本發(fā)明涉及一種酶制劑的制備方法，尤其是一種固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶(pgase)復(fù)合微球制劑的制備方法。

背景技術(shù)：

1、蛋白中富含谷氨酰胺殘基，它們通過疏水或氫鍵相互作用誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的聚集和沉淀，使其溶解度降低，而低溶解度會(huì)影響蛋白質(zhì)的其他加工特性(如起泡性、乳化性和穩(wěn)定性等)和消化吸收特性，限制了蛋白在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。采用物理法和化學(xué)法對(duì)蛋白質(zhì)脫酰存在隨機(jī)性和安全性低等問題，而酶法脫酰胺則具有安全高效的優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶(pgase)是一種新型食品工業(yè)用酶，它具有很好的脫酰胺作用，且只對(duì)蛋白質(zhì)及大分子多肽的谷氨酰胺殘基起作用而不引起蛋白質(zhì)的交聯(lián)和水解，目前已廣泛應(yīng)用于蛋白的改性。

2、然而，游離的pgase酶易出現(xiàn)團(tuán)聚和自脫酰胺，導(dǎo)致酶活性低、穩(wěn)定性差，且價(jià)格昂貴、不能重復(fù)使用，進(jìn)而限制了pgase酶在食品工業(yè)中應(yīng)用。酶固定化是提高酶穩(wěn)定性和使用效率、降低成本的關(guān)鍵技術(shù)之一，但目前對(duì)于pgase酶的固定化研究鮮有報(bào)道。此外，對(duì)于固定化蛋白酶而言，酶分子和作用底物都是蛋白大分子，由于存在結(jié)構(gòu)變化、位阻效應(yīng)、分配效應(yīng)以及擴(kuò)散限制等，都會(huì)導(dǎo)致固定化酶的活力損失，如何提高固定化酶的活力是該技術(shù)中的瓶頸難題。

3、我們前期研究發(fā)現(xiàn)花粉壁微凝膠可以提高pgase酶的活性，從微觀結(jié)構(gòu)上看，花粉壁微凝膠具有大量微米級(jí)孔洞結(jié)構(gòu)，可以為pgase酶的附著提供天然的空間，有效解決了傳質(zhì)阻力過大或過小的問題；從化學(xué)組成上看，花粉壁微凝膠上含有較多的羥基和羧基等基團(tuán)，可以為pgase酶提供天然的附著位點(diǎn)，避免了復(fù)雜的載體修飾可能對(duì)酶分子產(chǎn)生的不利影響?；诖?，本發(fā)明利用花粉壁微凝膠并對(duì)其進(jìn)行改造，獲得價(jià)廉、高效的天然生物質(zhì)固定化pgase酶，從而提高pgase酶的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種基于花粉壁微凝膠的復(fù)合微球固定化pgase酶(負(fù)載pgase酶的花粉壁復(fù)合凝膠微球)的制備方法，主要是為了達(dá)到方便使用和重復(fù)回收的目的，其次是為了進(jìn)一步提高酶活。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明使用了以下技術(shù)方案：

3、一種復(fù)合微球固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的制備方法，包括以下步驟：

4、s1，將向日葵花粉水洗干凈后進(jìn)行脫脂、堿解，使花粉水合并溶脹形成多孔結(jié)構(gòu)的花粉壁微凝膠；

5、s2，配制海藻酸鈉水溶液，將花粉壁微凝膠與海藻酸鈉水溶液混合，以cacl2為交聯(lián)劑制備復(fù)合空白微球；

6、s3，用edc/nhs對(duì)復(fù)合空白微球進(jìn)行活化；

7、s4，將活化后的復(fù)合空白微球加入到蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶溶液中，恒溫?fù)u床震蕩并對(duì)溶液進(jìn)行抽真空處理，過濾，洗滌后得到復(fù)合微球固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶。

