組合物為單獨(dú)使用或者與一種或多種藥物聯(lián)用。更優(yōu)選還包含另外的治療劑，所述治療劑選自如下的一種或多種：igf-1通路抑制劑、igf-1抑制劑、igf-1r抑制劑、雷帕霉素靶點(diǎn)(tor)通路抑制劑、雷帕霉素、阿卡波糖、阿司匹林。

69、一種診斷試劑盒，其包含檢測受試者樣品中igf-1的存在和/或水平的試劑，試劑包含特異性結(jié)合igf-1的抗體或抗原結(jié)合片段，優(yōu)選地，所述抗體是單克隆抗體、多克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

70、進(jìn)一步地，試劑盒還包含檢測劑，所述檢測劑選自化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、發(fā)色團(tuán)、熒光標(biāo)記、熒光素型標(biāo)記、傘形酮、麗絲胺、花菁、德克薩斯紅、順磁性標(biāo)記、放射性標(biāo)記、生物素、鏈霉親和素/生物素、親和素/生物素、半抗原、地高辛、金屬絡(luò)合物、金屬、酶、膠體金或其組合。

71、進(jìn)一步地，檢測方法或原理選自化學(xué)發(fā)光測定、電化學(xué)發(fā)光測定、酶聯(lián)免疫吸附測定、免疫熒光測定、免疫組織化學(xué)測定、免疫色譜測定、放射免疫測定、單分子免疫分析技術(shù)(simoa)、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞分選術(shù)、免疫沉淀測定、免疫擴(kuò)散測定、斑點(diǎn)印跡測定、western印跡、蛋白質(zhì)芯片、正電子發(fā)射斷層術(shù)和/或單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層術(shù)，優(yōu)選地，所述試劑盒包括實(shí)施選自化學(xué)發(fā)光測定、電化學(xué)發(fā)光測定、酶聯(lián)免疫吸附測定、免疫熒光測定、免疫組織化學(xué)測定、免疫色譜測定、放射免疫測定、單分子免疫分析技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞分選術(shù)、免疫沉淀測定、免疫擴(kuò)散測定、斑點(diǎn)印跡測定、western印跡和/或蛋白質(zhì)芯片的檢測所需的試劑、材料、容器和/或裝置，優(yōu)選地，所述酶聯(lián)免疫吸附測定選自直接酶聯(lián)免疫吸附測定、間接酶聯(lián)免疫吸附測定、直接夾心酶聯(lián)免疫吸附測定以及間接夾心酶聯(lián)免疫吸附分析。

72、特別地，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合igf-1，優(yōu)選為犬igf-1(登錄號：a0a8i3nbv2)，本發(fā)明構(gòu)建犬igf-1重組蛋白，具體氨基酸序列為：

73、mgpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksale(seq?id?no:11)。

74、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，犬抗重鏈氨基酸序列如seq?id?no:12所示。

75、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，犬抗輕鏈氨基酸序列如seq?id?no:13所示。

76、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，鼠-犬嵌合抗體重鏈氨基酸序列如seq?id?no:14所示。

77、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，鼠-犬嵌合抗體輕鏈氨基酸序列如seq?id?no:15所示。

78、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

79、本發(fā)明提供了多個(gè)靶向igf-1的抗體及其抗原結(jié)合片段；并在優(yōu)選序列上對可變區(qū)cdr進(jìn)行優(yōu)化，使得與igf-1的親和力至少提高2倍以上，為后續(xù)制備靶向藥物、定性/定量檢測試劑盒提供了重要原料。