本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種蔗糖磷酸化酶突變體、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蔗糖磷酸化酶(sucrose?phosphorylase，spase)是gh13家族中的一類(lèi)，ec號(hào)：2.4.1.7，屬于轉(zhuǎn)移酶類(lèi)。spase具有廣泛的受體特異性，能夠?qū)⑵咸烟腔D(zhuǎn)移至不同受體，受體可以是無(wú)機(jī)磷酸、果糖、含酚羥基、醇羥基和羧基的化合物。spase糖基化反應(yīng)產(chǎn)生的化合物在工業(yè)上用途廣泛，是目前比較有前景的研究方向，已經(jīng)商業(yè)化的產(chǎn)品有α-熊果苷、αgg及曲二糖等。

2、l-抗壞血酸(l-ascorbicacid，l-aa)，又稱(chēng)維生素c，具有抗氧化、抗自由基、抑制酪氨酸酶的形成等功能，從而達(dá)到美白、淡斑的效果，可作為化妝品的有效成分。然而由于l-aa的高抗氧化活性，其在自然狀態(tài)下不穩(wěn)定，極易被氧化為脫氧抗壞血酸，大幅度喪失原有的生理藥理活性，這抑制了其在化妝品和食品工業(yè)的廣泛應(yīng)用。因此，人們一直力求尋找一種能讓維生素c轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定性好、容易為肌膚所吸收的物質(zhì)的途徑，將其制備成衍生物是目前的主要途徑之一。

3、目前應(yīng)用較廣泛的衍生物主要有:水溶性維生素c的磷酸酯鹽、維生素c配糖體、維生素c乙基醚衍生物等。其中，l-抗壞血酸2-o-αd-吡喃型葡萄糖苷(l-ascorbic?acid?2-glucoside，aa-2g)作為一種新型穩(wěn)定的維生素c衍生物，是迄今人們發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定、性能最佳的維生素c替代品，現(xiàn)在已經(jīng)被日本政府批準(zhǔn)作為化妝品、準(zhǔn)藥品和食品的添加劑。近些年其主要作為一種美白添加劑應(yīng)用于多種品牌高端化妝品中，例如，法國(guó)歐萊雅、德國(guó)蘭蔻、日本資生堂等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中蔗糖磷酸化酶對(duì)l-抗壞血酸作為糖基受體的轉(zhuǎn)糖苷效率差的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種蔗糖磷酸化酶突變體，其能夠提高催化合成l-抗壞血酸-2-o-α-d-吡喃型葡萄糖苷的產(chǎn)量，提高l-抗壞血酸的轉(zhuǎn)糖苷效率。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種蔗糖磷酸化酶突變體，所述蔗糖磷酸化酶突變體由蔗糖磷酸化酶spase中第396位的天冬酰胺突變成賴(lài)氨酸和第397位的天冬酰胺突變成苯丙氨酸而得到；

4、所述蔗糖磷酸化酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；

5、所述蔗糖磷酸化酶spase的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

6、第二方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，所述載體包含有能夠表達(dá)第一方面所述的蔗糖磷酸化酶突變體的核苷酸序列；

7、所述表達(dá)第一方面所述的蔗糖磷酸化酶突變體的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

8、第三方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含有第二方面所述的表達(dá)載體。

9、優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞選自原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

10、第四方面，本發(fā)明提供了一種l-抗壞血酸-2-o-α-d-吡喃型葡萄糖苷的制備方法，所述制備方法包括：使用第一方面所述的蔗糖磷酸化酶突變體催化l-抗壞血酸與蔗糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)。

11、優(yōu)選地，所述糖基化反應(yīng)中l(wèi)-抗壞血酸作為糖基受體，蔗糖作為糖基供體；

12、所述糖基化反應(yīng)在ph值為5.0～5.5，溫度為35～45℃的條件下進(jìn)行。

13、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述糖基化反應(yīng)中還包含有檸檬酸鈉和亞硫酸鈉參與反應(yīng)。

14、第五方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)第一方面所述的蔗糖磷酸化酶突變體在制備具有提高l-抗壞血酸糖基化效率的作用的催化制劑上的應(yīng)用。

15、第六方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)第二方面所述的表達(dá)載體在制備具有提高l-抗壞血酸糖基化效率的作用的催化制劑上的應(yīng)用。

16、第七方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)第三方面所述的蔗糖磷酸化酶突變體在制備具有提高l-抗壞血酸糖基化效率的作用的催化制劑上的應(yīng)用。

