專利名稱：一種多肽類促感染試劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有促進HIV感染能力的多肽，多肽序列衍生于HIV包膜蛋白GP41的近膜外區(qū)MPER。
背景技術：
目前基因治療中目的基因的轉移工具分為病毒載體和非病毒載體兩大類，以病毒載體如逆轉錄病毒和腺病毒為基礎的載體系統(tǒng)最為常用。逆轉錄病毒載體優(yōu)點是轉染范圍廣，轉入的外源基因可整合入宿主細胞基因組；缺點是只能整合至分裂期細胞；可插入外源基因片段小，難以滿足較大基因的插入；有產(chǎn)生野生型病毒或輔助型病毒的可能，隨機整合可能產(chǎn)生不良作用。而慢病毒載體的出現(xiàn)改善了這些問題。慢病毒載體源于逆轉錄病毒，以HIV-1病毒為基礎，去除了毒性基因，用VSV-G包膜蛋白替換HIV-1的包膜蛋白。優(yōu)點是宿主范圍更廣，更安全，和持久性表達。可整合至分裂期和非分裂期細胞，可插入外源片段長至5kb。因此慢病毒載體在RNA1、細胞核動物模型建立以及基因治療等領域有著非常廣泛的應用。但是，無論是逆轉錄病毒載體還是慢病毒載體系統(tǒng)，都面臨一個病毒包裝滴度低和感染效率差的問題。

發(fā)明內容
為了解決現(xiàn)有技術中逆轉錄病毒載體系統(tǒng)和慢病毒載體系統(tǒng)的感染效率低的問題，本發(fā)明提供了一種促進病毒感染的試劑，包括一條多肽序列，所述多肽序列為帶包膜病毒的跨膜蛋白近膜外區(qū)的衍生多肽序列?？缒さ鞍椎慕ね鈪^(qū)(membrane proximalextracellular region, MPER) 一般富集疏水性氨基酸,能與膜結構的脂雙層結合,表現(xiàn)出膜擾亂活性(membrane perturbing property)。HIV-1包膜蛋白Gp41的MPER區(qū)能夠插入到病毒膜外的界面區(qū)域 ，破壞病毒包膜的高度穩(wěn)定性，以利細胞和病毒的膜脂重建和融合孔的形成。刪除HIV的MPER區(qū)會造成融合過程的停滯。因此MPER區(qū)對于HIV病毒融合和感染能力的發(fā)揮具有極其重要的作用。基于此，我們推測MPER衍生的合成多肽也應該對HIV的感染有影響，并通過實驗證實了此類多肽可以促進帶包膜病毒的感染效力。本發(fā)明中，優(yōu)選HIV-1跨膜蛋白Gp41的MPER區(qū)的衍生肽作為促感染試劑。在一個實施方式中，本發(fā)明所述多肽序列可在Gp41的MPER天然序列基礎上進一步增加堿性氨基酸。所述堿性氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸的一種或幾種。增加的堿性氨基酸數(shù)目可以為一個或多個。在一個實施方式中，上述多肽序列也可通過氨基酸單點或多點突變改造，以增強其促感染活性。在一個實施方式中，可以通過調節(jié)緩沖液pH值和離子強度，提高上述多肽的促感染活性。本發(fā)明的多肽類促感染試劑具有顯著的促帶包膜病毒的感染活性，因此對于逆轉錄病毒或慢病毒基因療法的發(fā)展具有重要作用。


圖1MPER、NK13和QW13的促感染活性的比較。在96板內，多肽梯度稀釋后，與HIV-1假病毒ZM214M.PL15孵育lh，加入TZM_bl (I X IO5)細胞懸浮感染。感染過程無血清，感染4h后補10%血清。感染48h后，檢測Iuciferase表達量。Enhancement (n-fold)=樣品值/病毒對照值。病毒終濃度(P24含量)為3.2ng/mL;圖示多肽濃度指加入細胞后的終濃度。圖2NK16和NK13的促感染活性的比較。在96板內，多肽梯度稀釋后，與HIV-1假病毒ZM214M.PL15孵育lh，加入TZM-bl(lX105)細胞懸浮感染。感染過程無血清，感染4h后補10%血清。感染48h后，檢測Iuciferase表達量。Enhancement (n-fold)=樣品值/病毒對照值。病毒終濃度(P24含量)為3.2ng/mL;圖示多肽濃度指加入細胞后的終濃度。圖3NK16與DEAE葡聚糖的促感染活性在不同感染時間上的比較。