一種制備rhCNB二聚體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種制備rhCNB二聚體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] CNB是|丐調(diào)蛋白磷酸酶Calcineurin,CN)的調(diào)節(jié)亞基。CN是目前所知唯--種依 賴Ca2+/CaM的蛋白磷酸酶，它具有比較窄的底物專一性。于上世紀70年代末、80年代初由 加籍華人王學荊、美籍華人張槐耀及美國的ClaudeB.Klee分別發(fā)現(xiàn)并從牛腦中提純。該 酶由A、B二亞基以1:1的比例組成。A亞基（CNA)是催化亞基，相對分子質(zhì)量61X103;B亞 基（CNB)是調(diào)節(jié)亞基，相對分子質(zhì)量19X103。
[0003] 魏群教授在對CNB長達約20年的研究中發(fā)現(xiàn)，CNB在動物及細胞水平上具有 良好的抑制腫瘤生長的效果，與其他抗癌藥相比處于較高水平，而毒副作用極低，適用范 圍廣。并于1998年申請了專利"含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基的藥物組合物"，專利號為 98117642. 9,該專利中公開了含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B亞基的藥物組合物的分離純化方法， 具體描述為"破碎后菌體經(jīng)l〇〇°C沸水浴30~40分鐘，然后經(jīng)12000rpm離心20分鐘，取 上清，此為CaNB亞基的粗提液。按體積加3mmol/LCaCl2，lmmol/Lf3疏基乙醇和0. 5mol/ LNaCl后上預先經(jīng)緩沖液（20mmol/LTris，pH7.4,0.5mmol/LCaCl2lmmol/LP疏基乙醇） 平衡的phenel-sepharoseCL-4B層析柱，再用同樣的緩沖液洗盡雜蛋白，最后用緩沖液 20mmol/Ltris,pH7. 4,lmmol/LEGTA, 0· 5mmol/LDTT洗脫，每升菌液可得電泳純CaNB亞 基~120mg，所得產(chǎn)物可冷凍干燥保存。
[0004] 專利號98117642. 9所述純化工藝所得產(chǎn)品為CaNB的藥物組合物，并且工藝中帶 有β疏基乙醇、DTT、EGTA等物質(zhì)未經(jīng)下一步清除。
[0005] 因此，提供一種高純度的rhCNB二聚體的方法具有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種制備rhCNB二聚體的方法。本發(fā)明工藝終產(chǎn)品為rhCNB 二聚體，工藝具有創(chuàng)新性且重復性好，適用于中試及生產(chǎn)規(guī)模。
[0007] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種制備rhCNB二聚體的方法，包括如下步驟：
[0009] 步驟1 :制備獲得rhCNB溶液；
[0010] 步驟2 :在pH值為6. 0~7. 0, 2~15°C的反應條件下，取所述rhCNB溶液與氧化 劑混合，氧化12~24h，終止氧化后，純化分離。
[0011] 在本發(fā)明中，粗純液是菌體經(jīng)過細胞破壁、分離，進行初步純化得到的蛋白溶液， 尚待進一步純化。
[0012] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述氧化劑的加入方式為每1~5h分段加入。
[0013] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述rhCNB溶液與所述氧化劑的質(zhì)量比為20 : 1 ~30 :1〇
[0014] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述氧化劑為過氧化氫、碘、氧化型谷肽甘肽、 谷胱甘肽氧化還原對或氧氣中的一種或兩者以上的混合物。
[0015] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述氧化劑的濃度為0. 05%~1% (w/w)。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述終止氧化的試劑為氧化終止液，所述氧化 終止液為亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、0. 1%DTT或還原型谷胱甘肽中的一種或兩者以上的混合 物。
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述氧化終止液的濃度為0. 05%~1% (w/w)。
[0018] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述rhCNB溶液與所述氧化終止液的質(zhì)量比為 50 :1 ~100 :1〇
[0019] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述分離純化采用分子排阻色譜層析，所述分 子排阻色譜層析采用10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液在pH值為5. 8~7. 0的條件下洗脫， 收集rhCNB二聚體蛋白峰。
