一種固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)血脂康膠囊中的桔霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種固相萃取?液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)血脂康膠囊中的桔霉素的方法，旨在提供一種靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確的固相萃取?液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)血脂康膠囊中的桔霉素的方法；該方法依次包括下述步驟：1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備2)樣品前處理；3)樣品凈化；將上述樣品前處理液，以1ml/min流速通過(guò)C18固相萃取小柱，用5ml水淋洗，棄去，再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40℃下氮吹至近干，精密加入1ml甲醇溶解，用0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，即得待測(cè)樣品上色譜柱檢測(cè)；屬于化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】
一種固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)血脂康膠囊中的桔霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明桔霉素的檢測(cè)方法，具體的說(shuō)是一種固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)血脂康膠囊 中的桔霉素的方法;屬于化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 桔霉素(citrinin)是1931年首次從青霉菌Penicillium citrinum中分離得到。其 分子式為C13H14O5，分子量為250.25。桔霉素有一定的腎毒性和肝毒性，能致畸、引發(fā)腫瘤及 誘發(fā)突變。而紅曲是中國(guó)傳統(tǒng)藥材，是用特有的紅曲霉菌在大米中培養(yǎng)發(fā)酵而成。因某些紅 曲霉菌株能產(chǎn)生具有抑制膽固醇生物合成的他汀類物質(zhì)，因而中藥紅曲被開發(fā)為降血脂的 血脂康膠囊和保健食品。在1995年法國(guó)學(xué)者Blanc等首次發(fā)現(xiàn)了紅曲產(chǎn)品中含有桔霉素后， 國(guó)外已將桔霉素作為食品污染的嚴(yán)格控制指標(biāo)。而在中國(guó)，中國(guó)藥典尚未將桔霉素作為含 紅曲中成藥的控制指標(biāo)。
[0003] 對(duì)于血脂康膠囊一一血脂康膠囊有文獻(xiàn)記載用RP-HPLC法測(cè)定其桔霉素含量，而 在食品、保健食品中也有桔霉素的檢測(cè)方法:薄層層析法、熒光分光光度法、高效液相色譜 法等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述不足，本發(fā)明的目的是靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確的固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢 測(cè)血脂康膠囊中的桔霉素的方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
[0006] -種固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)血脂康膠囊中的桔霉素的方法，依次包括下述步驟：
[0007] 1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
[0008] 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:精密稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并至刻度，使 成濃度為lmg/ml;
[0009] 標(biāo)準(zhǔn)稀釋液:精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2ml，置100ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度， 使成濃度為2μg/mll;
[0010] 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：取標(biāo)準(zhǔn)稀釋液液適量加甲醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、10、 20ng/ml標(biāo)準(zhǔn)工作液；
[0011] 2)樣品前處理
[0012] 膠囊劑取內(nèi)容物〇. 5g，置10ml錐形瓶中，加3ml 1 %甲酸-甲醇溶液，在250W，45°C 超聲波提取30min，冷卻，過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過(guò)濾，待 用；
[0013] 3)樣品凈化
[0014] 分別以3ml甲醇和3ml水活化HLB固相萃取將上述樣品前處理液，以lml/min流速通 過(guò)C18固相萃取小柱，用5ml水淋洗，棄去，再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮 吹至近干，精密加入lml甲醇溶解，用0.22μπι有機(jī)濾膜過(guò)濾，即得待測(cè)樣品；
[0015] 將上述樣品前處理液，以lml/min流速通過(guò)C18固相萃取小柱，用5ml水淋洗，棄去， 再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮吹至近干，精密加入lml甲醇溶解，用0.22 μπι有機(jī)濾膜過(guò)濾，即得待測(cè)樣品；
[0016] 4)液相色譜與質(zhì)譜條件
[0017] 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱2· 1 X50mm，1 ·8μηι;流動(dòng)相Α為0· 1 % 甲 酸，流動(dòng)相B為乙腈，采用梯度洗脫程序如下：0-4.01^114、70-10%，8、30-90%;4.0-5.5min，A、10%，B、90% ;5.5.-5.6min，A、70%，B、30% ;流速0.3ml/min;柱溫40°C;進(jìn)樣量2 μL;電噴霧源ESI，正離子方式，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM，載氣溫度：150°C，載氣流量：15L/min， 霧化器壓力40psi，鞘氣溫度350 °C，鞘氣流量：12L/min，毛細(xì)管電壓3500V，定性定量離子： 母離子m/z = 251.2，子離子m/z233.2和m/z205.2，碰撞能量分別為5V和20V，F(xiàn)rag均為380V。