NK16誘導的促感染能力比DEAE更快更強。感染過程無血清，感染4h后補10%血清。NK16的終濃度是60u g/mL, DEAE葡聚糖的終濃度是16 μ g/mL。48h后檢測Iuciferase活性。圖4Hela細胞被FIV/VSV-G感染后的GFP熒光流式分析。FIV/VSV-G在NK16作用下，感染Hela細胞水平提高。FIV/VSV-G重組病毒在有無NK16共孵育的條件下感染貼壁的Hela細胞，感染過程無血清，感染4h后洗細胞，換完全培養(yǎng)基。2天后用流式細胞儀檢測GFP的表達水平。圖5NK16在不同離子強度條件下的促`感染活性。NK16與HIV-1假病毒ZM214M.PL15預孵育的磷酸緩沖液離子強度分別為0、0.1和0.5M(pH 7.68)。DMEM是指用無血清的DMEM作為稀釋緩沖液。感染過程無血清，感染4h后補10%血清。NK16的終濃度為60 μ g/mL。緩沖液離子強度越低，NK16的促感染能力越強。圖6NK16在不同pH條件下的促感染活性。NK16與HIV-1假病毒ZM214M.PL15預孵育的磷酸緩沖液pH值分別為6.35、7和7.68M(0.1M)。感染過程無血清，感染4h后補10%血清。NK16的終濃度為60 μ g/mL。pH值越低，NK16的促感染能力越強。圖7NK16和NK16-D的促感染活性的比較。在96板內，多肽梯度稀釋后，與HIV-1假病毒ZM214M.PL15孵育lh，加入TZM_bl (I X IO5)細胞懸浮感染。感染過程無血清，感染4h后補10%血清。感染48h后，檢測Iuciferase表達量。Enhancement (n-fold)=樣品值/病毒對照值。病毒終濃度(P24含量)為3.2ng/mL;圖示多肽濃度指加入細胞后的終濃度。
具體實施例方式高度保守的HIV-lgp41近膜外區(qū)(MPER)對HIV-1與宿主細胞的融合過程具有重要作用。實驗證實了 MPER的C端區(qū)域NWFDITNWLWYIK(SEQ ID NO:1)的合成肽具有促進帶包膜病毒和宿主細胞的吸附，從而增加病毒感染效率的作用。下文中結合具體實施例說明了本發(fā)明的優(yōu)勢和技術效果。本發(fā)明的保護范圍以權利要求書限定的為準，實施例僅是示例性地說明本發(fā)明的理念和原則。實施例1多肽的設計
表I
權利要求
1.一種有促感染活性的多肽，包括一種肽序列，所述肽序列包括HIV-ι的包膜蛋白Gp41的MPER區(qū)的C端序列(SEQ ID NO:1)及其截短序列。
2.如權利要求1所述的有促感染活性的多肽，進一步包括一種多肽修飾，所述多肽修飾為增加一種或幾種堿性氨基酸。所述堿性氨基酸包括賴氨酸，精氨酸和組氨酸。所述堿性氨基酸可以數(shù)目可以是I個或多個。
3.如權利要求1-2任一項所述的有促感染活性的多肽，進一步包括通過氨基酸單點或多點突變改造，以增強其促感染活性。
4.如權利要求1-3任一項所述的有促感染活性的多肽，進一步包括搭配合適的離子條件和PH值以提高促感染活性。
5.如權利要求1-3任一項所述的有促感染活性的多肽，除HIV-1外，進一步包括適用于其他有包膜的病毒。所述病毒為天然存在的病毒或重組病毒。
6.如權利要求1-3任一項所述的有促感染活性的多肽，包括其在組織和活體的基因治療方面研究中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有促進HIV感染能力的多肽。該促HIV感染多肽包括一種肽序列，該肽序列中包括HIV-1包膜蛋白GP41的近膜外區(qū)MPER區(qū)C端多肽。本發(fā)明的多肽類促感染試劑具有顯著的促包膜病毒感染的活性，在細胞水平上表現(xiàn)出優(yōu)于常用促感染試劑DEAE等的活性，因此對于逆轉錄病毒或慢病毒基因療法的發(fā)展具有重要作用。
文檔編號C07K7/08GK103145802SQ20121033680
公開日2013年6月12日 申請日期2012年9月13日 優(yōu)先權日2012年9月13日
發(fā)明者單亞明, 孔維, 張麗雙 申請人:吉林大學