8、其中，所述海藻酸鈉水溶液的濃度為1-5％(質(zhì)量)，優(yōu)選3％。

9、其中，所述花粉壁微凝膠與海藻酸鈉水溶液的體積比為0.5-3:1，優(yōu)選2:1。

10、其中，所述cacl2的濃度為0.5-5％(質(zhì)量)。

11、其中，所述edc/nhs混合溶液的濃度為0.025-0.25％(質(zhì)量)，優(yōu)選0.05％，即100g溶液中含edc、nhs各0.05g。

12、其中，所述活化的溫度是20-40℃。

13、其中，所述搖床震蕩的溫度為30-50℃，轉(zhuǎn)速為100-500rpm，時(shí)間為1-5h。

14、優(yōu)選地，所述搖床震蕩的溫度為35℃，轉(zhuǎn)速為200rpm，時(shí)間為3h。

15、本發(fā)明的有益效果是：

16、本發(fā)明制備的具有很高的負(fù)載量和催化脫酰胺活性，能應(yīng)用于各種蛋白的改性以提高蛋白的加工特性。在對(duì)蛋白進(jìn)行改性時(shí)，將固定化pgase直接加入到配好的蛋白溶液中，操作非常方便，并且能通過離心、過濾等方式對(duì)固定化pgase進(jìn)行重復(fù)回收。本發(fā)明制備固定化pgase還易于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸，從而更好地滿足使用需求。

17、本發(fā)明將花粉壁微凝膠與海藻酸鈉凝膠復(fù)配作為微球芯材，克服了花粉壁微凝膠無法交聯(lián)固化成型的缺陷，充分利用了海藻酸鈉的凝膠特性提高了pgase的重復(fù)使用性，并且所加入的海藻酸鈉不影響花粉壁對(duì)pgase的吸附，使產(chǎn)品具有較高的負(fù)載率和酶活。本發(fā)明使用物理吸附+化學(xué)交聯(lián)的方式對(duì)pgase進(jìn)行負(fù)載，相較常規(guī)的包埋工藝或化學(xué)交聯(lián)工藝具有更高的酶學(xué)性能。

18、本發(fā)明使用的原材料均為價(jià)廉、天然的生物質(zhì)材料，具有很高的安全性，在蛋白產(chǎn)業(yè)應(yīng)用方面具有很高的潛力。

技術(shù)特征：

1.一種復(fù)合微球固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合微球固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的制備方法，其特征在于：所述海藻酸鈉水溶液的濃度為1-5％，優(yōu)選3％。

3.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合微球固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的制備方法，其特征在于：所述花粉壁微凝膠與海藻酸鈉水溶液的體積比為0.5-3:1，優(yōu)選2:1。

4.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合微球固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的制備方法，其特征在于：所述cacl2的濃度為0.5-5％。

5.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合微球固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的制備方法，其特征在于：所述edc/nhs混合溶液的濃度為0.025-0.25％，優(yōu)選0.05％。

6.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合微球固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的制備方法，其特征在于：所述活化的溫度是20-40℃。

7.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合微球固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的制備方法，其特征在于：所述搖床震蕩的溫度為30-50℃，轉(zhuǎn)速為100-500rpm，時(shí)間為1-5h。

8.如權(quán)利要求7所述的復(fù)合微球固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的制備方法，其特征在于：所述搖床震蕩的溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200rpm，時(shí)間為3h。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種復(fù)合微球固定化蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的制備方法，它包括以下步驟：首先，將向日葵花粉水洗干凈后進(jìn)行脫脂、堿解，使花粉水合并溶脹形成多孔結(jié)構(gòu)的花粉壁微凝膠；然后，將花粉壁微凝膠與海藻酸鈉溶液混合，以CaCl<subgt;2</subgt;為交聯(lián)劑制備復(fù)合空白微球；最后，用EDC/NHS對(duì)復(fù)合空白微球進(jìn)行活化并加入到PGase溶液中，恒溫?fù)u床震蕩并進(jìn)行抽真空處理，過濾，洗滌后得到復(fù)合微球固定化PGase。本發(fā)明制備的固定化PGase使用方便，能重復(fù)回收，并且還具有很高的負(fù)載量和酶活性，在蛋白產(chǎn)業(yè)應(yīng)用方面具有很高的潛力。

技術(shù)研發(fā)人員：鄧乾春,鄧紫玙,陳尚文,彭登峰,唐小倩,黃亞文
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21