[0018] 進(jìn)一步的，上述的一種固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)血脂康膠囊中的桔霉素的方法，所 述的色譜儀采用Agilentl290-6490三重四級(jí)桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀。
[0019] 本文采用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)中成藥中的桔霉素，為中成藥檢測(cè) 桔霉素具凈化效率高、分辨率高、噪聲低、靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確、可靠等特點(diǎn)的參考方 法。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1是2μg/ml桔霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖。
[0021]圖2是空白樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì) 本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的 權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 1 材料
[0025] 1.1儀器
[0026] Agilentl290-6490三重四級(jí)桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent)、HLB-SPE柱（60mg/ 3ml，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus(2.1X50mm，1.8ym;美 國(guó)Agi 1 ent)、XA20OTU電子天平(德國(guó)梅特勒托利多公司）、超聲波清洗器。
[0027] 1.2血脂康膠囊與試劑
[0028]血脂康膠囊3批，均來(lái)源于市場(chǎng)銷售樣品。
[0029] 桔霉素（批號(hào)：518-75-2-150403,標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Pribolab，純度>98%)，甲醇和乙腈 均為色譜純，其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)ELGA PURELAB ClassicUVF凈化系統(tǒng)過(guò)濾 的去離子水。
[0030] 本發(fā)明所涉及到的百分濃度，沒(méi)有特別說(shuō)明的，液體均為體積濃度，溶質(zhì)為固體的 指質(zhì)量濃度。
[0031] 2方法與結(jié)果
[0032] 2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
[0033] 2.1.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:精密稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并至刻 度，使成濃度為lmg/ml。
[0034] 2.1.2標(biāo)準(zhǔn)稀釋液:精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2ml，置100ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至 刻度，使成濃度為2μg/ml，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)見(jiàn)圖1。
[0035] 2.1.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：取標(biāo)準(zhǔn)稀釋液液適量加甲醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、 10、20ng/ml標(biāo)準(zhǔn)工作液。
[0036] 2.2樣品前處理
[0037] 膠囊劑取內(nèi)容物0.5g，置10ml錐形瓶中，加3ml 1 %甲酸-甲醇溶液，在250W，45 °C 超聲波提取30min，冷卻，過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過(guò)濾，待 用。
[0038] 2.3樣品凈化
[0039]將上述樣品前處理液，以約lml/min流速通過(guò)C18固相萃取小柱(使用前分別以3ml 甲醇和3ml水活化），用5ml水淋洗，棄去，再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮 吹至近干，精密加入lml甲醇溶解，用0.22μπι有機(jī)濾膜過(guò)濾，即得待測(cè)樣品。
[0040] 2.4液相色譜與質(zhì)譜條件
[0041] 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱（2 · 1 X 50mm，1 · 8μηι);流動(dòng)相Α為0 · 1 % 甲酸，流動(dòng)相B為乙腈，采用梯度洗脫程序，見(jiàn)表1。流速0.3ml/min;柱溫40°C ;進(jìn)樣量2μ1;電 噴霧源(ESI)，正離子方式，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，載氣溫度：150°C，載氣流量：15L/min，霧 化器壓力40psi，鞘氣溫度350°C，鞘氣流量：12L/min，毛細(xì)管電壓3500V，定性定量離子:母 離子m/z = 251.2(M+1)，子離子m/z233.2和m/z 205.2，碰撞能量分別為5V和20V，F(xiàn)rag均為 380V〇
[0042] 表1梯度洗脫程序
[0043] Tab 1Gradient elution program
[0045] 2.5實(shí)際樣品的測(cè)定
[0046] 在本試驗(yàn)中，以定量離子峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)系列的回歸方程計(jì)算，結(jié)果血脂康膠囊3 批，均未檢出桔霉素。