[0020] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述分子排阻色譜層析采用分離范圍為 3000~70000Da的介質(zhì)。
[0021] 具體的，獲得rhCNB蛋白溶液的制備方法包括：通過適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)含有目標 蛋白的發(fā)酵液，經(jīng)管式離心機離心后收集含目標蛋白的濕菌體，加入5~20倍的重懸緩沖 液，其中重懸緩沖液包括還原性物質(zhì)、酶抑制劑；攪拌均勻在適當?shù)臏囟认率闺s蛋白聚集沉 淀，離心后收集上清液。加入還原性物質(zhì)是為了維持過程中較高含量的rhCNB單鏈結(jié)構(gòu)， 相比不添加還原性物質(zhì)而言，回收率提高。其中，適宜的培養(yǎng)基每lkg培養(yǎng)基含：Tryptone 20~50g、YeastExtract9~35g、氣化納4~12g、甘油12~50g、憐酸二氛鐘2~10g、 磷酸氫二鉀三水合物2~10g、氫氧化鈉2g。
[0022] 收集上清液，上樣于經(jīng)平衡液A平衡的疏水介質(zhì)層析柱中，PhenylSepharose 6FastFlow(lowsub)填料，經(jīng)平衡液A再平衡洗去未結(jié)合的蛋白，雜蛋白洗脫液B洗去疏 水性弱的蛋白，最后用目的蛋白洗脫液C洗脫目的蛋白，獲得含CNB組合物的目的蛋白。其 中，每lkg平衡液A含：TRIS1. 5~3. 5g，氯化鈉30~70g，氯化鈣0. 2~1. 0g，鹽酸1. 0~ 1. 5g。每lkg雜蛋白洗脫液B含：TRIS1. 5~3. 5g，氯化|丐0· 2~1. 0g，鹽酸1. 0~1. 5g。 每lkg目的蛋白洗脫液C含：TRISL5~3.5g，EGTA0.1~0.5g，鹽酸L0~L5g。
[0023] 本發(fā)明提供了一種制備rhCNB二聚體的方法，包括如下步驟：步驟1:制備獲得 rhCNB溶液；步驟2 :在pH值為6. 0~7. 0, 2~15°C的反應條件下，取所述rhCNB溶液與氧 化劑混合，氧化12~24h，終止氧化后，分離純化。
[0024] 本發(fā)明是在還原劑DTT的還原作用下，形成90%以上的單體，再采用特有的氧化 還原對使單體99%以上轉(zhuǎn)化為二聚體，同時通過濃度、溫度、時間有效控制多聚體的形成， 得到高含量二聚體的rhCNB。工藝路線為還原-氧化-還原終止氧化。
[0025] 1、初步純化的rhCNB溶液，含有90%以上的單體，本步驟選擇pH6. 0~7.0,溫度 2~15°C反應條件，分段加入低濃度氧化劑（0. 05 %~1 %過氧化氫溶液），使rhCNB單體緩 慢的向二聚體轉(zhuǎn)化，二聚體達到75%及以上、多聚體1%時，加入低濃度氧化終止液（0. 1% 亞硫酸氫鈉）中和氧化劑，避免繼續(xù)氧化使三聚體及以上聚體的形成。轉(zhuǎn)化的原理是rhCNB 單體含有游離的巰基，在氧化環(huán)境下，兩個游離的巰基形成一個二硫鍵，達到轉(zhuǎn)化為二聚體 的目的，同時考慮了緩沖液pH值、溫度對反應速度的影響。
[0026] 2、步驟2中含較高含量二聚體的CNB組合物，尚含有單體和少量三聚體，本步驟中 該CNB組合物上樣于經(jīng)平衡液平衡的分子排阻層析柱（含分子排阻填料），根據(jù)分子量大小 被緩沖液先后洗脫，獲得二聚體純度達98%以上，三聚體及以上聚體< 0. 5%。
[0027] 綜合上述實驗結(jié)果，本發(fā)明工藝終產(chǎn)品為rhCNB二聚體，工藝具有創(chuàng)新性且重復 性好，收集到的蛋白溶液經(jīng)純度檢測，二聚體含量在98%以上，多聚體含量小于0. 5%。
【附圖說明】
[0028] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0029] 圖1示實施例2氧化后蛋白組分比例結(jié)果；
[0030] 圖2示實施例2氧化后經(jīng)分子排阻色譜分離后蛋白組分比例結(jié)果；
[0031] 圖3示實施例3氧化后蛋白組分比例結(jié)果；
[0032] 圖4示實施例3氧化后經(jīng)分子排阻色譜分離后蛋白組分比例結(jié)果；
[0033] 圖5示實施例4氧化后蛋白組分比例結(jié)果；
[0034] 圖6示實施例4氧化后經(jīng)分子排阻色譜分離后蛋白組分比例結(jié)果；
[0035] 圖7示實施例5氧化后蛋白組分比例結(jié)果；
[0036] 圖8示實施例5氧化后經(jīng)分子排阻色譜分離后蛋白組分比例結(jié)果；
[0037] 圖9示實施例6氧化后蛋白組分比例結(jié)果；
[0038] 圖10示實施例6氧化后經(jīng)分子排阻色譜分離后蛋白組分比例結(jié)果；
[0039] 圖11示實施例7篩選試驗1蛋白組分比例結(jié)果；
[0040] 圖12示實施例7篩選試驗2氧化Oh蛋白組分比例結(jié)果；
[0041] 圖13示實施例7篩選試驗2氧化5h蛋白組分比例結(jié)果；
[0042] 圖14示實施例7篩選試驗2氧化9h蛋白組分比例結(jié)果；
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