本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，更具體地，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的crrna、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

1、急性髓系白血病(acute?myeloid?leukemia，aml)是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率占我國(guó)成人白血病首位。dna甲基化轉(zhuǎn)移酶3a(dnamethyltransferase?3a)位于人類(lèi)2號(hào)染色體短臂2區(qū)3帶(2q23)，是重要的甲基化轉(zhuǎn)移酶之一，主要負(fù)責(zé)基因組dna從頭甲基化。dnmt3a的突變會(huì)導(dǎo)致dna的異常甲基化，而dna異常的甲基化將通過(guò)影響染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和dna復(fù)制、重組與修復(fù)，從而促發(fā)腫瘤惡性克隆的發(fā)生與快速擴(kuò)增。

2、有研究表明，dnmt3a突變型在成人aml患者中約占20％，其中60％是r882位點(diǎn)突變，且最常見(jiàn)的是r882h突變，是患者分層治療和預(yù)后不良的重要分子生物學(xué)標(biāo)志。另外，與野生型的dnmt3a的aml患者相比，dnmt3a基因突變患者往往為正常核型，因此，檢測(cè)dnmt3a基因的突變位點(diǎn)可以作為識(shí)別正常核型aml患者的預(yù)后指標(biāo)。

3、目前dnmt3a基因r882h突變的檢測(cè)方法中，sanger測(cè)序技術(shù)是經(jīng)典方法，但靈敏度較低，檢測(cè)低頻率突變時(shí)容易出現(xiàn)假陰性；熒光原位雜交技術(shù)(fish)和基因芯片等技術(shù)操作復(fù)雜；而ngs技術(shù)雖然可以定性和定量檢測(cè)，但是檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜，費(fèi)用較高，且對(duì)于低頻率突變數(shù)據(jù)量要求高。

4、因此，需要一種低成本、操作簡(jiǎn)便、同時(shí)具備高靈敏度、高特異性的dnmt3a基因r882h突變的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的crrna、試劑盒及方法，利用包括crrna的試劑盒對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，可以高靈敏度、高特異性地區(qū)分dnmt3a基因野生型和dnmt3a基因r882h突變型。

2、實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案包括如下。

3、本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的crrna，所述crrna的核苷酸序列如seq?id?no:3所示。

4、本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的試劑盒，所述試劑盒包括上述crrna、以及擴(kuò)增引物，所述擴(kuò)增引物包括序列如seq?id?no:4所示的正向引物和序列如seq?id?no:5所示的反向引物。

5、本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的方法，使用上述試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，包括以下步驟：使用所述擴(kuò)增引物分別對(duì)待測(cè)樣本骨髓穿刺物的基因組dna和健康人基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增后，對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行crispr/cas12酶切反應(yīng)，再讀取熒光值。

6、在本發(fā)明中，基于pcr-crispr/cas12a系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了針對(duì)dnmt3a基因r882h突變檢測(cè)的crrna，并在crrna上特定位置引入了1個(gè)錯(cuò)配堿基，同時(shí)通過(guò)在pcr擴(kuò)增引物的正向引物中引入錯(cuò)配堿基的方式引入tttv的pam位點(diǎn)，解決靶標(biāo)突變位點(diǎn)處無(wú)pam區(qū)問(wèn)題；在此構(gòu)思下，利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的crrna和pcr擴(kuò)增引物，對(duì)待測(cè)樣本骨髓穿刺物進(jìn)行檢測(cè)，可以高靈敏度(最低檢測(cè)限可達(dá)10copies/μl)、高特異性(可檢出突變頻率為0.1％低豐度突變型樣本)地區(qū)分dnmt3a基因野生型和r882h突變型，且本發(fā)明的檢測(cè)方法成本低，操作簡(jiǎn)單。

技術(shù)特征：

1.一種檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的crrna，其特征在于，所述crrna的核苷酸序列如seq?id?no:3所示。

2.一種檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的crrna、以及擴(kuò)增引物，所述擴(kuò)增引物包括序列如seq?id?no:4所示的正向引物和序列如seq?id?no:5所示的反向引物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的試劑盒，其特征在于，還包括熒光探針，所述熒光探針的核苷酸序列為5～15個(gè)隨機(jī)堿基，所述熒光探針的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，所述熒光探針的3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的試劑盒，其特征在于，所述熒光基團(tuán)為fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe或texas?red，所述淬滅基團(tuán)為tamra、dabcyl、mgb、bhq-1、bhq-2或bhq-3。

5.一種檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求2～4任一項(xiàng)所述的試劑盒，包括以下步驟：使用所述擴(kuò)增引物分別對(duì)待測(cè)樣本骨髓穿刺物的基因組dna和健康人基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增后，對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行crispr/cas12酶切反應(yīng)，再讀取熒光值。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：mastermix?25μl，終濃度均為0.4～0.6μm的正向引物和反向引物，5～20μl模板、無(wú)核酸酶水加至50μl。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性30s；變性10s，退火10s，延伸10s，循環(huán)35次。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的方法，其特征在于，所述crispr/cas12酶切反應(yīng)的反應(yīng)體系包括：nebuffer?2μl，終濃度為0.05μm～0.2μm的cas12a，終濃度為0.05μm～0.2μm的crrna，15～25urecombination?rnase?inhibitor，0.25μm～1μm熒光探針，2μl～10μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物，無(wú)核酸酶水加至20μl。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的方法，其特征在于，所述crispr/cas12酶切反應(yīng)的反應(yīng)溫度為37℃±2℃，反應(yīng)時(shí)間為10～30min。

10.根據(jù)權(quán)利要求5～9任一項(xiàng)所述的檢測(cè)dnmt3a基因r882h突變的方法，其特征在于，還包括分析熒光值的步驟，當(dāng)待測(cè)樣本的熒光值與健康人樣本的熒光值相比有顯著性差異時(shí)，則待測(cè)樣本的dnmt3a基因存在r882h突變。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)DNMT3A基因R882H突變的crRNA、試劑盒和方法，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示，所述試劑盒包括上述crRNA、以及序列如SEQ?ID?NO:4所示的正向引物和序列如SEQ?ID?NO:5所示的反向引物。利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的crRNA和PCR擴(kuò)增引物，對(duì)待測(cè)樣本骨髓穿刺物進(jìn)行檢測(cè)，可以高靈敏度、高特異性地區(qū)分DNMT3A基因野生型和R882H突變型，且本發(fā)明的檢測(cè)方法成本低，操作簡(jiǎn)單。

技術(shù)研發(fā)人員：陳濤,孫如美,繆夏萍,蔣清楊,蒙裕歡,范喜杰,程雅婷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州市金域轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21