[0047] 2.4方法的準(zhǔn)確度
[0048]在經(jīng)測(cè)定不含有桔霉素的二種基質(zhì)的空白樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，加標(biāo)濃度 為0.01ng/ml。平行測(cè)定6次，得到的平均加標(biāo)回收率液體制劑范圍為95%~105%，參見(jiàn)圖 2〇
[0049]本發(fā)明提供的技術(shù)方案用水(含0.1%甲酸)+乙腈= 70+30作流動(dòng)相，流速0.3ml/ min，桔霉素的色譜峰對(duì)稱，采用串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，由于串聯(lián)質(zhì)譜具有在分離、高分 辨能力和靈敏度高的特性，配合多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)及母離子和兩個(gè)相應(yīng)的子離子進(jìn)行 監(jiān)測(cè)，達(dá)到了準(zhǔn)確的定性和定量的目的，簡(jiǎn)化了對(duì)流動(dòng)相選擇的步驟，所以本方法選用了上 述流動(dòng)相及其比例。
[0050] 為了解本方法采用C18固相萃取小柱對(duì)樣品中的桔霉素進(jìn)行凈化后，在測(cè)定時(shí)對(duì) 質(zhì)譜檢測(cè)的基質(zhì)干擾情況，選擇一個(gè)未檢出桔霉素的樣品按方法進(jìn)行萃取作基質(zhì)液，并加 入標(biāo)準(zhǔn)系列，同時(shí)對(duì)外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定，根據(jù)保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的定量離子峰面積與 其濃度進(jìn)行回歸分析，得基質(zhì)液加標(biāo)準(zhǔn)系列的回歸方程為Y = 3 298.522531X+4 528.423 351，r = 0.999 4,與外標(biāo)回歸方程Υ = 3 329.186799Χ+4 586.551 631(r = 0.999 4)進(jìn)行比 較，兩者無(wú)實(shí)質(zhì)性差異，表明C18固相萃取小柱對(duì)樣品基質(zhì)有明顯凈化作用。
[0051] 本文建立了含紅曲血脂康膠囊的桔霉素液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，本方法在6min 內(nèi)完成了對(duì)該物質(zhì)的分析測(cè)定，在保證定性定量準(zhǔn)確的情況下，實(shí)現(xiàn)了高靈敏的分析，并在 提取過(guò)程中減少了甲苯等有毒試劑的使用，具有高效、環(huán)保等特點(diǎn)，可為血脂康膠囊中的桔 霉素監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)血脂康膠囊中的桔霉素的方法，其特征在于，依次包括 下述步驟： 1) 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:精密稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)l〇mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并至刻度，使成濃 度為lmg/ml; 標(biāo)準(zhǔn)稀釋液:精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液〇.2ml，置100ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，使成 濃度為2μg/mll; 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：取標(biāo)準(zhǔn)稀釋液液適量加甲醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、10、20ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)工作液； 2) 樣品前處理 膠囊劑取內(nèi)容物〇. 5g，置10ml錐形瓶中，加3ml 1 %甲酸-甲醇溶液，在250W，45°C超聲 波提取30min，冷卻，過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過(guò)濾，待用； 3) 樣品凈化 分別以3ml甲醇和3ml水活化HLB固相萃取將上述樣品前處理液，以lml/min流速通過(guò) C18固相萃取小柱，用5ml水淋洗，棄去，再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮吹 至近干，精密加入lml甲醇溶解，用0.22μπι有機(jī)濾膜過(guò)濾，即得待測(cè)樣品； 4) 液相色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱2.1X50mm，1.8ym;流動(dòng)相Α為0.1% 甲酸，流 動(dòng)相B為乙腈，采用梯度洗脫程序如下：0-4.0min，A、70-10%，B、30-90% ;4.0-5.5min，A、 10%，8、90%;5.5.-5.611^114、70%，8、30%;流速0.31111/1^11 ;柱溫40°(：;進(jìn)樣量2以1;電噴霧 源ESI，正離子方式，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM，載氣溫度：150 °C，載氣流量：15L/min，霧化器壓力 40psi，鞘氣溫度350°C，鞘氣流量：12L/min，毛細(xì)管電壓3500V，定性定量離子:母離子m/z = 251.2，子離子m/z233.2和m/z205.2，碰撞能量分別為5V和20V，F(xiàn)rag均為380V。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相萃取-液質(zhì)串聯(lián)檢測(cè)血脂康膠囊中的桔霉素的方法， 其特征在于，所述的色譜儀采用Agilentl290-6490三重四級(jí)桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK105866307SQ201610234922
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月15日
【發(fā)明人】陳學(xué)松, 羅達(dá)龍, 王 華
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗(yàn)所