17、本發(fā)明中：

18、本發(fā)明利用基因突變技術(shù)將來(lái)源于短雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶spase氨基酸序列中第396位的天冬酰胺(asn)突變成賴(lài)氨酸(lys)，以及第397位的天冬酰胺(asn)突變成苯丙氨酸(phe)而得到蔗糖磷酸化酶突變體，該突變體由508個(gè)氨基酸組成。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)蔗糖磷酸化酶突變體和突變前的spase相比，提高了對(duì)l-抗壞血酸的轉(zhuǎn)糖苷活力。

19、為了實(shí)現(xiàn)所述蔗糖磷酸化酶突變體n396k/n397f的高效表達(dá)，選擇了原核細(xì)胞或真核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，如大腸桿菌bl21(de3)，并使用了pet-28a(+)載體，該載體攜帶有蔗糖磷酸化酶基因spase，通過(guò)ecori和hindiii酶切位點(diǎn)整合。

20、通過(guò)將突變體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，生產(chǎn)出高活性的酶制劑，該酶能夠以蔗糖為糖基供體，l-抗壞血酸為糖基受體，高效催化合成l-抗壞血酸-2-o-α-d-吡喃型葡萄糖苷(aa-2g)。

21、本發(fā)明有益效果：

22、(1)與野生型酶相比，本發(fā)明提供的蔗糖磷酸化酶突變體在催化l-抗壞血酸轉(zhuǎn)化為aa-2g的過(guò)程中表現(xiàn)出了顯著的活性提升，在小規(guī)模的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，aa-2g的產(chǎn)量從野生型的72g/l提高到了122g/l，增幅達(dá)69.4％。

23、(2)本發(fā)明提供的蔗糖磷酸化酶突變體在5升發(fā)酵罐的規(guī)模化生產(chǎn)中，aa-2g的濃度達(dá)到了160g/l，這表明該突變體在工業(yè)級(jí)生產(chǎn)中也具有高效地催化性能。

技術(shù)特征：

1.一種蔗糖磷酸化酶突變體，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶突變體由蔗糖磷酸化酶spase中第396位的天冬酰胺突變成賴(lài)氨酸和第397位的天冬酰胺突變成苯丙氨酸而得到；

2.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述載體包含有能夠表達(dá)權(quán)利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突變體的核苷酸序列；

3.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞包含有權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞選自原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

5.一種l-抗壞血酸-2-o-α-d-吡喃型葡萄糖苷的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：使用權(quán)利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突變體催化l-抗壞血酸與蔗糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的l-抗壞血酸-2-o-α-d-吡喃型葡萄糖苷的制備方法，其特征在于，所述糖基化反應(yīng)中l(wèi)-抗壞血酸作為糖基受體，蔗糖作為糖基供體；

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的l-抗壞血酸-2-o-α-d-吡喃型葡萄糖苷的制備方法，其特征在于，所述糖基化反應(yīng)中還包含有檸檬酸鈉和亞硫酸鈉參與反應(yīng)。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蔗糖磷酸化酶突變體在制備具有提高l-抗壞血酸糖基化效率的作用的催化制劑上的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體在制備具有提高l-抗壞血酸糖基化效率的作用的催化制劑上的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蔗糖磷酸化酶突變體在制備具有提高l-抗壞血酸糖基化效率的作用的催化制劑上的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種蔗糖磷酸化酶突變體、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞及其應(yīng)用，具體屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域；所述蔗糖磷酸化酶突變體由蔗糖磷酸化酶SPase中第396位的天冬酰胺突變成賴(lài)氨酸和第397位的天冬酰胺突變成苯丙氨酸而得到；所述表達(dá)載體包含有能夠表達(dá)所述的蔗糖磷酸化酶突變體的核苷酸序列；所述宿主細(xì)胞包含有所述的表達(dá)載體；本發(fā)明提供的蔗糖磷酸化酶突變體在催化L?抗壞血酸轉(zhuǎn)化為AA?2G的過(guò)程中表現(xiàn)出了顯著的活性提升，AA?2G的產(chǎn)量從野生型的72g/L提高到了122g/L，增幅達(dá)69.4％；本發(fā)明提供的蔗糖磷酸化酶突變體在5升發(fā)酵罐的規(guī)模化生產(chǎn)中AA?2G的濃度達(dá)到了160g/L，表明該突變體在工業(yè)級(jí)生產(chǎn)中也具有高效地催化性能。

技術(shù)研發(fā)人員：焦銀山,察亞平,武文慧,黃宇
受保護(hù)的技術(shù)使用者：杭州合碳創(chuàng)物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21